Krooninen sairaus

tiivistelmä

MicroRNA-30c (miR-30c) on raportoitu olevan tuumorisuppressori kohdun limakalvon syöpä (EY). Osoitamme, että miR-30c on säädellä vähentävästi EY kudoksessa ja on erittäin ilmaistaan ​​estrogeenireseptorin (ER) -negatiivinen HEC-1-B-solujen. MiR-30c suoraan estää MTA-1 ilmentymisen ja toimii tuumorisuppressorina kautta miR-30c-MTA-1 signalointireitin. Lisäksi miR-30c on vähentynyt, kun E

2 kohtelu sekä ER-positiivisia Ishikawa ja ER-negatiiviset HEC-1-B-solujen. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että miR-30c on tärkeä vapautettiin miRNA EY: n ja voivat toimia mahdollisena biomarkkereiden ja uusia terapeuttisia kohde EY.

Citation: Kong X, Xu X, Yan Y, Guo F Li J, Hu Y, et ai. (2014) Estrogeeni Säätelee Tumour vaimennin miRNA-30c ja sen Target Gene, MTA-1, in kohdun limakalvon syöpä. PLoS ONE 9 (3): e90810. doi: 10,1371 /journal.pone.0090810

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 elokuu 2013; Hyväksytty 4 helmikuuta 2014; Julkaistu: 03 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Kong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Six Talent Summit Project Jiangsun maakunnassa henkilöstön toimisto (WSW-021). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä (EY) on yleisin pahanlaatuinen kasvain naisten sukuelinten maailmanlaajuisesti. Kohdun limakalvon syöpä käsittää kaksi erilaista patogeneettisiin alatyyppiä. Tyypin I kasvaimet ovat matala-asteinen estrogeeni liittyviä endomet- syöpiä (ETY), jotka yleensä kehittyä monimutkainen ja epätyypillinen endometriumin hyperplasia peri vaihdevuodet ohittaneilla naisilla. Sitä vastoin tyypin II kasvaimet ovat aggressiivisia kuin endomet- syöpien (NEEC), jotka eivät liity estrogeenihoito ja kehittyä atrofioituneen endometrium ikääntyneiden naisten. Erot kahden EY alatyypeistä johtaa erilaiseen hoitoon ja ennusteet [1].

tärkeys MikroRNA (miRNA), yksi tyyppi koodaamattoman RNA, on osoitettu syöpää. Geenit, jotka koodaavat nisäkkään miRNA alun perin transkriboitu ensisijaisena miRNA (pri-miRNA), joita käsitellään entsymaattisella kompleksit Drosha ja Dicer tulla esiaste miRNA (pre-miRNA) ja kypsä miRNA [2]. Kypsä miRNA ovat noin 22 nukleotidin mittainen, yksijuosteisia RNA-molekyylejä, jotka säätelevät ilmentymistä niiden kohde-geenien epätarkkoja komplementaation 3′-transloimattomat alueet (UTR: t), 5′-UTR, ja jopa koodaussekvenssit mRNA: iden tukahduttaa käännös eläimillä [2] – [5]. Estrogeeni (E

2) ja estrogeenireseptori (ER) on osoitettu moduloivan miRNA kuten miR-125a [6] ja miR-429 [7] hiiren kohtu, miRNA-20a ja miRNA-21 normaalissa kohdun limakalvon rauhas epiteelisolujen [8], Anna-7 perhe, miR-27a, miR320 ja miR-424 [9] EY: n soluissa, miR-104 [10], miR-7 [11], miR-21 [12], miR -30C ja miR-103 [13] rintasyöpäsoluissa, miR-135b peräsuolen soluissa [14] ja miR-203 sileän lihaksen soluissa [15]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että E

2 ja ER tärkeä asema miRNA asetuksessa.

Äskettäin vapauttamiseen miR-30c on raportoitu paitsi olla merkitystä kasvaimien syntyyn ja etenemiseen monien syöpien, kuten EY [16], [17], munasarjasyöpä [18], [19], rintasyövän [20] – [23], keuhkosyöpä [24], kirkas cell munuaissolukarsinooma [25], mahasyöpä [26], virtsarakon syöpä [27] ja neuroblastooma [28], mutta myös niillä on mahdollisia ja ennustavia vaikutuksia, sekä muodostavat potentiaalisen terapeuttisen tavoitteen kemo- ja sädehoidot syöpien [18], [29], [ ,,,0],30]. Tällä hetkellä, etäpesäkkeiden liittyvä geeni-1 (MTA-1) [17], KRAS [20], DLL4 [31], TWF1, vimentiinistä [21], BCL9 [19], REDD1 [32], PAI-1 [33] ja CTGF [34] on identifioitu ja miR-30c, ja SERPINE1 [28], NYH11, GPRASP2 DDR2 [16], PPARGC1B, Makorin-3, UBAC1, PTPDC1 [22] snail1 [35], p53 [36] ovat mahdollisia kohteita, jotka on vielä vahvistettava. Koska miR-30c osoittaa suhteellinen lasku ilmaisun normaalista kohdun limakalvon ja epätyypillinen hyperplasia syöpään, ja siksi rooli miR-30c EY: n on edelleen tuntematon, teimme tutkimuksen roolin miR-30c EY. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-30c tavoitteet MTA-1, joka on erittäin ilmaistaan ​​EY [37] ja toimii tuumorisuppressori EY solulinjoissa [17]. Kuitenkin tarkka roolit miR-30c ja MTA-1 EY ovat epäselviä. Siksi teimme tämä laajennettu tutkimuksessa.

Tässä tutkimuksessa arvioimme ilmaus miR-30c EY: n kudoksiin ja EY: n eri solulinjoissa, tutki tarkemmin suhdetta miR-30c ja MTA-1, validoitu tuumorisuppressori funktio miR-30c ja tutkitaan sääntelyä miR-30c EY: n solulinjoissa. Niinpä pyrimme määrittämään tuumorisuppressiogeeneksi funktio miR-30c, jossa määritellään mahdollinen hyöty uutena terapeuttisena kohteena hoitoon EY.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja kudosten näytteiden

Tämä hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Nanjingin rumputorni Hospital Affiliated Nanjing University. Tutkimushenkilöt rekrytoitiin potilaiden osastolla Naistenklinikka, Nanjingin rumputorni sairaala, Nanjing University Medical School Nanjingissa Kiinassa. Kirjallinen suostumus saatiin kaikki osallistujat mukana tutkimuksessa. Kaikki näytteet otettiin potilaiden tietoisen suostumuksen ja vahvistanut patologinen tutkimus. Kaikki potilaat kärsivät tyypin I EY ja mikään niistä sai leikkausta edeltävän hoidon, kuten sädehoidon tai kemoterapian. 21 ensisijainen EY kasvain kudosnäytteitä saatiin n potilaista, ja 14 normaalin kohdun limakalvon otettiin kudosnäytteet naisilta, joille tehtiin hysterectomies (laparoskooppista tai vatsan) ja hoidettaessa muita sairauksia, kuten myoma tai kohdun laskeuman.

EY solulinjojen ja hoitoja

Ihmisen EY Ishikawa solut ystävällisesti professori LHWei (Pekingin yliopiston Kiinan Hospital, Kiina), ja HEC-1-B ostettiin Shanghai Cell Collection (Shanghai, Kiina). Ishikawa-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Gibco, USA), ja HEC-1-B-soluja viljeltiin McCoyn 5A-Medium (Gibco, USA), jotka molemmat oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ( FBS, Gibco). Soluja pidettiin 5% CO

2 kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa. Voit selvittää sääntely E

2, soluja käsiteltiin 17β-estradioli (E

2, 10

-8 M ja 10

-10 M, Sigma, USA) 6, 12, 24 ja 48 h 6-kuoppaisille levyille. Ishikawa ja HEC-1-B-soluja samanaikaisesti hoidettiin ER antagonisti Fulvestrantin (ICI 182780, 10

-8 M, Sigma, USA) ja 10

-8 M tai 10

-10 ME

2 24 ja 48 h.

Solun transfektio

matkii (miR10000244) ja estäjä (miR20000244) Mir-30c, Sirna MTA-1 (Si- MTA-1, si-h-MTA1_001) ja niiden ryntäily oligonukleotidien, jäljittelee-sc (miR01101), estäjä-sc (miR02101), Sir-sc (siN05815122147), suunniteltiin ja syntetisoitiin Guangzhou RiboBio (Guangzhou, Kiina). Kaikki oligonukleotidit transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine

TM 2000 (Invitrogen, USA) antibiootti-free Opti-MEM-alustassa (Invitrogen, USA) valmistajan protokollan loppukonsentraatioon 50 nM. Sillä cotransfections, 25 nM kutakin oligonukleotidia käytettiin. Kokonais-RNA ja proteiinit uutettiin 48 h transfektion jälkeen tarkempaa analysointia varten. Non-transfektoidut Ishikawa solujen viljelyalustassa oli myös valmiita palvelemaan mock valvontaa.

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) B

Yhteensä RNA kudosten ja solujen uutettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen, USA). Varsi-silmukka RT pohjamaali miR-30c, alukkeet miR-30c, U6 ja MTA-1 qRT-PCR kuvattiin edellisessä tutkimuksessa [17]. GAPDH, pri-miR-30c, ja pre-miR-30c alukkeet suunniteltiin seuraavasti: GAPDH eteenpäin aluke: TGAACGGGAAGCTCACTGG, GAPDH käänteisaluketta: TCCACCACCCTGTTGCTGTA; pri-miR-30c eteenpäin pohjamaali: GCCCAAGTGGTTCTGTGTTT, pre-miR-30c eteenpäin pohjamaali: ACCATGCTGTAGTGTGTGTAAACA, ja pri-miR-30c /pre-miR-30c käänteisaluketta: TCCATGGCAGAAGGAGTAAA. cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: n käänteistranskriptiolla käyttäen PrimeScript ™ RT-reagenssia (Takara, Dalian, Kiina). Seuraavaksi qRT-PCR suoritettiin käyttäen SYBR PrimeScript ™ RT-PCR: llä (Takara, Dalian, Kiina) mukaan valmistajan protokollaa. Suhteellinen ekspressiotasot miR-30c ja MTA-1 määritettiin käyttäen 2

-ΔΔCt analyysimenetelmä; tasot GAPDH ja U6 käytettiin sisäisen valvonnan MTA-1 ja miR-30c, pri-miR-30c, pre-miR-30c.

Western Blot

Solut kerättiin ja hajotettiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA) lyysipuskuria (Sigma, USA), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Proteiinikonsentraatiot koko solulysaatit mitattiin käyttäen Micro BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, USA). Yhtä suuri määrä (50 pg) kustakin solulysaatti erotettiin elektroforeesilla 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä (SDS-PAGE) ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) (Millipore, Billerica, MA), joka estettiin TBST: ssä, jossa 10% rasvatonta, kuivattua maitoa. Kalvot tutkittiin primäärisen vasta-aineen MTA-1 (1:500, Abcam, Cambridge, UK) ja toisen (HRP) konjugoidun vasta-aineen (1:5000, Bioworld Technology, USA). Kiinnostuksen kohteena olevia proteiineja sitten havaita käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- (ECL) blotting havaitsemisjärjestelmä (Millipore, Billerica, MA). GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Suhteellinen intensiteetti kohde nauhojen analysoitiin Määrä Yksi.

Soluproliferaatiomääritys

Soluproliferaatio analysoitiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT). Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (5 x 10

3 solua /kuoppa) suoraan tai 24 h transfektion jälkeen ja inkuboitiin 24, 48, 72 ja 96 h, vastaavasti. Inkubaation jälkeen 25 ui MTT: tä (5 mg /ml, Sigma, USA) 37 ° C: ssa 4 tuntia, supernatantit poistettiin, ja 150 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO, Sigma, USA), lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssiarvo (OD) kustakin kuopasta mitattiin 490 nm: ssä. Jokaisen koetilalle, 6 kaivoja käytettiin, ja koe suoritettiin kolmena kappaleena.

Solun maahanmuutto- ja invaasiomääritys

Solun muuttoliikettä mitattiin käyttämällä haavan paranemista määrityksessä. Transfektoidut solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja viljeltiin konfluenssiin. Haavat tehtiin käyttäen p10-pipetin kärki, ja solut pestiin PBS: llä poistaa roskat ja irrottaa solut. Sitten soluja inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa vielä 24 tai 48 h. Yksittäiset aukot havaittiin ja valokuvattiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia 0, 24 ja 48 tuntia samassa asennossa haavan.

Cell invasion määritykset suoritettiin 24-kuoppaisilla, Matrigel-päällystetty hyökkäystä kammioita. 48 h transfektion jälkeen, 2 x 10

4 solut 0,2 ml: ssa seerumitonta DMEM lisättiin yläkammioiden (8 um, Millipore), jotka oli päällystetty 30 ul: matrigeeliä (BD Bioscience, San Jose , CA), ja 0,6 ml 10% FBS-DMEM lisättiin kemoatrak- alempaan kammioon. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen ei-tunkeutuvat solut poistettiin vanutupoilla. Tunkeutuvat solut värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Solut laskettiin 5 random suuritehoisia kentät × 200 suurennus kuoppaa kohti. Koe suoritettiin kolmena kappaleena.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 19.0 ohjelmistolla (SPSS, Chicago, USA). Arvot esitetään keskiarvoina ± SD. Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan arvot testin ja kontrollinäytteestä. Erot hoitoryhmien välillä tutkittiin tilastollisen merkitsevyyden käyttämällä yksisuuntaista ANOVA. Tilastollinen merkitsevyystaso nimettiin P 0,05.

Tulokset

Expression of MiR-30c ja MTA-1 EY: n näytteitä ja solulinjoissa

MiR-30c on raportoitu näytteille suhteellisen väheni ilmaisu normaalista kohdun limakalvon ja epätyypillinen hyperplasia syöpään [16] ja toimia tuumorisuppressori EY solulinjoissa [17]. Ei kuitenkaan muut tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-30c on merkitystä EY. Siksi me ensin tutkineet suhteellinen ilmentyminen miR-30c joukossa kudosnäytteet tässä tutkimuksessa. Meidän qRT-PCR-analyysit osoittivat, että miR-30c on merkittävästi vähentynyt EY näytteissä (kuvio 1A.) Viittaa siihen, että miR-30c on rooli ilmaantuvuudessa EY.

(A). MiR-30c aleni 21 EY näytteissä verrattuna 14 NE näytteitä, kuten on osoitettu qRT-PCR-analyysillä. Jokainen näyte arvioitiin kolmena kappaleena. (B). MiR-30c on erittäin ilmaistu HEC-1-B-soluja verrattuna Ishikawa-soluja, kuten on osoitettu qRT-PCR-analyysillä. (C) ja (D). Ekspressio MTA-1 aleni HEC-1-B-soluja verrattuna Ishikawa solujen mRNA: sta (C) ja proteiini (D) tasot. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (* P 0,05, ** P 0,01).

vieressä arvioitiin ilmentymistä miR-30c eri solulinjoissa. ER-positiivisia Ishikawa-soluja ja ER-negatiiviset HEC-1-B-solujen osuus malleja tyypin I ja tyypin II EY, vastaavasti. Meidän qRT-PCR-analyysi paljasti, että miR-30c ilmentyy voimakkaasti HEC-1-B-soluja verrattuna Ishikawa-soluja, joita 1,79-kertaisesti (kuvio 1 B)., Mikä viittaa siihen, että ekspression miR-30c korreloi ER tai E

2. Seuraavaksi arvioidaan tasot MTA-1 ilmentymisen eri solulinjoissa ja totesi, että se on erittäin ilmaistaan ​​Ishikawa-soluissa sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoja (kuvio 1C ja 1D). Yhdessä tuloksemme osoittavat negatiivista korrelaatiota miR-30c ja MTA-1, yhdenmukaisia ​​aiempien tulokseen, että miR-30c tavoitteet MTA-1.

vaihtelu miR-30c ilmentyminen moduloi ilmaus kohteeseensa geeni, MTA-1, EY: n soluissa

aiemmin osoitettu, että miR-30c tavoitteet MTA-1-mRNA-transkriptien Ishikawa ja HEC-1-B-solulinjoissa käyttämällä lusiferaasireporttiterilla määritys. Perusteellisesti selventämiseksi suhde miR-30c ja MTA-1, käytimme miR-30c-jäljittelee ja miR-30c-estäjä palauttaa ja vähentää ilmentymistä miR-30c, vastaavasti. Lisäksi käytimme SIR-MTA-1 pudotus MTA-1 Ishikawassa soluissa.

ilmentyminen miR-30c Ishikawa soluissa oli ajan säätelee 23.14-kertaiseksi ja alas-säätelee 0,043-kertainen transfektiolla miR-30c-matkii ja miR-30c-estäjän (kuvio 2A). Kun riittävä transfektion tehokkuus, huomasimme, että MTA-1-ilmentyminen väheni merkittävästi, kun miR-30c palautui ja että vähentäminen miR-30c sääteli MTA-1 ilmentymisen (kuvio 2B).

(A) . Transfektiotehokkuus Ishikawa-soluja arvioitiin qRT-PCR: llä 48 h transfektion jälkeen miR-30c-jäljittelee ja miR-30c-estäjä, joka on esitetty taitettava muutoksia suhteessa niiden sekoitetun sekvenssin sisältävillä verrokeilla. (B). MTA-1-proteiinin ilmentymistä arvioitiin Western blot -analyysillä 48 h transfektion jälkeen miR-30c-jäljittelee, miR-30c-estäjän ja niiden sekoitetun sekvenssin sisältävillä verrokeilla. (C). Kotransfektiolla miR-30c estäjä, SIR-MTA-1 ja niiden sekoitetun sekvenssin sisältävillä verrokeilla oli suoritettu, ja MTA-1-proteiinin ilmentymistä arvioitiin Western blot -analyysillä. (D ja E). SiR-MTA-1 vähentää MTA-1-ilmentymisen mRNA (D) ja proteiini (E) tasot 48 h transfektion jälkeen. (F). QRT-PCR-analyysi osoittaa lisääntyminen miR-30c ilmentymisen jälkeen MTA-1 ilmentymisen estyi. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (* P 0,05, ** P 0,01).

kotransfektioon kokeissa olemme huomanneet, että miR-30c estäjä ja SIR-MTA-1 ollut antagonistinen tavalla MTA-1 asetuksen (kuvio 2C). Yhdessä havainto, että SIR-MTA-1 suppresseed ilmentymistä MTA-1 sekä mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 2D ja 2E), uskomme, että miR-30c todellakin säätelee negatiivisesti MTA-1. Mielenkiintoista, tukahduttaminen MTA-1 ilmentymisen Sir-MTA-1 johti lisääntyneeseen ilmaus miR-30c (kuvio 2 F).

Yhdessä olemme vahvistaneet miR-30c suoraan tukahdutettu MTA-1 ilmaisun ja että palaute-silmukka on läsnä niiden välillä. Vaikka lisää tutkimuksia tarvitaan tutkimaan erityinen mekanismi taustalla palautetta silmukan sääntelyä, nämä tulokset tukevat käsitystä, että miR-30c voivat toimia estämällä MTA-1 EY.

MiR-30c säätelee solujen lisääntymistä, muuttoliike ja maihinnousu EY

Kuten edellisessä tutkimuksessa on osoitettu, kohdunulkoinen ilmaus miR-30c voi estää EY soluproliferaatiota, muuttoliike ja invaasio [17]. Täällä lisätodisteita vahvistamaan näitä vaikutuksia Ishikawa soluissa. Ektooppinen ilmentyminen miR-30c inhiboi soluproliferaatiota MTT-määritys. Elinkelpoisuuden transfektoitujen tukahdutettiin (kuvio 3A) ja suhteellisen soluproliferaatiota väheni 72 ja 96 h transfektion jälkeen (kuvio 3B). Maahanmuuton osalta ja invaasio, teimme haavan paranemista ja transwell määritys. Transfektio miR-30c-matkii väheni muuttoliike ja invaasio verrattuna jäljittelee-sc, kuten kuviossa 3C ja 3D. Toisaalta, kykyjä solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion tehosti jälkeen solut transfektoitiin miR-30c-estäjä (kuvio 3A -3D).

(A). MTT-määritys osoittaa, että miR-30c matkii tukahdutetaan solujen elinkelpoisuus (ylempi), kun taas miR-30c estäjä edistänyt solujen elinkykyä (alempi). (B). MiR-30c-matkii vähentää suhteellinen solujen lisääntymistä (ylempi), kun taas miR-30c-estäjä kasvaa suhteessa solujen lisääntymistä (alempi), vastaavasti 72 ja 96 tuntia transfektion jälkeen. (C). Edustaja valokuvia haavan paranemista määritys osoittaa vaeltavien kyky transfektoitujen solujen 0, 24 ja 48 tuntia haavoittamisen jälkeen. (D). Edustavia valokuvia soluinvaasiota on transwell määrityksessä. Keskimäärin solujen laskettiin 5 random mikroskooppikentäs- (x 200). Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD suhteellisen soluinvaasiota. (* P 0,05, ** P 0,01).

Näin vaihteleva ilmentyminen miR-30c esiin erilaisia ​​vaikutuksia pahanlaatuinen ominaisuudet Ishikawa soluja. Uskomme, että miR-30c toimii tuumorisuppressorina vaikuttamalla jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasion EY soluja.

MiR-30c toimii tuumorisuppressorina kautta miR-30c-MTA-1 signalointireitin

aiemmin todenneet, että miR-30c tavoitteet MTA-1, joka on yli-ilmentynyt EY [37] ja joka toimii onkogeenin monissa ihmisen kasvaimissa [38], [39]. Kuitenkin toiminta MTA-1 in EY pysyi määrittelemätön. Siksi me tutkimme, miR-30c toiminnot kautta miR-30c-MTA-1 signalointireitin. Tukahduttaminen MTA-1 Sir-MTA-1 inhiboivat Ishikawa soluja, kuten meidän MTT tulokset (kuvio 4A). Lisäksi menetys MTA-1 vähensi myös solumigraatioon ja invaasio, kuten meidän haavan paranemista ja transwell määrityksen tulokset (kuvio 4B ja 4C). Nämä havainnot paljastivat, että MTA-1 näyttelee pro-kasvaimia rooli EY soluissa säätelemällä jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasion Ishikawa soluja. Koska miR-30c voi suoraan tukahduttaa ilmaisun MTA-1, ja koska MTA-1 on onkogeenin EY, uskomme, että miR-30c toimii tuumorisuppressorina kohdistamalla MTA-1.

(A ). MTT-määritys osoittaa solujen elinkelpoisuus (vasemmalla) ja suhteellinen solujen lisääntymistä (oikea) on tukahdutettu transfektoimalla SIR-MTA-1 72 ja 96 h. (B). Edustaja valokuvia haavan paranemista määritys osoittaa vaeltavien kyky transfektoitujen solujen 0, 24 ja 48 tuntia haavoittamisen jälkeen. (C). Edustavia valokuvia soluinvaasiota on transwell määrityksessä. Keskimäärin solujen laskettiin 5 random mikroskooppikentäs- (x 200). Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD suhteellisen soluinvaasiota. (D) ja (E). Kotransfektio miR-30c-estäjä ja SIR-MTA-1; transfektoimalla miR-30c-estäjä ja SIR-sc toimi kontrollina. (D). Verrattuna kontrolli- transfektio, solujen elinkelpoisuus (ylempi) ja suhteellinen solujen lisääntymistä (alempi) tukahdutettiin 96 h. (E). Edustavia valokuvia soluinvaasiota on transwell määrityksessä. Keskimäärin solujen laskettiin 5 random mikroskooppikentäs- (x 200). Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD suhteellisen soluinvaasiota. Erot Suhteellisen solujen lisääntymistä ryhmien välillä esiintynyt 96 h transfektion jälkeen. (* P 0,05, ** P 0,01).

laajentaa tutkimuksessa olemme kotransfektoitiin miR-30c-estäjä ja SIR-MTA-1 osaksi Ishikawa soluihin ja totesi, että väheneminen MTA -1 heikennetyn solujen lisääntymisen ja invaasiota välittyy miR-30c-estäjä verrattuna kontrolliryhmään-transfektoidut ryhmä (kuvio 4D ja 4E). Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-30c toiminta riippuu MTA-1 ja validoitu olemassaolo miR-30c-MTA-1 signalointireitin.

Estrogeeni down-regulation ilmentymistä miR-30c EY: n soluissa

Kun osoitti kasvain tukahduttava kykyä miR-30c, tutkimme seuraavaksi sääntelyä miR-30c. Ero miR-30c ilmentymisen välillä ER-positiivisten Ishikawa solujen ja ER-negatiiviset HEC-1-B-solujen viittaa siihen, että E

2 ja ER voisi olla tärkeä rooli säätelyssä miR-30c. Siten, tutkimme miR-30c ilmentyminen muuttuu kun E

2 hoitoa.

Verrattuna sokeakoekuoppaa, ilmaus miR-30c oli huomattavasti säädellä vähentävästi aika- ja annosriippuvaisesti 6, 12, 24 ja 48 tuntia, kun 10

-8 M ja 10

-10 ME

2 hoidossa ER-positiivisten Ishikawa soluja (kuvio 5A). Muutostyöt in miR-30c ilmentyminen indusoi E

2 hoito oli osittain päinvastaiseksi yhteiskäsittely kanssa ICI182780 Ishikawa soluissa (kuvio 5B). Sen lisäksi, että E

2 hoidon aiheuttamaa tukahduttaminen miR-30c, pri-miR-30c ja pre-miR-30c myös alassäädetty (kuvio 5C), mikä viittaa siihen, että E

2-ER voi estää transkription miR-30c Ishikawa soluissa.

(A). MiR-30c vähennettiin käsittelemällä 10

-8 M ja 10

-10 M E

2 6, 12, 24 ja 48 tuntia käsittelyn jälkeen qRT-PCR-analyysillä Ishikawa soluissa. Käsittely 10

-8 M E

2 aiheuttanut enemmän merkitsevän eston paitsi 48 tuntia. (B). 10

-8 M ICI182780 osittain päinvastaiseksi vähentäminen miR-30c tasot aiheuttama hoito 10

-8 M ja 10

-10 M E

2 24 tunnin kuluttua yhteiskäsittely Ishikawa soluissa. (C). Pre-miR-30c tasot alenivat E

2 kohtelu sekä Ishikawa ja HEC-1-B-soluja (ylempi). Pri-miR-30c tasot alenivat E

2 hoitoa Ishikawa mutta ei HEC-1-B-soluja (alempi). (D). MiR-30c tasot alenivat upon 10

-8 M ja 10

-10 ME

2 hoitoa 6, 12, 24 ja 48 tuntia käsittelyn jälkeen qRT-PCR analyysi HEC-1-B-solujen . Vaikutus kahden pitoisuuden erosivat 12 h hoidon jälkeen. (E). 10

-8 M ICI182780 eivät muuttaneet vähentäminen miR-30c tasot aiheuttama hoito 10

-8 M ja 10

-10 ME

2 48 tunnin kuluttua yhteiskäsittely in HEC-1 -B-soluja. (F). Hoito 10

-8 ME

2 sääteli mRNA ilmentymistä MTA-1 sekä Ishikawa solut ja HEC-1 solujen 24 ja 48 tuntia, vastaavasti, vaikutus, joka purettiin yhteiskäsittely 10

-8 M ICI182780 että Ishikawa soluissa (ylempi), mutta ei HEC-1-B-solujen ((alempi). (* P 0,05, ** P 0,01).

kuitenkin olemme havainneet, että E

2 vähensi myös miR-30c ekspressiotasot ER-negatiivinen HEC-1-B-soluissa (kuvio 5D). Se oli odotettavissa, että inhibitio miR-30c ilmentyminen E

2 hoito oli ei estänyt ICI182780 in HEC-1-B-solujen (kuvio 5E). Eroaa Ishikawa soluista, E

2 pienentänyt ilmaus ennalta miR-30c, mutta ei PRI-miR-30c HEC-1-B-solujen (kuvio 5C), mikä viittaa siihen, että E

2 pitäisi estää kypsymistä miR-30c ER-riippumattomalla tavalla.

lisäksi E

2 sääteli ilmentymistä MTA-1 mRNA sekä Ishikawa ja HEC-1-B-solujen, vaikutus, joka purettiin ICI182780 Ishikawa soluissa vain valituissa pitoisuus ja aika (kuvio 5F). Tämä saattaa johtua joko vähentämiseen miR-30c aiheuttama käsittelemällä E

2 tai muun kuin vielä tunnistamattomien signalointireitin.

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että E

2 edustaa sääntelyn tekijä ilmentymisen miR-30c, joka toimii sekä ER-riippuvainen ja ER-riippumattomia tapoja. Kuitenkin tarkka taustalla molekyylitason mekanismi, jolla E

2 säätelee ilmentymistä miR-30c edellyttää tarkkojen lisäselvitysten.

Keskustelu

vapautuminen miRNA syövän voi edistää angiogeneesiä, kasvua etu, kudosinvaasio ja etäpesäke. Kuitenkin ymmärrystämme poikkeavien ilmaisun ja mahdolliset roolit miRNA syövän edelleen vähäistä. MiR-30c, jäsen miR-30 perhe, on osoitettu olevan säädellä vähentävästi EY microarray analyyseja [16] ja rintasyövän [23] verrattuna normaaleissa kudoksissa, mutta säädellään ylöspäin munasarjasyöpää verrattuna hyvänlaatuinen tai rajatapaus munasarjakasvaimia [18] ja mesoteliooma soluissa [29]. MiR-30c voi toimia mahdollisena biomarkkerina koska sen sääntelyn eri alatyyppeihin ja pahanlaatuiset vaiheissa kasvainten kuten rintasyövän [21], munasarjasyöpä [18] ja mesoteliooma [28], [29]. Lisäksi lisääntynyt ilmentyminen miR-30c korreloi suotuisa ennusteeseen ja kliininen teho tamoksifeenihoito rintasyövässä [22] sekä pidempi aika ilman taudin etenemistä selvällä solussa munuaissyöpä [25], mutta huonompi selviytyminen pahanlaatuinen mesoteliooma [29] ja kemoterapeuttisen resistenssi keuhkosyövän [24]. Erityisesti suhteessa siihen rooliin miR-30c kemoterapeuttisten vastarintaa munasarjasyövän, Eitan et al. ja Sorrentino et ai. tehneet vastakkaisia ​​päätelmiä [40], [41]. Kiistanalainen koskevat päätelmät miR-30c vahvistamaan tärkeä rooli tuumorigeneesiä ja etenemiseen, riippumatta sen tarkka kasvaimia tai kasvain ehkäisevästä luonteesta.

Tässä tutkimuksessa olemme tutki tarkemmin roolia miR-30c EY. Huomasimme, että miR-30c on säädellä vähentävästi EY näytteissä verrattuna normaaliin näytteitä, kuten on osoitettu qRT-PCR-analyysillä, yhdenmukainen aiempien mikrosiruanalyysi by Boren et al [16]. Valitettavasti meillä ei ole tarpeeksi tapauksia arvostamaan vapauttamiseen miR-30c ilmaisun eri alatyyppejä ja kliinis. Tulevaisuutemme Tutkimusten tarkoituksena on valaista tätä kysymystä. Olemme kuitenkin havainneet, että miR-30c ilmentyminen oli suurempi ER-negatiivinen solulinja, mikä tarkoittaa, että miR-30c voi korreloi E

2 ja ER, sekä erityisiä alatyyppejä EY.

laajentaa edellisessä tutkimuksessa olemme perusteellisesti läpi suhdetta miR-30c ja MTA-1. Aiemmin suoritimme lusiferaasireporttiterilla määritys, joka osoitti 3′-UTR MTA-1 kohdistetaan miR-30c. Lisäksi olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen miR-30c laski MTA-1-ilmentymisen mRNA ja proteiini tasoilla sekä Ishikawa ja HEC-1-B-solujen [17]. Täällä ei vain palautettu vaan myös vähensi ilmaus miR-30c ja arvioinut johtuvat muutokset MTA-1. Käytimme Ishikawa soluja ainoastaan ​​tässä tutkimuksessa, koska miR-30c toimi sama kahden solun riviä edellisessä tutkimuksessa. Tulokset Tämän tutkimuksen ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimuksen ja meillä on myös todennut, että SIR-MTA-1 ja miR-30c estäjä toiminut antagonistinen tavalla. Kuten olemme tarkistanut suoraan tukahduttaminen MTA-1 Sir-MTA-1, pystyimme päättelemään toiminnallinen suhde miR-30c ja MTA-1. Merkillistä, myös tunnistaneet palaute-silmukka, jossa tukahduttaminen MTA-1 kohonneeseen miR-30c, palautetta vaikutus, joka myös esiintyi miR-145 ja sen kohdegeenin Oct4 [42]. MiR-30c on aiemmin raportoitu pelata tukahduttaminen osassa kasvaimen solujen lisääntymisen, etäpesäke ja lääkeresistenssin kohdentamalla BCL9 [19], TWF1, vimentiinistä [21] ja KRAS [20]. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet miR-30c-MTA-1 signalointireitin edustaa toimiva mekanismi, jolla miR-30c tukahduttaa EY. Kuitenkin Mirs toimivat yleensä sääntelyssä monipistemittaus ja emme voi sanoa, että ei ole muuta signalointireitille työntekoa miR-30c EY.

Tällä hetkellä sääntely miRNA on aihe, joka on kerännyt yhä huomio. Onconase [43], Lysofosfatidihappo (LPA) [19], ja EGF: n ja MET-reseptoreihin [24] on raportoitu ilmentymisen moduloimiseksi miR-30c. Ottaen huomioon ero ilmentymistä miR-30c välillä ER-positiiviset ja ER-negatiiviset EY solulinjoja käytettiin tutkimuksessamme ja suhde EY ja E

2, päätimme tutkia E

2 ehdokkaaksi säätelijänä miR-30c ilme.

EY, miR-206 [44] ja Let-7 perheen miRNA [9] korreloivat E

2 ja ER joko kohdistamalla ERa tai olemalla kohteena modulaatio E

2. Modulointi miRNA E

2-ER on lopullisesti osoitettu, [45]. Yamagata et ai [6] osoitti, että ERa, ei ER, joka esti kypsymistä miRNA estämällä pri-miRNA-to-pre-miRNA muuntaminen. Tämä vuorovaikutus tapahtuu posttranskriptionaalisella tasolla ne yhdistetään Drosha ja p68 /p72, joka voidaan aktivoida E

2. Kuitenkin jopa ilman E

2, fyysinen assosiaatio ERa ja Drosha ilmenee yhä, mikä mahdollisesti aiheuttaa tukahduttaminen miR-30c Ishikawa soluissa verrattuna HEC-1-B-solut, jotka olemme havaittu tässä tutkimus. Toinen tuore tutkimus ehdotti, että ERa tukahdutettu miR-140 ilmentymisen transkriptionaalisella tasolla sitoutumalla tiettyyn promoottorielementin (-79 /-50) Mir-140 [10]. Paitsi ERa, ER [14] ja Dicer [13] on myös raportoitu olevan merkitystä kannalta E

2 sääntelyssä miRNA. Kuitenkin, kaikki nämä tulokset olivat peräisin rinta MCF-7-soluissa. Niinpä ehdotamme, että edelleen mekanistinen tutkimuksia EY soluja halusimme.

Tutkimus osoitti, että E

2 säätelee negatiivisesti miR-30c ja aiheuttama sen kohdegeenin MTA-1, EY: n soluissa, sääntely vaikutus, joka oli myös näytteillä miR-140 ja sen kohdegeenin Sox2, rintasyöpäsoluissa [10]. Induktion MTA-1 E

2 EY-soluissa saattaa johtua lasku miR-30c tai ohjata stimulaation E

2, jotka molemmat vaativat lisätutkimuksia.

kontrasti, tutkimus on osoittanut, että miR-30c on up-säännellään E

2 ER-positiivisessa rintasyövässä MCF-7cells [13], jotka osoittavat eri moduloivia mekanismeja, joilla E

2 säätelee miR-30c eri syöpäsoluja.