Krooninen sairaus

tiivistelmä

raportoi äskettäin, että Riccardin D (RD) kykeni indusoimaan apoptoosin suuntaamalla Topo II. Täällä, huomasimme, että RD indusoi solukierron pysähtymisen G2 /M vaiheessa PC-3-solut, ja aiheutti huomattavaa DNA-vaurioita osoituksena induktion γH2AX pesäkkeitä, mikrotumia, ja DNA pirstoutuminen Comet määrityksessä. Aika kineettinen ja annoksesta riippuvaa tutkimukset osoittivat, että ATM /Chk2 ja ATR /Chk1 signalointipolkujen olivat peräkkäin aktivoitu vastauksena RD. Tukos ATM /ATR signaloinnin johti vaimennus RD aiheuttama γH2AX, ja osittainen toipuminen solujen lisääntymisen. Lisäksi RD altistus johti inaktivoinnissa BRCA1, tukahduttaminen HR ja NHEJ korjausaktiivisuus, ja downregulation ilmaisuja ja DNA-end sitova toiminta Ku70 /86. Yhtäpitävä, microarray data näytetään, että RD laukaisi muutokset geenien vastuussa solujen lisääntymisen, solusyklin, DNA-vaurioita ja korjaus, ja apoptoosin. Anto RD on ksenograftin hiirillä vähensi kasvainten kasvua, ja yhteistoiminnallisesti aiheutti muutoksia geenien mukana DNA-vaurioita ja korjaus sekä solujen apoptoosin. Siten tämä havainto tunnistaneet uuden mekanismin, jolla RD vaikuttaa DNA: n korjaukseen ja toimii DNA-vaurioita agentti eturauhassyöpää.

Citation: Hu Z, Kong F, Si M, Tian K, Yu LX, Young CYF , et ai. (2013) Riccardin D kykenee sen antituumorivaikutus indusoimalla DNA Damage in PC-3 syöpäsolujen

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 8 (9): e74387. doi: 10,1371 /journal.pone.0074387

Editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 23, 2013; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2013; Julkaistu: 17 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (30772594, 30973551, 30925038) ja Natural Science Foundation of Shandong (2009ZRB01346). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia miehillä ja hormonaalisen peruuttaminen hoito on edelleen tehokas kehittyneen PCa. Kuitenkin kehitys hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä (HRPC) tapahtuu vääjäämättä jälkeen hormonaalisen vajaushoidon [1,2]. On rajallisesti vaihtoehtoja menestyksellinen hoitaminen HRPC. Äskettäin doketakseli, kasvi alkaloidijohdannainen, on nousemassa aktiivisena aineena parantaa elämänlaatua ja selviytymistä olosuhteissa metastasoituneen HRPC [3,4]. Menestys Doketakselin on johtanut moniin ponnisteluja eristää eri luonnossa esiintyviä kemikaaleja ja tutkia toimintamekanismit bioaktiivisten yhdisteiden kehittämistä varten chemopreventive ja /tai terapeuttisina aineina hoitamaan syöpiä, kuten HRPC [5].

Yksi tehokkaimmista kemiallisten reagenssien, joita käytetään syövän kemoterapiassa ovat DNA-vaurioita indusoijia, jotka voivat aiheuttaa erilaisia ​​DNA-vaurioiden kautta useita mekanismeja. Esimerkiksi camptothecin ja etoposidin voivat laukaista yhden säikeen katkoksia (SSBs) tai kaksijuosteiset DNA katkoksia (DSB: t) sieppaamalla topoisomeraasin-DNA kovalenttisia komplekseja, myöhemmin johtaa solukuolemaan [6,7]. Siten DNA topo I ja II, erityisesti topo II, uskotaan olevan vakiintunut tavoitteet syövän hoidossa.

Riippuen DNA vaurioita, erityisiä solusyklin tarkastuspisteitä ja solujen kaskadeja aktivoidaan DNA- vaurioittavat aineet. Kuten laajalti hyväksytty, ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) sekä ataksia telangiektasian ja Rad3 liittyvä (ATR) signalointipolkujen tärkeä rooli vastauksena DNA-vaurioita. ATM vastaa pääasiassa DSB: ihin, ja aloittaa fosforylaatiota loppupään tavoitteita kuten Chk2, BRCA1 ja NBS1 proteiinit paikalla DNA-vaurioiden [8]. Nämä tekijät toimivat yhdessä indusoivat G1, S ja G2 solusyklin pidätystä, DNA: n korjaukseen ja /tai aktivoitumista solukuolemareittejä [9]. Kun ATR aktivoituu vasteena replikaatio stressiä, se laukaisee aktivointi Chk1, mikä puolestaan ​​johtaa siihen, että fosforylaatio Cdc25 ja estää aktivoinnin CDK1 /sykliini B: n ja mitoosi tulo [10]. Kun DSB, prosessi DSB lopussa tuloaan liittyy lukuisia proteiineja ja entsyymejä kautta homologisella pää liittymällä (NHEJ) ja homologinen rekombinaatio (HR) korjausmekanismit [11,12]. Esimerkiksi Ku70 /86-heterodimeerin on kriittinen NHEJ, koska se sitoutuu rikki DNA päät ja rekrytoi huoltoon liittyviä proteiineja, mukaan lukien DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin, XRCC4: n ja DNA-ligaasi-IV [13]. On osoitettu, että DNA-vaurio on osallisena aikaansaamaan sekä ATM ja ATR signalointi [14]. Aktivointi näiden kahden reitin kanssa mahdolliset viat solusyklin tarkastuspisteiden ja DNA korjausvastausviestin voi olla merkitystä määritettäessä voimakkuus ja teho DNA-vaurion induktorien.

Olemme raportoi äskettäin, että Riccardin D (RD), makrosyklinen bisbibenzyl yhdiste Kiinan liverwort kasvi

Dumortiera hirsute

[15], pystyi indusoimaan apoptoosin ihmisen leukemiasolujen kohdistamalla topo II [16]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että RD hoito johti induktio DNA-vaurioita ja eston vasteen tuotteiden mukana DNA korjaukseen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoitoja

Ihmisen LNCaP, PC-3 ja DU145-soluja (American Type Culture Collection (ATCC)) viljeltiin RPMI 1640-alustassa (HyClone), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (HyClone). Soluja viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa, kunnes se saavuttaa noin 50-70% konfluenssiin sitten käsitellään kemikaaleilla. RD eristettiin ja puhdistettiin meidän laboratorioissa kuten aiemmin on kuvattu [15]. RD ja Etoposidi (VP-16) valmistettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja säilytettiin pieninä erinä -20 ° C: ssa.

immunoblottauksella

hoidon jälkeen, kuten on osoitettu, solujen lysaatit valmistettiin käyttämällä RIPA-puskuria. Proteiinit (80 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin elektroforeettisesti päälle polyvinylideenifluoridia kalvoja (Millipore). Kalvot tutkittiin yön yli 4 ° C: ssa sopivan primaarisen vasta-aineet: glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), sykliini E, poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), Bcl-2, Bax ja nukleoliinin (Santa Cruz) , Ku70 ja Ku86 (Active Modif), CDC25B (BD Biosciences), sykliini A (Abou Biotechnology), sykliini B1 (Novus Biologicals), Cdc25C, Ser

1981-fosforyloitua-ATM, Tyr

15-fosforyloitua-Cdc2 , Ser

428-fosforyloitua-ATR, Ser

296-fosforyloitua-Chk1, Thr

68-fosforyloitua-Chk2, Ser

1524-fosforyloitua-BRCA1, Ser

139-fosforyloitua histoni H2AX (γH2AX), PP2AA, PP2AB, ja PP2AC (Cell Signaling), PPP4C (Bethyl, Montgomery, TX, USA), IgG-TRITC (Abcam), minkä jälkeen salvattiin 5% rasvaa kuiva-maito. Poistettaessa primaarisilla vasta-aineilla, membraanit pestiin TBST: llä ja inkuboitiin IgG-piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarisia vasta-aineita, visualisoitiin sitten tehostetun kemiluminesenssin havaitsemisjärjestelmä (Millipore).

Solun kasvua ja solujen elinkelpoisuuden määritys

solut ympättiin 4000 solua /kuoppa mikrotiitterilevyillä (Roche), ja altistettiin RD tai ajoneuvon. Solujen kasvukäyrät saatiin Real-Time Cell Analyzer SP Instrument (Roche). Cell Index (CI) arvot normalisoitiin suhteessa CI arvo ajankohtana, jolloin lisätyt kemikaalit. Solun elinkelpoisuuden analyysi, PC-3-soluja esikäsiteltiin 10 mmol /L kofeiini 1 h, ja altistettiin RD tai ajoneuvon 24 tuntia. Soluproliferaatiota, tutkittiin sitten 3- (4, 5- dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyyli-2H-tetratsoliumbromidia (MTT, Sigma) kolorimetrisellä määrityksellä.

solu- syklin ja apoptoosimäärityksessä

käsittelyn jälkeen RD 24 h, solut kiinteät ja käsiteltiin propidiumjodidilla (PI) (Sigma) 30 min pimeässä. Solusyklin analysoitiin FACS (Becton Dickinson, USA). Apoptoosi tutkittiin käyttämällä anneksiini V-FITC /PI apoptoosin Detection Kit (BD Biosciences) virtaussytometrialla.

mikronukleuskokeessa

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin RD, DMSO tai VP-16 (10 mikromol /l) 24 tunnin ajan. Asennuksessa läpäiseväksi, solut värjättiin DAPI (Sigma). Mikrotumia solut sijoitettiin alle vaiheittaista fl uorescence mikroskooppia (Nikon). Vähintään 1000 solua näytettä kohti pisteytettiin analyysiä.

Neutral comet

Soluja käsitellään kemikaaleilla kuten edellä. DNA DSB havaittiin käyttäen Trevigen Comet, Pitoisuus Single Cell geelielektroforeesi määritys (Trevigen). Comet hännät oli kuvattu jonka vaihe-fluoresenssimikroskooppia (Nikon) ja kvantifioitiin Casp ohjelmisto. Vähintään 100 solua mitattiin hoitokertaa kohden.

Immuno fl uorescence värjäytyminen γH2AX ja p-BRCA1

kasvaneet solut coverslip kiinnitettiin jääkylmällä metanoli /asetoni (1: 1) ja inkuboidaan 3% BSA: lla PBS, jossa oli 0,1% Triton X-100. Inkuboinnin jälkeen primaarisilla vasta-aineilla ja huuhtelemalla PBS solut immunovärjättiin johdetun vasta-aineilla ja vastavärjättiin DAPI. Fluoresenssi kuvat siepattiin käyttäen konfokaalimikroskopialla (CarlZeiss).

Microarray ja reaaliaikaista PCR-analyysiä

Kokonais-RNA uutettiin soluista, jotka olivat altistuneet kemikaaleja käyttäen RNAiso plus (Takara Bio ). Mikrosiruanalyysi suoritettiin Genetimes Technology, Inc. (Kiina) on Affymetrix HG-U133 plus 2 siru, ja alkuperäiset tiedot toimitettiin GEO (sarja GSE37812). Kvantitatiivista PCR (qPCR) määritykset, cDNA syntetisoitiin käyttäen ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo). qPCR suoritettiin SYBR Green reaktio master mix Real-time PCR System (Eppendorf International). Transkription tasot halutut geenit normalisoitiin tasolle GAPDH. Muutokset geeni-ilmentymisen laskettiin käyttämällä ΔΔC

t-menetelmällä. Sekvenssit alukkeet esitetään taulukossa 1.

Eteenpäin-aluke (5 ’- 3’)

Käänteinen aluke (5′- 3′)

Cdc25BGGCTGAGGAACCTAAAGCCCTCGATCTCATCGTGACACAGTCdc25CAGGAACCCCAAAATGTTGCCTGCAGAAGTGGTAAGCTGAGTGcyclin ETCCAAGAGTTTGCTTACGTCACGCCAGGAGATGATTGTTACAGGcyclin AGATGGTAGTTTTGAGTCACCACACACGAGGATAGCTCTCATACTGTcyclin B1ATAAGGCGAAGATCAACATGGCTTTGTTACCAATGTCCCCAAGAGcdc2ACACAAAACTACAGGTCAAGTGGGGAATCCTGCATAAGCACATCCRPA1CTCGGGAATGGGTTCTACTGTCACTTGGACTGGTAAGGAGTGARPA2TGGTAGCCTTTAAGATCATGCCCCTGGATTGCTGATAGGTGCTCRPA3TGATGGAACCCCTTGATGAAGACATGTTGCACAATCCCTAAAGGAXRCC5GACGTGGGCTTTACCATGAGTTCAGTGCCATCTGTACCAAACXRCC6AGTCATATTACAAAACCGAGGGCCCTTGGAGGCATCAACCAAAAAMSH6AGCTTAAAGGATCACGCCATCAAGCACACAATAGGCTTTGCCGAPDHTGGTCACCAGGGCTGCTTAGCTTCCCGTTCTCAGCCTTTable 1. Q-PCR eteen- ja taaksepäin-alukkeita.

CSV Lataa CSV

Co-immunosaostus

määräosat proteiineja (1,2 mg) kontrollista ja RD-käsiteltyjen soluja esikirkastettiin proteiini A /G Plus -Agarose (Santa Cruz), kun läsnä on ei-spesifisen IgG: tä (Santa Cruz), sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla ja 20 ui agaroosi- helmet jatkuvasti sekoittaen yön yli 4 ° C: ssa. Helmet pestiin ja kuumennettiin 75 ° C: ssa 5 min latauspuskuria ennen immunoblottaus määrityksiä.

analyysi DNA end-sitova aktiivisuus Ku70 /Ku86

Nuclear poimii ohjaus- tai RD -käsitellyssä soluja valmistettiin ja alistettiin havaitsemiseksi DNA end sitova aktiivisuus Ku70 ja Ku86 käyttäen Ku70 /Ku86 DNA Korjauspaketti mukaan valmistajan ohjeiden (Active motiivi).

DNA end-liittymällä määritys

vaikutusten määrittämiseksi RD on DSB korjaus, olemme kehittäneet solutonta DNA end-liittymällä määritystä kuten ovat kuvanneet Shao C, et ai. [17]. Plasmidi pUC19 pilkottiin HincII, jolloin tasaiset päät lineaarinen molekyyli. Linearisoitu DNA inkuboitiin tumauutetta (2 ug), 50 mmol /L Tris-HCI (pH 7,6), 10 mmol /l MgCl

2, 1 mmol /L ditiotreitolia, 1 mmol /l ATP: tä, ja 25% (w /v) polyetyleeniglykoli 8000: 14 ° C: ssa 6 tuntia tai 24 tuntia. Tumauute Raji-soluja hankittiin Aktiivinen motiivi toimi positiivisena kontrollina. NHEJ määritettiin PCR-monistuksella risteyksessä palasi päät M13-alukkeita. PCR-tuotteet ampisilliinia suoritettiin sisäisenä kontrollina. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

NHEJ ja HR repair -testissä

Kyky DNA korjaukseen käsitellyissä soluissa RD arvioitiin HR ja NHEJ toimittajille, jotka ystävällisesti toimitti tri Gorbunova ( Department of Biology, University of Rochester) [25,26]. Reportteri kasetti havaitsemiseksi NHEJ tai HR pilkottiin I-Scel aiheuttavan DSB: ihin. Linearisoitu reportteri kasetti NHEJ tai HR ja DsRed oli transfektoida PC-3-soluissa, sen jälkeen sitä käsiteltiin RD tai ajoneuvon 24 tuntia. Solut analysoitiin FACScalibur koneella (Becton Dickinson, USA) käyttäen vihreää-versus-punainen fluoresoiva juoni. Tiedot analysoitiin Cell Quest ohjelmisto (BD Biosciences).

Assessment of anti-kasvain vaikutus RD

in vivo

arvioimiseksi

in vivo

vaikutus RD on PCA 6 viikkoa vanhoja BALB /c-nu-hiirten (Vital River Laboratories, Peking, Kiina) käytettiin. Hiirten annettiin sopeutua 1 viikon kuluttua saapumisesta. Tuumoriksenografteja todettiin injektoimalla 5 x 10

6 PC-3-solut oikeaan kylkiin hiirillä. Kun kasvaimet olivat havaittavissa, hiiret satunnaistettiin käsitellyissä ja kontrolliryhmissä. Ensimmäisen annostelun annettiin aikaan parin matching (päivä 1). RD (30 mg /kg) tai lumelääkettä (yhtä suuret määrät liuotinta) annettiin joka toinen päivä i.p. injektio. Hiiriä seurattiin päivittäin seuraavista käsittelyistä, ja kasvaimet mitattiin joka toinen päivä määrittämällä kaksi kohtisuorassa mitat [pituus (L) ja leveys (W)] käyttäen noniusmittaharppia ja lasketaan kaavalla V = L x W

2/2. Sen jälkeen, kun 20 päivää hoidon, kaikki hiiret lopetettiin ilma-eetterianestesiassa ja niiden kasvaimet resektoitiin kasvaimen massan mittaukseen. Kasvaimen kudokset fiksoitiin 4% paraformaldehydi ja käytetään TUNEL analyysi (Calbiochem), immunoblottauksen, ja immunofluoresenssilla. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin eettisen komitean Shandong University School of Medicine (Luvan numero: 2010038) ja suoritettiin vastaavasti.

Tilastollinen

Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Tilastollinen merkitys keskiarvon ero kontrolli- ja testiryhmään määritettiin pariksi t-testi, jossa

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

RD indusoi solukierron pysähtymisen ja apoptoosin PC-3-solujen

Koska RD on todettu aiheuttavan apoptoosin leukemiasolujen ja keuhkojen syöpäsolut [16,18], aloitimme tutkimuksemme onko RD myös kohdistuu sytotoksinen vaikutus PCa soluihin seuraamalla jatkuvasti solujen lisääntymisen. Kuten kuviossa 1A, altistuminen PC-3 solujen RD aiheutti merkittävästi solujen proliferaatio annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla.

, soluproliferaatiota vastauksena RD seurattiin solun indeksi (CI) arvot käyttämällä xCELLigence System.

B

, Altistuksen jälkeen PC-3 solujen rd 24 tuntia, solukierron analysoitiin fl ow sytometrialla.

C

, immunoblottianalyysi solusyklin sääntelyviranomaisten käsitellyissä soluissa RD.

D

, mRNA tasot G2 /M vaiheessa liittyvien lukiertosäätelijöistä in RD-käsitellyissä soluissa määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Expression muutokset niistä geeneistä seuraavista RD hoidon (10μmol /L) on myös mukana.

E

, prosentuaalinen apoptoottisten solujen analysoitiin fl ow sytometrialla.

F

,

, analyysi mikrotumien kokoonpanojen PC-3-solut käsiteltiin RD.

b

, taajuus PC-3, jotka sisältävät mikrotumia käsitelty RD tai VP-16 24 tuntia. baareja, SD. *, P 0,05, merkittävä ero käsittelemättömän ryhmän.

24 tunnin kuluttua hoidon RD, Solusykli merkittävästi pidätettiin G2 /M vaiheessa kasvavilla pitoisuuksilla. Näin ollen, RD-hoito johti annoksesta riippuvaa vähenemistä ilmentymisen sykliini E, A ja B, jotka ovat molekyylimarkkereiden korreloi G2 /M-vaiheessa. Perheen Cdc25 fosfataasien ja alavirran kohde Cdc2 tärkeä rooli S ja G2-M etenemistä. Havaitsimme myös pienennyksen ilmauksia CDC25B, Cdc25C, ja fosfori-Cdc2

Tyr15 (inaktiivinen muoto) annoksesta riippuvalla tavalla käsitellyissä soluissa (kuvio 1 C). qPCR määritykset osoittivat, että ilmaus Cdc2 on transkriptio tasolla oli merkittävästi vähentynyt RD-käsitellyissä soluissa (kuvio 1 D), mikä viittaa siihen, että RD tukahdutti ilmaus Cdc2 mRNA-tasolla, mikä puolestaan ​​johti alentuneeseen fosfori-Cdc2. Samaan aikaan muutoksia mRNA ilmaus sykliini E, A, B, CDC25B, ja Cdc25C mukaan RD (kuvio 1 D) olivat samankaltaisia ​​havaintoja kuviossa 1C, mikä osoittaa, että malli soluvasteiden oli yhdenmukainen RD aiheuttama häiriön solusyklin PC-3-solut. Sen lisäksi, että häiriöitä solusyklin etenemistä, RD kykeni huomattavasti indusoida apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1 E).

Microarray-analyysi paljasti, että geenit, jotka liittyvät vahingoittunut-DNA: ta sitovan, DNA: n korjautumiseen, solusyklin , ja apoptoosin merkittävästi muuttuneet RD-käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolliin jotka esitetään taulukossa S1. Näistä geeneistä, havaitsimme, että sykliini E, A, B, Cdc2, CDC25B, ja Cdc25C olivat alassäädetty dramaattisesti RD käsiteltyjä soluja, yhdenmukaisia ​​tuloksia kuvassa 1D.

RD laukaisee DNA-vaurioita Eturauhassyövän soluja

määritetään sitten onko altistuminen RD pitoisuuksina, jotka riittivät aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin seurauksena DNA-vaurioita, koska RD kykeni inhiboimaan Topo II leukemiasoluissa [16]. Kuten odotettua, mikrotumamuodostusta näkyi soluja käsiteltiin 5 umol /l RD 24 h, ja osoitti annoksesta riippuvaista kasvua (paneeli A kuviossa 1 F), joka on samanlainen VP-16, joka on hyvin dokumentoitu DNA-vaurioita ainetta. Lukumäärä micronucleus soluissa altistuvat RD oli koottu paneeli b kuviossa 1F. Siksi nämä tulokset viittaavat siihen, että RD aiheuttama DNA-vaurion joka liittyi edistämisen solukierron pysähtymisen ja apoptoosin PC-3-solut.

Vahvista kyky RD puhkeamisessa DNA-vaurioita PCA soluissa, tutkimme muutokset DNA-vaurion markkereita western blottauksella. Kuten kuviossa 2A, RD aiheutti merkittäviä lisäyksiä fosforylaatiota histonien H2AX

Ser139 (γH2AX), tunnettu DNA-vaurioita vastausindikaattorialueen, 2h ja jatkuva jopa 24 hoidon jälkeen sekä androgeeniriippuvaisissa (LNCaP) ja androgeenista riippumaton PCa (PC-3 ja DU145) soluja. Mitä DNA-vaurioita vastaus proteiineja, ilmaukset fosfori-BRCA1 by RD oli lausutaan varhain ajankohtina ja putosi alas soluissa pitkänkään hoitojen (kuvio 2A), mikä viittaa siihen, että RD aiheuttama DNA-vaurioita vastaus PCA soluissa.

, immunoblot-analyysi ekspressiotasot p-BRCA1 ja γH2AX LNCaP, PC-3, ja DU145-soluja altistetaan RD, vastaavasti.

B

,

, neutraali komeetta määritys suoritettiin määrittämiseksi DNA-fragmentti in RD-käsitellyissä soluissa.

b

, jakelu keskimääräinen komeetta pituus (100 solua näytettä kohti) laskettiin laatikko ja hiuksenhienosti juoni. Mediaanit on merkitty rasti; kvartiiliväli (25-75%; IQRs) osoitetaan auki laatikoita. Viikset ovat 1,5 kertaa IQR jakeluun.

Lisäksi, neutraali komeetta määritys suoritettiin testaamaan sitä RD voi aiheuttaa DSB PCA soluissa. Tulokset Kuviossa 2B osoitti, että DNA hännän hetkiä vastauksena RD oli havaittavissa soluissa jo 2h käsittely, ja voimistuivat pitkäaikaisesta hoidosta. Siten tulokset osoittivat, että RD merkittävästi aiheuttanut DSB PCA soluissa.

RD vaikuttaa ATM /ATR-riippuvaisen Chk1 /Chk2 reittejä PC-3-solujen

Voit selvittää ATM /ATR-Chk1 /2 signalointireittejä, jotka ovat hyvin tunnistettu aktivoidaan seuraavat DNA-vaurioita, ovat mukana RD aiheuttaman DNA-vaurion vastaus, ensin tutkittiin muutoksia tekijöiden tiedetään olevan tärkeä välittäjänä ATM /ATR reittejä. Kineettiset tutkimukset oli kohonnut fosforylaatioon ATM ja Chk2 (Thr

68) indusoitiin RD jo 30 minuuttia, mutta tämä fosforylaation taso laski jyrkästi jälkeenpäin. Kun taas aktivoituminen ATR /Chk1 havaittiin 2h käsittely ja jatkui jopa 24 osoituksena kertymistä fosfori-ATR ja fosfori-Chk1 (Ser

296) vastauksena RD (kuvio 3A). On huomattava, että ATR /Chk1 merkittävästi aktivoi RD on 2h käsittely, jossa aktivointi ATM /Chk2 oli heikentynyt. Siirtyminen aktivointi ATM ATR ehdotti, että muun tyyppisiä DNA vaurioita kuten replikaatio häiriöitä ja tilaa vieviä vauriot voivat myös esiintyä lisäksi DSB: ihin. Negatiiviseen säätelyyn Cdc25 perheenjäsenten, alavirtaan Chk1 /Chk2, on tärkeä mekanismi vastuussa estää mitoosi tulon jälkeen DNA-vaurioita [19]. Kuten odotettua, vaimentua CDC25B /C ja voimakas mitoottiset Cdc25C 4h, mikä jatkui hoidon jälkeen, havaittiin RD-käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio 3A). Kasvu pilkkomiseen PARP havaittiin myös (kuvio 3A).

, muutokset DNA-vaurion proteiinien RD-käsitellyissä soluissa analysoitiin western-blottauksella.

B

, hoidon jälkeen kemikaalit 4h tai 12 h, proteiinin tasot DNA-vaurion proteiinit havainnoitiin Western-blottauksella.

C

, Immuno fl uorescence värjäytyminen γH2AX pesäkkeitä ja p-BRCA1 pesäkkeitä PC-3-solut.

D

,

, neutraali komeetta määritys PC-3-solujen käsitelty RD 4 h ja 12 h.

b

, Comet pituus analysoitiin laatikko ja hiuksenhienosti plot menetelmällä (100 solua näytettä kohti).

E

, Associations of γH2AX, PP2AC, ja PPP4C määritettiin coimmunoprecipitation käyttäen anti-γH2AX, anti-PP2AC, anti-PPP4C, tai normaali IgG.

F

, PC-3-soluja esikäsiteltiin 10 mmol /l kofeiinia 1 h, ja altistettiin RD 4 h ja 12 h,

, solujen elävyyden MTT: llä mitatun; baareja, SD. *,

#, P 0,05, merkittävä ero kontrollista.

b

, muutokset γH2AX havaittiin Western blot.

DNA-vaurioita laukaisee signalointikaskadin, joka johtaa muodostumista korjauksen kompleksin taukoja. Seuraavaksi me arvioitiin muutoksia proteiinia BRCA1, kriittinen molekyyli alkuperäiseen palkkaamalla korjaus proteiinien /entsyymejä klo taukojen [20]. Aktivointi BRCA1 (fosforylaatio Ser

1524) mukaan RD todettiin jopa 4h ja laskivat hoidon jälkeen, mikä korreloi hyvin aktivoinnin rakenteessa Chk2, mikä viittaa Chk2 voi todellakin fosfory- BRCA1 vastauksena vahinko (kuvio 3A). Havaintojen perusteella edellä, huomasimme, että merkittäviä muutoksia on tapahtunut 4h ja 12h hoitoja, jotka molemmat voivat olla kriittisiä ajankohtina RD aiheuttaman DNA-vaurioita vastaus. Lisätutkimukset (kuvio 3B) näkyy, että rakenteessa yhteistoiminnalla, johon γH2AX, fosfori-Chk1 /2 ja fosfori-BRCA1 at 4h ja 12h oli yhtäpitävä kuviossa 3A. Nämä tulokset tukevat myös havainto kuviossa 3C. Kontrollina Vp-16 pystyi säilyttämään kohonnut fosfori-Chk1 /2, fosfori-BRCA1 ja γH2AX tasot jälkeen pidemmän valotusajan verrattuna kuin RD hoitoja (kuvio 3B ja 3C), mikä viittaa siihen, että erilaiset mekanismit osaltaan vastauksia RD ja VP-16 hoitoja. Mukaisesti korjauksilla DNA-vaurioita vastaus proteiineja, lausutaan komeetta hännät osoitettiin esittelemään soluissa altistuneet RD (paneelit a ja b kuviossa 3D). Huomattavaa on, että kohonnut γH2AX jotka voivat fosforyloitua ATM /ATR-kinaasien [21,22] näkyi 4h ja jatkuva jopa 48 tuntia seuraavien RD hoitoa, jossa aktivoitua-ATM /ATR mukaan RD kumottiin (kuvio 3A). Analysoimme myös muutoksia proteiinifosfataasi 2A (PP2A) ja proteiinifosfataasi 4 (PP4), jotka on liitetty defosforyloimaan γH2AX [23,24]. 24 tunnin kuluttua hoidon, RD aiheutti lisääntynyt PP2AC (katalyyttinen alayksikkö PP2A), ja PPP4C (katalyyttinen alayksikkö PP4) (kuvio 3E), mikä osoittaa, että H2AX pysyi fosforyloitu läsnä ollessa korotetussa PP2AC ja PPP4C. Samanaikainen immunosaostus tulokset osoittivat, että γH2AX oli selvästi havaittavissa asteittain vähentynyt PP2AC tai PPP4C in komplekseja immunosaostettiin anti-γH2AX, anti-PP2AC tai anti-PPP4C vasta-aineita (kuvio 3E), mikä viittaa siihen, että heikentynyt yhteenliittymien γH2AX /PP2AC /PPP4C by RD voi ainakin osittain myötävaikuttaa huomattavan kertymistä γH2AX.

Lisäksi kofeiini, estäjä ATM /ATR signalointi, kumosi melkein täysin kyky RD edistää H2AX fosforylaation hoidon aikana, joka oli mukana merkittävä käänteinen RD-solukuolema (kuvio 3F). Yhdessä data osoitti selvästi, että ATM /ATR-välitteisten Cascade reittejä ollut keskeinen rooli vastauksena rd aiheuttaman DNA-vaurion, joka johtaa edistämiseen solujen tulla tappava mitoosin.

RD estää NHEJ ja HR PC-3-solujen

vaikutusten määrittämiseksi RD on DSB korjaus kehitimme solutonta DNA end-liittymällä määrityksessä arvioimaan suhteellinen osuus NHEJ DNA end-liittymällä [17]. Linearisoituun plasmidiin pUC19 DNA-entsyymi-HincII inkuboitiin tumaproteiiniuutteet, ja loppu-liittymällä aktiivisuus näkyi ulkonäkö lineaarisen dimeerien ja multimeerien, jotka monistettiin PCR: llä M13-alukkeita, jotka reunustavat lopun liittyi risteykseen (kuvio 4A, 4B). Hoidon jälkeen RD 6 h tai 24 h, NHEJ aktiivisuus tumauutteen oli merkittävästi tukahdutti kuten on esitetty ulkonäkö vahva monomeerin kaistalla ja vastaavasti vähentynyt multimeeri tuotteita, kun taas dimeeriä, trimeeriä ja tetrameerin bändejä näkyivät kontrolliryhmässä (kuvio 4B ). Positiivisena kontrollina, NHEJ aktiivisuus heikentää myös RD inkuboinnin aikana DNA: n substraatin kanssa Raji solun tumaekstraktin (Active motiivi) samoissa olosuhteissa (kuvio 4B). Lisäksi inkubaatio lineaarisen DNA: n estävien vasta-aineiden suunnattu Ku70 ja Ku86 ydin- proteiinien vähensivät multimeeri bändejä, samanlainen havainto RD hoitoon (kuvio 4B), jotka osoittavat, että Ku-heterodimeerin Ku70 /Ku86 ovat kaksi tärkeää proteiineja in RD välittämän DSB korjaus.

, kaavakuva periaatteen DNA End-liittymällä määritys.

B

, Oltuaan hoidettu RD, tai estävät vasta-aineet Ku 70/86, suhteellinen kyky NHEJ määritettiin.

C

,

, Kaavakuva periaatteen NHEJ määrityksiä.

b

, Kaaviopiirros periaatteeseen HR määrityksiä.

D

, numerot GFP

+ ja DsRed

+ solut määritettiin virtaussytometrialla, ja tyypilliset FACS jälkiä näkyvät vasemmalla. Suhde GFP

+ -painiketta DsRed

+ soluja käytettiin mittana korjaus tehokkuutta.

Menimme lisäaskel arvioida vaikutuksia RD on NHEJ ja HR käyttämällä

in vivo

määrityksissä on kuvattu Dr. Gorbunova [25,26]. Toteamiseen NHEJ aktiivisuuden, reportteri GFP tuotetaan kun NHEJ on aktiivinen korjata DSB: ihin aiheuttama entsyymidigestiolla (kuvio 4C). Toteamiseen HR, onnistuneen geeni tulostapahtumia voi muodostaa uudelleen aktiivisen GFP-geeni korjaamalla entsyymi-tuotettu DSB (kuvio 4C, b). Sen jälkeen, kun on käsitelty RD 24 tuntia, PC-3-solut kotransfektoitiin entsyymin I-Scel-pilkottu toimittaja kasetti NHEJ tai HR ja DsRed plasmidi normalisoida transfektion tehokkuutta. Korjaus I-Scel aiheuttama tauot johtaa ulkonäkö GFP

+ soluihin [26]. Transfektion jälkeen solut analysoitiin virtaussytometrillä, ja suhde GFP

+ ja DsRed

+ soluja käytettiin mittana HR tai NHEJ tehokkuutta. Kuten kuviossa 4D, GFP-signaali merkittävästi vähentynyt joko NHEJ tai HR korjaus- käsitellyissä soluissa RD, mikä osoittaa, että DSB korjaus oli heikentynyt vastauksena RD. Yhdessä data osoitti, että RD kykeni estämään NHEJ ja HR, ja tukahdutti DSB korjaus PC-3-solut.

RD downregulates DNA korjaus proteiinit PC-3-solujen

Perustuu havainnot edellä, me selvensi roolia Ku70 /Ku86 vastauksena RD aiheuttama DNA-vaurioita. Inkuboinnin jälkeen solujen RD eri ajanjaksoilta, Ku86 lisääntyi ja saavutti 4h, sitten laski nopeasti jopa 48h, kun taas Ku70 pysyi muuttumattomana vuoteen 12h ja laski sen jälkeen (kuvio 5A). DNA end sitova aktiivisuus Ku70 /Ku86 näkyy, että verrattuna käsittelemättömistä soluista, sitovat toimet sekä Ku70 /Ku86 käsitellyissä solut tasaisesti tehostettu jopa 4h ja väheni sitten loput altistuksen aikana (kuvio 5B), vastaa tuloksia, kuviossa 5A. Lisäksi olemme vahvistaneet annoksesta riippuva estovaikutus RD ilmenemistä ja sitova aktiivisuus Ku70 /Ku86 4h ja 12h hoitoja (kuvio 5C, 5D). Lisäksi qPCR analyysit osoittivat, että DNA: n korjaukseen liittyvä

RPA1-3

,

XRCC5

,

XRCC6

, ja

MSH6

oli vaimentua mukaan RD (kuvio 5E ). Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että RD alentunut DNA: n korjautumista vasteena DNA-vauriolle.

ja

C

, Analyysi ilmauksia Ku70 ja Ku86 ydin- proteiinien western blot -määritys.

B

ja

D

, analysointi DNA end sitova aktiivisuus Ku70 tai Ku86 PC-3-solut altistettiin RD. *, P 0,05, merkittävä ero kontrollista.

E

, Heatmap mRNA tasoja DNA: n korjaukseen geenien RD käsiteltyjä soluja, jotka määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR. Punainen: yli-ilmentyminen, vihreä: alle-ilmaisu, musta: muuttumaton lauseke, harmaa: ei havaita.

RD laukaisee apoptoosin liittyvät induktioon DNA-vaurioita PC-3-ksenografti

Voit selvittää RD voivat aiheuttaa tuumorisolujen apoptoosin kautta induktion DNA-vaurion

in vivo

, havaittuna viljellyissä soluissa, ihmisen PC-3 -ksenografteja kehitettiin nude-hiirissä. Anto RD ei ollut merkittävää vaikutusta joko perus- tai lopull painoa on kasvain verrattuna lumeryhmään (kuvio 6A). Sen jälkeen 20d hoitoja, kasvaimia, jotka johtuvat kontrollieläimistä johti tappamisen kaksi eläimille koejakson, kun taas kasvainten RD-käsiteltyjen hiirten oli merkitsevästi pienempiä (kuvio 6B), mikä osoittaa merkittävää kasvaimen kasvua estävän vaikutuksen RD. Hidastanut kasvaimen massan RD käsitelty-hiirissä havaittiin myös (kuvio 6C). Muutokset molekyylimarkkereiden liittyy DNA-vaurioita käsitellyissä hiirissä näytetään, että RD aiheuttanut DNA-vaurioita vastaus kautta ATM /ATR-välitteisen signaloinnin osoituksena huomattava kertyminen γH2AX kumoamiseen fosfori-BRCA1 ja Ku70 /Ku86 runsauden (kuvio 6D ja 6E ), vastaa tuloksia, viljelmässä soluissa. Samaan aikaan, RD välittämää muutoksia ilmaisuja on PP2A perheenjäsenten olivat samanlaisia ​​havaintoja esitetään viljelmäsoluja. Lisäksi verrattuna lumelääkettä, kumota Bcl-2, kertyminen Bax, ja lohkaisu PARP näkyivät RD-käsitellyissä hiirissä (kuvio 6D). TUNEL määritys tukivat myös havaintojen apoptoottisia soluja lausutaan RD-käsitellyissä hiirissä (kuvio 6F a ja b). Tiedot osoittivat, että RD laukaisi DNA-vaurioita ja heikentynyt korjaus proteiineja, mikä johtaa apoptoottisen solukuoleman, mikä osaltaan sen antituumorivaikutus.

–

C

, vaikutus RD kasvaimen kasvua ja kehon painon nude-hiirissä.