Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tavoite

Evidence on osoittanut että matriisimetalloproteinaasit-3 (MMP3) on tärkeä syövän etenemisen. Viimeaikaiset tutkimukset siitä assosiaatiota -1171 (5A 6A) polymorfismi MMP3 promoottorialueella ja syöpäriskin ovat tuottaneet ristiriitaisia ​​tuloksia.

Menetelmät /Principal Havainnot

suorittaa meta-analyysi 41 tutkimukset, mukaan lukien 11112 tapauksissa ja 11091 valvontaa onko -1171 (5A 6A) polymorfismi MMP3 liittyi syöpäriskiä. Arvioimme vahvuus yhdistyksen ja suorittaa alaryhmäanalyysien syövän tyyppejä, etnisyys, tupakointi, genotyypitysmenetelmää, lähde valvonnan ja otoskoko. Yhdistetty Tulokset paljastivat, että merkittäviä assosiaatiosta -1171 (5A 6A) polymorfismi kokonaiskäyttöaste syöpäriskin tahansa neljä mallia. Edelleen alaryhmä analyysi paljasti, että yksilöiden 6A alleeli oli pienempi riski ruoansulatuskanavan syöpään kaksi mallia: heterotsygoottianalyysiin vertailu (6A /5A vs. 5A /5A: OR = 0,74, 95% CI: 0,60-0,91; I

2 = 1,9%), ja hallitseva malli (6A /6A + 6A /5A vs. 5A /5A: OR = 0,77, 95% CI: +0,64-+0,94; I

2 = 29,0%). Lisäksi yhteydet olivat merkittäviä aasialaisilla kolme mallia: homozygoottisia vertailu (6A /6A vs. 5A /5A, OR = 0,68, 95% CI: 0,52-0,90; I

2 = 26,7%), heterotsygootti vertailu ( 6A /5A vs. 5A /5A: OR = 0,75, 95% CI: 0,58-0,98; I

2 = 0,0%), ja hallitseva malli (6A /6A + 6A /5A vs. 5A /5A: OR = 0,69, 95% CI: +0,54-,88; I

2 = 0,5%). Huomionarvoista oli se, että meillä oli päinvastoin löytää tupakoimattomilla: variantti 6A /6A homozygoottisia saattaa tilastollisesti lisätä syöpäriskiä verrattuna 6A /5A + 5A /5A genotyyppi (OR = 1,92, 95% CI: 1,25-2,96; I

2 = 72,7%).

Johtopäätös

Tämä meta-analyysin mukaan -1171 (5A 6A) polymorfismi MMP3 promoottorialue ei liity yleistä syöpäriskiä, ​​mutta se voi osaltaan laski syöpäriskin Aasian väestöstä verrattuna valkoihoinen väestö ja merkittävästi vähentää ruoansulatuskanavan syöpään.

Citation: Yang X, Hu JW, Qiu MT, Li M, Yin R, Wang J, et al. (2014) yhdistys matriksimetalloproteinaasi-3 -1171 (5A 6A) polymorfismin kanssa syöpäriski: Meta-analyysi 41 Studies. PLoS ONE 9 (1): e87562. doi: 10,1371 /journal.pone.0087562

Editor: Marcia Edilaine Lopes Consolaro, State University of Maringá /Universidade Estadual de Maringá, Brasilia

vastaanotettu: 08 lokakuu 2013; Hyväksytty: 21 joulukuu 2013; Julkaistu: 29 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (81201830, 81372321), ja erityinen rahasto Jiangsu Key laboratorion syövän molekyylibiologian ja Translational Medicine (BM2013007). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

metalloproteinaasien (MMP: t), perheen erittäin konservoituneiden sinkki-riippuvainen proteolyyttisiä entsyymejä, jotka hajottavat monia eri komponentteja soluväliaineen (ECM) ja tyvikalvon, ovat olleet mukana säätelyyn eri solujen käyttäytymisen kanssa merkitystä kasvainten kehittymiseen ja etäpesäkkeiden [1] – [3]. MMP: t on jaettu viiteen alaryhmään niiden rakenne ja substraattispesifisyys: kollagenaasit, stromelysiinit, gelatinaasit, kalvo-tyypin MMP, ja muut MMP: [4]. MMP: t on luokiteltu 24 mukaisten entsyymien substraattispesifisyys ja rakenteelliset samankaltaisuudet [5]. Expression useimmat MMP kasvaimissa säätelevät pääasiallisesti transkriptionaalisella tasolla, mutta on myös näyttöä siitä, modulaation mRNA: n stabiilisuuteen vasteena kasvutekijöiden ja sytokiinien erittää kasvaimeen infiltroivista tulehdussolujen sekä kasvaimen ja stroomasolujen [6].

MMP3 (stromelysiini-1) tiedetään hajottamiseksi tyvikalvon kollageenia ja indusoida muiden MMP: iden, kuten MMP-1 ja MMP-9 [7], [8]. MMP3 geeni lokalisoitu 11q22 vieressä MMP-1-geeniä, joka on tuotettu strooman fibroblastit, makrofaagit ja synoviaalisolujen [9]. Yksittäinen adeniini insertio /deleetio polymorfismi (5A 6A) on 1171 asemaan MMP3 promoottorialueen voisi mukauttaa sen transkription [10].

In vitro

määrityksissä promoottorin aktiivisuus osoitti, että 5A alleeli oli kaksi kertaa korkeampi promoottorin aktiivisuus kuin 6A alleelin [10]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet yhdistyksen välillä MMP3 -1171 (5A 6A) polymorfismi ja syövän riskiä, ​​mukaan lukien peräsuolen, keuhkojen, pään ja kaulan, ruokatorven, rinta-, munasarja- syöpiä ja niin edelleen [6], [11] – [ ,,,0],15]. Nämä tutkimukset tuottivat eri tai jopa kiistanalaisia ​​tuloksia. Esimerkiksi, Ghilardi et ai. [11] löydetty Merkitsevä yhteys MMP3 -1171 5A-alleelin ja lisääntynyt syöpäriskiä, ​​mutta Su et ai. [15] raportoitu mitään merkittävää korrelaatiota.

Meta-analyysi on keino lisätä otoskoko kautta yhdistämällä tietoja yksittäisistä tutkimuksista, mikä parantaa tilastollinen voima analyysin estimointijärjestelmässä geneettisiä vaikutuksia [16 ]. Täsmennetään yhdistyksen välillä MMP3 -1171 (5A 6A) polymorfismi ja syövän riskiä, ​​suoritimme tämä meta-analyysi yhdistämällä oikeutettuja tutkimuksia laskea arvio yleisen syöpäriskin ja arvioitu vaikutus syöpätyyppien, etnisyys, tupakointi, genotyypitysmenetelmää , lähde valvonnan ja otoskoko.

Methods

Literature Etsi strategia ja valintaperusteet

Tämä meta-analyysi suunniteltiin, toteutettiin, ja ilmoitettava PRISMA ohjeen [ ,,,0],17]. Suoritimme kirjallisuudesta toimialalla PubMed, EMBASE ja CNKI (Kiinan kansallisen Knowledge Infrastructure) ilman kieltä, ajanjakso ja otoksen koko rajoitukset, jotka kattavat kaikki julkaistuista jopa 21 elokuu 2013, yhdistelmällä seuraavat hakusanat: MMP3 geeni ( esimerkiksi: ”” MMP3 ” tai ” matriksimetalloproteinaasi-3 ’); syöpä (esim .: ”” syöpää ” ’,’ ’syöpä’ ’,’ ’kasvain’ ’tai’ ’kasvaimet’ ’) ja polymorfismi tai vaihtelua. Ennen etsivät PubMed tietokannasta etsittiin MeSH tietokannasta löytää eniten Hyväksytty etsivät kohteita. Ja avainsana ”polymorfismi”, käytimme MeSH sanaa ”Polymorphism, yhden nukleotidin” in etsimistä strategiassa. Lisäksi teimme manuaalinen etsimään viitteitä suhteellisen artikkeleita ja arvioita. Seuraavia kriteereitä käytettiin kirjallisuudessa valinta: (a) tapausverrokkitutkimukset tai kohorttitutkimusten; (B) tutkivat yhdistyksen välillä -1171 (5A 6A) polymorfismi MMP3 promoottorialueella ja syövän riskiä; (C) riittävät genotyypin jakelutietoja tapauksissa ja valvontaa. Tärkeimmät syyt sulkeminen tutkimukset olivat (a) arviot ja monistaa raportit samassa tutkimuksessa; (B) tutkimuksen suunnittelu muu kuin tapaus-verrokki menetelmää; (C) tutkimukset ilman yksityiskohtaista genotyypin taajuuksilla.

Data Extraction

Data poimittiin kaikki voivat julkaisuista riippumatta kahden kirjoittajien (Yang ja Hu) mukaisesti valintaperusteita kustakin oikeutettuja paperit: nimi ensimmäinen kirjoittaja, julkaisuvuosi, maan, jossa tutkimus tehtiin, etnisyys, lähde hallintalaitteiden, syöpätyyppeihin ja genotyypitysmenetelmiä, kaikista tapauksista ja valvonta, genotyypin esiintymistiheys tapauksissa ja valvontaa. Eri etnisten ryhmien luokiteltiin Aasian ja valkoihoisia. Syöpätyyppeihin luokiteltiin naistentautien syöpä (GC), kuten munasarjojen, kohdunkaulan ja kohdun limakalvon syöpä; Ruoansulatuskanavan syöpä (GIC), kuten mahalaukun ja peräsuolen syöpä; Rintasyöpä (BC); Pään ja kaulan alueen syöpä (HNC); Hepatosellulaarista karsinoomaa (HC); Keuhkosyöpä (LC); Suun syöpä (OC); Toiset (munuaissolukarsinooma, ruokatorven syöpä, virtsarakon syöpä, aivot astrosytooma ja nenänielun karsinooma). Kaikki kelvolliset tutkimuksissa määriteltiin sairaala-pohjainen (HB), väestöpohjainen (PB), ystävien ja puoliso-pohjainen (FASB) mukaan lähteen valvontaa. Hardyn-Weinberg tasapaino (HWE) laskettiin Chi-square test (p 0,05 pidettiin merkittävänä epätasapaino), joka perustuu -1171 5A 6A polymorfismin genotyypitys jakelua valvonta [18].

Tilastollinen analyysi

vahvuus yhdistyksen välillä MMP3 -1171 (5A 6A) polymorfismi ja syövän riskiä arvioitiin laskemalla kerroinsuhde (OR), jossa 95%: n luottamusväli (95% CI), joka perustuu genotyypin taajuuksilla tapauksissa ja valvontaa. Yhdistetty syrjäisimmillä alueilla laskettiin neljä mallia: homozygoottisia vertailu (6A /6A vs. 5A /5A), heterotsygoottinen vertailu (6A /5A vs. 5A /5A), hallitseva malli (6A /6A + 6A /5A vs. 5A /5A ) ja resessiivinen malli (6A /6A vs. 6A /5A + 5A /5A). Kiinteä vaikutukset malli (Mantel-Haenszelin menetelmää) käytettiin kun ei ollut merkittävää heterogeenisyyttä [19]; muuten, satunnainen vaikutusten malli (Der Simonian ja Laird menetelmä) käytettiin [20]. Mukaan Cochrane käsikirjasta-katsaukseen interventioiden, hyödyllinen tilastotieto kvantifioimiseksi epäjohdonmukaisuus on I = [(Q -df) /Q] x 100%, jossa Q on khiin neliö ja df on sen vapausasteita. Tässä kuvataan prosenttiosuutta vaihtelusta vaikutus arvioi, että johtuu heterogeenisyys sijaan näytevirhe. Arvo I

2 50% kertoo huomattava heterogeenisuus. Herkkyysanalyysi suoritettiin poistamalla kunkin yksittäisen tutkimuksen vuorollaan kokonaismäärästä ja reanalyzing loput [21]. Alaryhmäanalyysien ja logistinen meta-regressio analyysit tehtiin tutkia lähde heterogeenisuus muuttujia, kuten syövän tyypit, etnisyys, genotyypitysmenetelmää, lähde valvonnan ja otoskoko (tutkimuksissa yli 1000 osallistujaa määriteltiin ” suuri ”, ja tutkimukset vähemmän 1000 osallistujaa määriteltiin ” pieni ”). Julkaisu bias oli molemmissa tarkasteltiin Begg n suppilo juoni [22] ja Egger n regressiomenetelmä [23] (p 0,05 katsottiin edustavan tilastollisesti merkitsevä julkaisun bias). Kaikki p-arvot ovat kaksipuolisia. Aineisto analysoitiin STATA ohjelmistoa (versio 12.1, Stata Corp, College Station, Texas USA).

Tulokset

Ominaisuudet Studies

Yksityiskohtainen arviointiprosessi saatettiin kuvassa 1. Lopuksi on yhteensä 41 tukikelpoisten tapausverrokkitutkimukset sisälly tähän meta-analyysi, joka sisälsi 11112 tapauksia ja 11091 valvontaa [6], [9], [11] – [15], [24] – [53 ]. Tutkimuksessa raportoimat Biondi et al. [27], syöpä tyypit sisälsi rinta-, paksusuolen ja peräsuolen, munasarja- ja keuhkosyövän; ja toisessa tutkimuksessa raportoitu Zhang et al. [6], syöpä nimikkeet ruokatorven ja mahalaukun syöpä. Ja genotyyppi taajuudet esiteltiin erikseen, jolloin kukin niistä pidettiin erillisenä tutkimuksen meta-analyysi. Oli 23 tutkimuksissa aasialaiset, ja 18 tutkimuksissa valkoihoisilla. Population perustuvan valvonnan käytettiin 15 tutkimuksissa ja sairaala-pohjainen valvonta käytettiin 24 tutkimuksissa. Oli 7 tutkimuksia suurten otoskoko ja 34 tutkimukset pienestä näytteestä. Yksityiskohtaiset ominaisuudet voivat tutkimusten mukaan tähän meta-analyysi on esitetty taulukossa 1.

Association between -1171 (5A 6A) polymorfismia Kaiken Syövät Risk

Kuten taulukosta 2, huomasimme merkittävää assosiaatiosta -1171 (5A 6A) polymorfismi MMP3 promoottorialueen yleisen syöpäriskin tahansa neljä mallia.

Ositettu Analyysit

Kun ositettu syöpätyyppejä, havaittiin, että yksilöiden 6A alleeli oli pienempi riski ruoansulatuskanavan syöpään kaksi mallia: heterotsygoottianalyysiin vertailu (6A /5A vs. 5A /5A: OR = 0,74, 95% CI: 0.60- 0,91; I

2 = 1,9%), ja hallitseva malli (6A /6A + 6A /5A vs. 5A /5A: OR = 0,77, 95% CI: +0,64-+0,94; I

2 = 29,0%, kuva 2). Lisäksi huomasimme -1171 (5A 6A) polymorfismi oli yhteydessä alentuneeseen pään ja kaulan syöpä homozygoottisia verrattuna (6A /6A vs. 5A /5A, OR = 0,51, 95% CI: 0,29-0,88; I

2 = 0,0%). Kuitenkaan mitään merkittävää yhteyttä ei havaittu muita syöpätyyppeihin.

kerrostunut analyyseissä etnisyyksien, yhdistysten oli merkittävää Aasian väestöstä kolme mallia: homozygoottisia vertailu (6A /6A vs. 5A /5A TAI = 0,68, 95% CI: 0,52-0,90; I

2 = 26,7%), heterotsygoottinen vertailu (6A /5A vs. 5A /5A: OR = 0,75, 95% CI: ,58-+0,98; I

2 = 0,0%), ja hallitseva malli (6A /6A + 6A /5A vs. 5A /5A: OR = 0,69, 95% CI: 0,54-0,88; I

2 = 0,5%, kuva 3). Mutta valkoihoinen väestö ei ollut merkitseviä saapuvat alaryhmän analyysiin. Mitä alaryhmäanalyysien genotyypin menetelmällä ja otoskoko, löysimme merkittävä vähentynyt syöpäriskiä tutkimuksissa käyttäen PCR-RFLP menetelmän ja tutkimukset pienten otoskoko kolmea mallia (taulukko 2).

herkkyysanalyysi ja julkaiseminen Bias

Yksi ainoa tutkimuksessa mukana tässä meta-analyysi poistettiin joka kerta heijastamaan yksittäisten aineisto on saatu yhdistämällä syrjäisimpien [54], ja vastaavien yhdistettyjen syrjäisimmille alueille eivät olleet muuttunut (kuvio S1), mikä viittaa siihen, vakaus meta-analyysit. Begg n suppilo juoni ja Egger testi tehtiin arvioimaan julkaisemisen bias tutkimusten. Muoto Begg n suppilo juoni oli suunnilleen symmetrinen (kuva 4). Tilastolliset tulokset eivät vieläkään näytä julkaisu vääristymiä Egger testillä (p = 0,682).

Keskustelu

Tietääksemme ensimmäinen meta-analyysi, joka tarjotaan kattava arviointi – 1171 (5A 6A) polymorfismi MMP3 promoottorialueella syöpäriskiä tehtiin vuonna 2010 [55]. Verrattuna edelliseen meta-analyysi, me päivitetty 15 uusia tutkimuksia (41 vs. 26). Tässä meta-analyysissä, 41 voivat tutkimukset, mukaan lukien 11112 tapaukset ja 11091 valvonta, sisältyivät ja analysoitiin. Vaikka lukuisia tutkimuksia tuettu -1171 (5A 6A) polymorfismi voisi pienentää eri syövän riskiä, ​​kun taas yhdistetyssä syrjäisimmillä alueilla tämän meta-analyysi ei vahvista tätä yhdistystä. On syytä huomata, että yhdistys oli merkittävä Aasian väestöstä verrattuna valkoihoinen väestö, erityisesti ruoansulatuskanavan syöpään.

MMP3 tiedetään olevan keskeinen rooli sekä paikallisen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden, joista jälkimmäinen kuuluu kyky kasvainsolujen ylittämään tyvikalvon sekä epiteelin ja verisuonten endoteelin. Tämä johtuu MMP3 voivat myös aktivoida gelatinaasi B ja kollagenaasit ja vapauttaa useat solun pinnan molekyylejä, kuten E-kadheriinin, tunnettu tekijä syövän kehityksen [56]. MMP3 yliekspressio joidenkin syöpätyyppien on sopusoinnussa tämän hypoteesin [57]. Apoptoosi on tukahdutettu läsnä ollessa ehjä ECM tyvikalvon [58]. MMP: t voivat näin ollen olla mukana apoptoosin niiden kyky hajota ECM. Lisäämällä adenosiini että MMP3 geenin promoottorisekvenssin puolikkaat sen transkriptioaktiviteettia [10]. On ajateltavissa, että suurempi transkription aktiivisuus liittyy 5A alleeli voi parantaa kasvaimen invasiivisuus. Se vahvistettiin tämän meta-analyysissä.

Niistä 41 oikeutettuja tutkimuksia, kantajia variantin 6A alleeli oli vain raportoitu merkittävästi vähentynyt syöpäriskiä verrattiin 5A-alleelin mahasyövän [6], [12 ], [15], [27], [29], [30], [36], [48], [53]. Vuonna hallitseva mallissa, oli vain yksi tutkimus ehdotti 5A-alleelin merkittävästi edistänyt alttiutta sairastua keuhkosyöpään [44], mutta yhdistettiin syrjäisimmät alueet eivät vahvista yhdistyksen kunkin vastaavan ryhmän luokiteltu syöpätyyppeihin. Lisäksi löysimme merkittävää yhteyttä pään ja kaulan syöpää homotsygoottisia verrattuna.

Kun ositettu etnisten, löysimme assosiaatiota -1171 (5A 6A) polymorfismi MMP3 promoottorialueella ja syöpäriski oli vain merkittäviä aasialaisilla kolme geneettistä mallia. Erot voidaan selittää geneettisen monimuotoisuuden, kuten erilaiset riskitekijöitä elintavoista ja erilaiset ympäristön altistus [59] – [61]. Lisäksi, alaryhmä analyysi genotyypitysmenetelmää, positiivinen tulos havaittiin ainoastaan ​​tutkimuksissa käyttäen PCR-RFLP menetelmän, mutta ei tutkimukset käyttäen AS-PCR tai Taqman menetelmällä. Siten menetelmäerojen voisi edistää tuloksia tässä meta-analyysissä.

Lisäksi analyysit osoittivat muutamia merkittäviä tuloksia tutkimuksissa eri tupakoinnista. Kuitenkin meillä oli päinvastoin löytää tupakoimattomilla: variantti 6A /6A homozygoottisia saattaa tilastollisesti lisätä syöpäriskiä verrattuna 6A /5A + 5A /5A genotyyppi (OR = 1,92, 95% CI: 1,25-2,96; I2 = 72,7% ), joka näytti olevan ristiriidan edellisen yhden tutkimukset [9], [35]. Tavanomainen näkemys oli, että genotyyppien sisältävä villi 5A-alleelin voisi merkittävästi lisätä riskiä suun ja keuhkosyövän kehitystä tupakoitsijoita. Yksi mahdollinen selitys on, että vaikutus MMP polymorfismien syöpäriskiin voi hukkua vaikutuksesta tupakoinnin tupakoitsijoiden. Vaihtoehtoisesti, savukkeiden tupakointi on merkittävä lähde soluväliaineen ja saattavat aiheuttaa mRNA-tasoja ja MMP ja kudosten metalloproteaasien inhibiittoreina [62]. Näin ollen, vaikutusta polymorfismien vaikuttaa MMP geenien tupakoitsijat voi riippua tasapaino MMP ja kudosten metalloproteaasien inhibiittoreina [15].

Heterogeneity tutkimusten välillä kussakin mallissa on esitetty taulukossa 2. lähde heterogeenisuus tutkimuksissa tutkittiin joukossa covariables, kuten syövän tyypit, etnisten, lähde hallintalaitteiden, otoskoko ja genotyypitysmenetelmää. Meta-regressio Tulokset paljastivat, että mitään covariables osaltaan heterogeenisuus tutkimukset kokonaistulosta. Kuitenkin alaryhmä analyysit ehdotti syöpätyyppeihin ja otoksen koko saattaa olla tärkein heterogeenisyys tässä meta-analyysi. Tutkimukset Pienten otoskoko voi edistää pienen tutkimuksen vaikutus, jossa haittavaikutukset ovat suurempia, ja johtaa välillä tutkimusten varianssia. Julkaisu harhat arvioitiin Begg n suppilo tontteja ja niiden symmet- olivat edelleen arvioitiin Egger n lineaarista regressio testit. Tiedot ehdotti, että mitään selvää harhat havaittu, mikä osoittaa uskottavuutta ja vakautta tuloksia.

Useat rajoitukset tämän meta-analyysissä olisi käsiteltävä. Ensinnäkin yksittäisiä tietoja ei ollut saatavilla, ja tarkemman analyysin tulisi tehdä muita covariates kuten ikä, sukupuoli, ja ympäristötekijät. Toiseksi, otoskoko oli vielä suhteellisen pieni joillekin kerrostunut analyysit. Huolimatta näistä rajoituksista, olemme mukana 11112 tapauksissa ja 11091 valvontaa tällä meta-analyysissä, mikä voi lisätä tilastollinen voima ja vahvistaa tulosten luotettavuus.

Yhteenvetona osoitamme, että -1171 (5A 6A) polymorfismin MMP3 promoottorialue ei liity yleistä syöpäriskiä, ​​mutta se saattaa edistää väheni syöpäriskin Aasian väestöstä verrattuna valkoihoinen väestö ja merkittävästi vähentää ruoansulatuskanavan syöpään. Näiden tulosten vahvistamiseksi, suuren mittakaavan tapausverrokkitutkimukset tarvitaan.

tukeminen Information

Kuva S1.

herkkyysanalyysi. Yhdistetty kertoimet suhteet laskettiin jättämällä kukin tietokokonaisuus kerrallaan.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0087562.s001

(TIF)

tarkistuslista S1.

PRISMA tarkistuslista.

doi: 10,1371 /journal.pone.0087562.s002

(DOC) B