Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

On tunnettua, että mitokondriot tärkeä rooli tietyissä syövissä (eturauhas-, munuais-, rinta-, tai kolorektaalisyövän) ja sepelvaltimotauti. Nämä soluelimiin on keskeinen rooli apoptoosin ja reaktiivisten happiradikaalien; Lisäksi mtDNA paljastaa myös historian väestön ja muinaisten ihmisten muuttoliike. Kaikki nämä tapahtumat ja vaihtelut mitokondrioiden genomin ajatellaan aiheuttavan joidenkin syöpien, kuten eturauhassyövän, ja myös auttaa meitä ryhmään yksilöt yhteinen alkuperä ryhmiin. Tavoitteena tässä tutkimuksessa on analysoida haploryhmissä ja vaihtelut sekvenssissä mitokondrion genomissa Etelä-Euroopan väestö koostuu kohteiden (n = 239) ja ei-vaikutti (n = 150) tapauskohtaiset eturauhassyöpää.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Käyttämällä alukkeenpidennysmenetelmiä analyysin ja DNA: n sekvensointi, tunnistimme yhdeksän suuren eurooppalaisen haplogroups ja CR polymorfismit. Taajuudet haplogroups ei ollut eroa potilaiden ja ohjaus ikäluokat, kun taas CR polymorfismi T16356C oli merkittävästi suurempi potilailla, joilla PC kontrolleihin verrattuna (p = 0,029). PSA, lavastus, ja Gleason pisteet olivat yhteydessä yksikään yhdeksän suuren eurooppalaisen haplogroups. CR polymorfismit G16129A (p = 0,007) ja T16224C (p = 0.022) olivat merkitsevästi yhteydessä Gleason pisteet, kun taas T16311C (p = 0,046) oli yhdistetty T-vaiheessa.

Päätelmät ja merkitys

Meidän tulokset eivät viittaa siihen, että mtDNA haplogroups saattaisivat liittyä satunnaista eturauhassyövän etiologian ja patogeneesin kuin aiemmat tutkimukset suoritetaan keskellä Euroopassa väestö. Vaikka joitakin merkittäviä yhdistyksiä on saatu tutkimalla CR polymorfismien, lisätutkimuksia tulee suorittaa vahvistaa nämä tulokset.

Citation: Álvarez-Cubero MJ, Saiz Guinaldo M, Martínez-González LJ, Álvarez Merino JC, Cózar Olmo JM, Acosta JAL (2012) Mitokondrioiden Haplogroups ja polymorfismit Paljasta Ei Assosiaatio Sporadic Eturauhassyöpä on Etelä-Euroopan Population. PLoS ONE 7 (7): e41201. doi: 10,1371 /journal.pone.0041201

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, United States.of Amerikka

vastaanotettu: 27 helmikuu 2012; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 17 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Álvarez-Cubero et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmistä syövistä diagnosoidaan miehillä. Eturauhassyöpä esiintyvyys on ominaista suuri maantieteellinen vaihtelevuus, vaihdellen muutamia tapauksia (noin 4-7 per 100000) Aasian maissa 70-100 tapausta 100000 Pohjoismaissa Euroopan maissa ja Pohjois-Amerikassa. Italiassa ja Espanjassa, hinnat ovat melko alhaiset verrattuna luokkaa kuin muissa länsimaissa ja ovat alhaisin Euroopan unionin (EU) maat [1], [2]. Kuitenkin vain harvat ratkaisevaa ole tehty osalta genetiikkaa tämä syöpä. Jotkut sidoksen tutkimukset [3] ascribe tärkeä tehtävä geenien kuten ELAC2 (ELAC homologi 2 (E. coli)) klo 17Q, RNASEL klo 1q24-25 (Perinnöllinen eturauhassyöpä geeni 1 (HPC1)) [4], ja MSR1 ( makrofagi sieppaajareseptori 1) klo 8p22, jotka sisältävät inaktivoivat mutaatiot vaikuttaa jäseniä vähintään yhden eturauhassyöpää perhe. Kuitenkin muut tutkimukset eivät ole vahvistaneet yhdistysten nähnyt joitakin näistä geeneistä. Tämä on asian laita ei ole yhdistyksen välillä eturauhassyövän ja RNASEL (2 ’, 5’-oligoadenylaatti riippuvainen RNaasi L) geeni Ruotsin väestöstä [5]. Tilanne on vieläkin monimutkaisempi satunnaista eturauhassyövän, jossa, koska sen geneettinen heterogeenisyys, on ehdotettu, että monet geenilokusten, pikemminkin kuin yksittäisen tiettyä geeniä, jotka osallistuvat taipumusta tämä syöpä [6]. Kaksi erilaista mutaatiota löytyy syöpä. Somaattisista mutaatioista esiintyy yhden solun kehittämisessä somaattisessa kudoksessa. Reaktiivisten hapen lajien (ROS) aiheuttaa mutaatioita mitokondrioiden somaattisten solujen. Sen sijaan, siemennestettä mutaatioita esiintyy sukusolujen ja voidaan siirtää seuraavalle sukupolvelle, koska tässä tutkimuksessa [7]. Mutaatiot mtDNA (mitokondrio-DNA) on osoitettu täyttävät kaikki kriteerit, joita vaaditaan patogeenisten mutaatioiden aiheuttavat eturauhassyövän [8]. Jotkut mutaatiot ovat COI (sytokromi c oksidaasi) [8] tai COX7A2 (sytokromi c oksidaasi alayksikköä VIIa polypeptidi 2) [9] geeni, ja jotkut mutaatiot liittyvät suoraan tunnettujen haplogroups mukana yhdistyksen välillä mtDNA varianttien ja monimutkainen sairaudet, kuten munuaisten ja eturauhassyövän [10]. On ehdotettu, että mitokondrion mutaatiot voidaan jakaa kahteen tyyppiin: adaptative ja tuumorigeenisiä (ei-adaptative). Adaptative mtDNA mutaatioita ovat lievempiä mutaatioita havaittiin eri populaatioissa [11]. Tuumorigeenistä mutantteja sisältävät mutaatioita kuten heteroplasmic insertiot ja deleetiot [11]. Mutaatiot eri syöpien on havaittu sekä ei-koodaavan ja koodaavat alueet mtDNA, mutta suurin osa mutaatioita tunnistettiin on kuvattu D-silmukka-alue (ei-koodaava alue). Deleetioita, insertioita D-silmukka-alueen ja siirtymät on havaittu rinnan, hepatosellulaarinen ja peräsuolen syöpä mtDNA poistot kuten mtDNA4977 on tunnistettu eturauhassyövän [12] – [14] ja jopa jotkut mtDNA mutaatioita liittyy lisääntynyt seerumin PSA [15], [16].

erityinen vaikeuksia ymmärtää syitä eturauhassyövän johtuvat heterogeeninen taudin luonne, sen tuntematonta alkuperää, ja se, että monet geenit mukana on useita muunnelmia keskuudessa populaatiot, vaikuttaa huomattavasti ympäristötekijät keskuudessa väestön, ja suuri rooli ympäristövaikutuksista [17] – [19].

tavoitteena läsnä oli vertailla taajuudet mtDNA haplogroups ja CR ( säätelyalue) polymorfismit 239 potilaalla on satunnaista eturauhassyöpä niille 150 terveillä verrokeilla Lounais Euroopassa, kuten aiemmin tehty Koreassa [20] ja Lähi Euroopan valkoihoiset [21].

tulokset

yhdeksän suuren eurooppalaisen mtDNA haplogroups ja CR polymorfismien analysoitiin koko verinäytteissä 239 potilaalla on satunnaista eturauhassyöpä ja verrattiin 150 verrokkeihin ilman familiaalinen sairastaneet patologian. Lisäksi valvonta varmistettiin normaali PSA-arvoja veressä alle 4 ng /ml, sekä normaali peräsuolen kosketus. Kliininen ominaisuudet potilaiden ja verrokkien on esitetty taulukossa 1.

mtDNA Haplogroup Distribution potilailla, joilla on satunnaista Eturauhassyöpä

taajuudet mitokondrioiden haplogroups ei eronnut merkitsevästi potilaiden eturauhasen syöpä ja verrokeilla (taulukko 2).

Nämä yhdeksän pääasiallista haplogroups verrattiin myös espanjalaisen mitokondrioiden haploryhmä jakelu, kuten voidaan nähdä kuvassa 1.

CR polymorfismit Potilaat, joilla on satunnaista Eturauhassyöpä

mitokondrioiden CR sekvensoitiin ja analysoitiin välillä nukleotidiasemien 16024 ja 16365 (taulukot S1 ja S2). Sata kaksikymmentäneljä homoplasmic polymorfismien ja heteroplasmic polymorfismi (16169Y) löytyi joukosta 389 aiheita verrattuna tarkistetun Cambridge referenssijaksoa [22]. Niistä 125 polymorfismien havaittu, 13 ei ollut lueteltu ihmisen mitokondrioiden Genome Database [23], ja 1 oli kumpikaan luetellut MITOMAP [24] eikä ihmisen mitokondrioiden Genome Database [23].

Kahdeksantoista 125 CR polymorfismien havaittiin taajuudella ≥4% joko satunnaista eturauhassyöpä tai kontrolliryhmän (taulukko 3). Nämä altistettiin edelleen tilastollinen analyysi. Yksi heistä, 16356C (p = 0,029) havaittiin olevan huomattavasti korkeampi taajuus, jos potilaalla on satunnaista eturauhassyöpä kontrolleihin verrattuna. Toinen polymorfismi, 16278T on p-arvo 0,051 (taulukko 3). Kuitenkin merkitys oli kadonnut korjauksen jälkeen useita vertailuja Bonferroni analyysin merkittävyystasolla 0,0004 tarvitaan.

kytkentäepätasapaino- analyysin tulokset osoittavat, että jotkut CR polymorfismit olivat poissa tasapainosta (p = 0,05); standardoitu epätasapainoon arvot on esitetty taulukossa S3. T16356C korvaaminen liittyy potilailla (p = 0,029) liittyy A16183C ja T16189C (p 0,05). Mutaatio C16278T (p = 0,051) liittyy C16069T, T16126C, T16172C, T16189C, ja C16223T (p 0,05).

Analyysi Kliininen parametrit

analysoitiin myös suhdetta kliinisten parametrien liittyy kasvaimen invasiivisuus ja etenemiseen (PSA tasot, Gleason pisteet, ja T-vaihe) ja haplogroup frekvenssi, sikäli kuin CR polymorfismi.

Kun viisi yleisin haplogroup frekvenssi verrattiin tärkein kliininen parametrit voidaan diagnosoida eturauhassyövän (PSA-tasot, Gleason, ja T-vaihe), ei ole merkitystä havaittu eroja keskuudessa eturauhassyövän potilailla (dataa ei esitetty). Lisäksi kun kliininen parametrit jaettu ryhmiin: PSA-arvot (≤4.0, 4,1-10, 10,1-20, 20, 1000), Gleason pisteet (2-6, 7, 8-10), ja T -vaiheessa (A, B, C, D), yksikään haplogroups oli tilastollisesti merkitsevä (taulukko 4).

Kun analysoidaan CR polymorfismien ja kliinisten parametrien potilaiden joukossa, vain merkittäviä eroja havaittiin Gleason pisteet ja T-vaiheen. Variantti G16129A havaittiin 8,79%: lla potilaista, joilla on Gleason välillä 2-6, 0,42%: lla potilaista, joilla on Gleason pisteet 7 ja 0,42%: lla potilaista, joilla on Gleason 8-10 (p = 0,007). Myös mutaatio T16224C todettiin 3,76%: lla potilaista, joilla on Gleason pisteet 2-6, ja 2,09%: lla potilaista, joilla on Gleason pisteet 7 ja 0,41%: lla potilaista, joilla on Gleason 8-10 (p = 0,022). T16311C korvaaminen saavutti merkitystä verrattuna neljän T-vaiheen luokat: 1,67% potilaista luokkaan A, 9,21% B, 1,67% C, ja 1,67% D (p = 0,046).

keskustelu

Ihmisen mitokondrio-DNA on laajalti käytetty välineenä monilla aloilla, kuten kehittyvä antropologia ja väestön historia, lääketieteellinen genetiikka, geneettinen sukututkimus, ja rikosteknisen tutkimuksen [25]. Päätehtävänä mitokondrioita liittyvät pahanlaatuisuuden ja syöpäbiologian johtuu todennäköisesti niiden keskeisten funktio sukupolven ATP ja apoptoosin säätelyyn [8]. Koska mutatoituvan voimakkaasti 1,1 ke ei-koodaava ohjaus alue (16024-576), joka on noin kymmenen kertaa suurempi kuin mutaatio korko on 15,5 kb koodausalue (emäkset 577-16023) [26], ei- koodaava alue on suhteellisen rikastettu sekvenssin vaihtelua, ja haploryhmä tiedot voidaan saada tältä alueelta. Nämä haplogroups ovat liittyneet joitakin onkologian sairauksia, kuten rinta-, paksusuolen ja peräsuolen, ja kilpirauhasen [27] syöpä, sekä muut sairaudet, kuten aidsin [28].

yleisin Haploryhmä tässä potilasryhmässä on H (45,6% potilailla ja 42,7% kontrolleissa), joka on myös yleisin Occidental Euroopassa. Olemme myös erottaa kahdeksan muuta tärkein haplogroups löytyy Euroopan väestöstä (I, U, K, J, T, W, X, ja V) [29], ja vähemmistö prosenttiosuudesta, haplogroups D, F, L, M, N, O, P, ja R. Kuten voidaan nähdä tiedoista, haplogroups H, U, ja W olivat yleisempiä potilailla kuin kontrolleilla, kun taas haplogroups I, J, ja K havaittiin kontrolleihin ( Taulukko 2). Siitä huolimatta ei ole merkittäviä eroja haplogroup frekvenssi potilaiden välillä satunnaista eturauhassyöpä ja verrokeilla voitaisiin löytää, kuten myös raportoineet Mueller et al. [21], joka suoritti tapauskontrollitutkimuksessa 304 potilasta, joilla on eturauhasen syöpä Keski-Euroopassa. Kuitenkin tutkimuksen pohjoisamerikkalainen väestö Euroopan jälkeläisen raportoitu kohonnut läsnäolo haplogroup U Eturauhaskarsinoomapotilailla [10]. Yksi rajoituksista Tutkimuksemme on rajoitettu otoskoko (239 potilasta ja 150 ohjaa).

Vertaamalla haplogroups tässä tutkimuksessa, että Espanjan väestöstä [30], prosenttiosuudet mitokondrioiden haplogroups Espanjassa olivat havaittiin olevan hyvin samanlainen kuin tulokset, jotka saatiin meidän analyysissä (46,53% H, 19,10% U, 9,03% T, 7,29% J, 5,56% K, ja 1,74% I) (kuvio 1).

huomioon kliininen ominaisuus analyysi, ei havaittu yhteyttä välillä mitokondrioiden haploryhmä ja ikä, PSA seerumin, Gleason pisteet, tai T-vaihe. Kuitenkin, kun kaikki kliiniset ominaisuudet luokiteltiin, ei havaittu yhteyttä mihinkään haplogroups johtuu siitä, että rajoitettu määrä osallistuneista potilaista ei ollut tarpeeksi tilastollista analyysia pienissä alaryhmissä. Kuitenkin korkein PSA-arvot (10,1-20, 20, ja 1000) ja Gleason tulokset (7 ja 8-10), ja lisääntynyt osuudet T-vaiheen C havaittiin potilailla, joilla on haplogroups H ja U ( taulukko 4).

SNP D-silmukka-alue on tarkasteltu muissa elimissä (haiman, rinta-, tai melanooma, muun muassa) [31] – [33], koska ennustaja tekijät syöpäriskiä. Tästä syystä vertasimme myös CR sukusolujen polymorfismit mtDNA satunnaisissa eturauhassyöpäpotilaille.

T16356C variantti on aiemmin liittyvät glioblastoma [34] ja rintasyöpä. Rintasyövän, se on otettu, kuten sukusolujen sekvenssin vaihtelu [35]. Sisäpuolella eturauhassyöpä kohortin T16356C mutaatio osoitti merkitsevästi koholla taajuuksia eturauhassyöpäpotilailla kontrolleihin verrattuna (p = 0,029). C16278T polymorfismi on myös aiemmin syöpään liittyvät, erityisesti rintasyövän Tan et ai. [35], sekä neuro- tyypin 1 [36], sekä muut sairaudet, kuten Parkinsonin tauti [37]. Keskuudessa eturauhassyövän aiheita, olemme myös löytäneet lähes merkittävästi kohonnut taajuuksia eturauhassyöpäpotilailla kontrolleihin verrattuna (p = 0,051). On kuitenkin epäselvää, ovatko nämä polymorfismit voivat olla mukana kasvainmuodostusta tai etenemisen tai kehittämiseen muiden edellä mainituista sairauksista.

A16183C polymorfismi on perustettu MITOMAP [24] tai ihmisen mitokondrioiden Genome Database [23] liittyvän eturauhassyövän taudin [11], [38]. Kuitenkin meidän kohortin emme löytäneet Merkitsevä yhteys tämän polymorfismin ja taudin (p = 0,428). Analyysissä suoritetaan Jeronimo et ai., Kannan 16183 on kuvattu mitokondrion mutaatio eturauhassyövän muutos A → G [38]; tutkimukset suoritetaan Makiko et al. on liittynyt tämä polymorfismi keuhkosyöpään potilaille [39].

analysoi myös kliinisten parametrien onko CR polymorfismien potilaan kohortin korreloivat sairauden aggressiivisuus. G16129A ja T16224C polymorfismien havaittiin olevan yhteydessä vähemmän aggressiivisia Gleason tulokset (2-6) [40], jossa tulokset lähinnä 2 vähiten aggressiivinen ja ne vieressä 10 kaikkein aggressiivinen [41]. G16129A korvaaminen on kuvattu kilpirauhassyöpä ja yhdessä T16362C, voisi olla vaikutusta mtDNA replikaatioon ja /tai transkriptio, samoin lisäämiseen riskiä kilpirauhassyövän [27]. Sitä vastoin T16224C mutaatio on kuvattu potilailla, joilla on melanooma ihosyöpä, mutta ei yhdessä tauti on todettu [42]. Analysointiin tuloksemme, ei ole vahvaa suhteessa voitu määrittää, koska Gleason pisteet prosenttiosuudet tämä muunnelma ovat kaikki alle 5%. T16311C variantti löydettiin tiheämmin potilailla, joilla on T-vaiheen B (tunnetaan myös nimellä vaihe II), joka sisältää syöpiä, jotka eivät ole levinneet ulkopuolella eturauhasen (paikallinen syöpä) [43], [44]. Tämä polymorfismi on aiemmin kuvattu Chen et al. [45] kun mtDNA mutaatio havaittiin D-silmukka alueella uudisvaurioiden leikeltiin 16 eturauhasen yksilöitä, mutta ei tietoa kliinisiä piirteitä annettu; se on myös todettu olevan merkittävästi liittyvän paksu- ja peräsuolisyövän [46].

Koska vain CR ja mitokondrioiden haplogroups analysoitiin, mitokondrio koodausalue polymorfismien ei voida sulkea pois mahdollisimman liittyviä mutaatioita eturauhassyöpään [8], [47]. Somaattisista mutaatioista mitokondrioiden DNA (mtDNA) on tunnistettu erilaisissa kasvaimissa, mukaan lukien rintasyövän [48], okasolusyöpä [49], ja eturauhassyövän [15], [50]. Vuonna okasolusyöpä, ne liittyivät paremmin hengissä. Kuitenkin rintasyöpä somaattiset mutaatiot ehdotetaan olla kriittisessä roolissa syövän etenemisestä. Somaattiset mutaatiot ovat yleisiä tapahtumia eturauhassyöpää. Mutaatiot kartoitus mitokondrioiden tRNA, ribosomaalisen RNA: t, ja proteiinia koodaavan geenien voisi heikentää prosesseja, jotka tapahtuvat mitokondrion osastoon (esim transkriptio RNA käsittely ja kääntäminen) ja saattavat lopulta vaikuttaa oksidatiivisen fosforylaation [15]. Ituradan ja somaattiset mutaatiot on myös kuvattu potilailla, joilla on kohdun kohdun [51] ja eturauhassyövän [50], mutta siellä ei ole niin paljon tietoa näistä kuten somaattisten mutaatioiden syöpä. Tässä tutkimuksessa vain veren genomista DNA näytteet olivat saatavilla, eikä assosiaatioita somaattisten mutaatioiden voitaisiin määrittää.

Yhteenvetona meidän tutkimus vahvistaa, ettei yhdistyksen välillä mitään mitokondrioiden Haploryhmä ja satunnaista eturauhassyöpää.

Methods

Ethics lausunto

Tämä tutkimus noudattaa Helsingin julistuksen. Tietoinen suostumus saatiin kaikki aiheet ennen niiden tulivat tutkimukseen. Tutkimuksessa ja käyttö arkiston näytteet tämän projektin hyväksyttiin eettisen komitean University ”sairaalan Virgen de las Nieves,” Granada, Espanja.

Potilaille ja säätimet

Potilaat, joilla on satunnaista eturauhasen syöpä valittiin urologi, joka myös merkintätavat noin tärkeät parametrit eturauhassyöpään, kuten PSA, T-pisteet, Gleason pisteet, ja muut tiedot, kuten ikä, syntymäpaikka, ja suvussa eturauhassyöpää. Lyhyesti sanottuna sopivaa potilasta aikuiset miehet, joilla on äskettäin diagnosoitu eturauhassyövän (n = 239). Kliiniset piirteet potilaiden valittiin tutkimukseen oli histopatologisesti vahvistettiin ensisijainen adenokarsinooma jälkeen epänormaali seerumin PSA havainnot ja /tai alempien virtsateiden oireita. Meidän potilaat eivät liittyneet Euroopan miehiä, joiden keski-ikä oli 67,4 vuotta ja keskimääräinen Gleason pisteet 7,0, mikä osoittaa määräävä kasvumalli kasvain [52] – [54]. Terve etuyhteydettömille Euroopan miehet (n = 150) on saman maantieteellisen alueen, jolla ei ole ollut eturauhassyöpää otettiin kontrolleiksi (ei PSA tasot havaittiin ja kliininen kehitys muutamien vuosien seurasi välttää myös vaikuttanut miesten eturauhassyövän verrokkeina). Controls kuului samaan ikäryhmään kuin potilaat; ne kaikki olivat miehiä, joilla on terveysongelmia, kuten munuaisten lithiasis tai Androloginen ongelmia, joten PSA-analyysi suoritettiin erottaa mahdollisen eturauhassyövän. He kaikki ovat normaalit PSA-arvoja veressä alle 4 ng /ml, samoin kuin normaali peräsuolen kosketus. Tietoinen suostumus saatiin kaikista potilaista tässä tutkimuksessa, joka hyväksyttiin eettisen komitean sairaalassa. Perifeerisen veren näytteitä vedettiin kaikki osallistujat (n = 389), putkiin, jotka sisältävät K3-EDTA: ta.

DNA Extraction ja Genotyypin

Genominen DNA potilaiden ja verrokkien uutettiin perifeerisestä verestä käyttäen standardia orgaaninen uutto- fenoli /kloroformi /isoamyylialkoholia ja proteinaasi K, ja puhdistus Microcon® 100 suodattimien (Millipore). Mitokondrio-DNA sekvensointi ja haplotyypin suoritettiin käyttäen AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems), joka sisältää kaikki kemiallisten komponenttien, paitsi alukkeet ja templaatti, joka on tarpeen PCR: GeneAmp System 2400 lämpösyklilaitteessa. Kukin PCR-reaktio suoritettiin kokonaistilavuudessa 25 ui, joka sisälsi 1-2 ng /ul DNA: ta, 0,5 ui kutakin aluketta, joka kattaa HVI (nukleotidiasemat 16024-16365) alueella, ja 12,5 ui AmpliTaq Gold® PCR Master Mix ( Applied Biosystems). Monistusolosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C: ssa 11 min, jota seurasi 32 sykliä 95 ° C: ssa 10 sekuntia, 60 ° C 30 sekuntia, ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Amplikonien puhdistettiin käyttämällä Microcon® 100 suodattimien (Millipore). Sekvensointi suoritettiin käyttäen ABI PRISM® BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit. Kukin sekvensointi-reaktio suoritettiin kokonaistilavuudessa 10 ui, joka sisälsi 3 ui DNA: ta, 3 ui kutakin aluketta, 2 ui kit, ja 2 ui puskuria päässä ABI PRISM® BigDye Terminator V.3.1 kit. Lämpötilasyklit olosuhteet olivat 95 ° C 1 min, jota seurasi 25 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 50 ° C 1 sek, ja 60 ° C: ssa 2 min. Ylimääräinen väriaine terminaattori poistettiin geelisuodatuksen Performa ® DTR patruunat (EdgeBio) ja analysoitiin käyttäen automaattista DNA-sekvensserin ABI PRISM® 3130 (Applied Biosystems). Tulokset analyysin muokattiin käyttäen ABI PRISM® SeqScape® v.2.6 ohjelmisto.

Haplotyyppifrekvenssianalyysi lähdemerkintäratkaisut ja Tilastollinen analyysi

Haplogroups määritellään CR polymorfismien ja kaikki antaminen valikoima mitokondrion genomin voidaan käyttää haplogroup luokittelu, joka perustuu fylogeneettiseen vakautta mtdna polymorfismien. Tehtävänä on haplogroups näytteisiin suoritettiin käyttäen online-ohjelmisto mitokondrio-DNA, kuten Haplogroup Prediction Tool ”The Genographic Project” [55], Aplo haplogroup hakuun [56], ja mtDNA manager [57]. Lisäksi kaikki haplogroups tässä tutkimuksessa vahvistettiin Web-ohjelmia, kuten HaploGrep [58] ja Phylotree [25]. Saadut tulokset analysoitiin ja tarkistettiin asiantuntemusta henkilökohtaisen alueen läsnäolo tai puute joissakin asennoissa verrattuna viitaten järjestyksessä ja tarkistetaan käyttämällä viimeinen versio saatavilla Phylotree [25].

Tietokoneohjelmiston avulla SPSS v.15.0 [59], teimme tilastolliset analyysit, kuten χ

2 testiä, Fisherin testiä, Monte Carlo testaus, ja syntyy virhematriiseja. Taajuudet Kaikkien mitokondrioiden haplogroups ja CR polymorfismien eturauhassyövän potilaiden ja verrokkien testattiin itsenäisyys käyttämällä Pearson chi-square tilastoja ja Fisherin tarkka testi tarvittaessa. Nämä analyysit tehtiin testata itsenäisyyden välillä haplogroup datan ja kliiniset tiedot, kuten ikä (≤55, 56-60, 61-65, 65), Gleason pisteet (2-6, 7, 8-10) , T-vaiheessa (A, B, C, D), ja PSA-tasot (≤4.0, 4,1-10, 10,1-20, 20, 1000). Kaikki testit pidetään nimellisen tilastollisen merkittävyyden (p-arvo) on 0,05. Vain CR variantteja taajuudella ≥4% joko eturauhassyöpä tai verrokkiryhmässä altistettiin edelleen tilastollinen analyysi. Association of T16356C kanssa taudin ikä- vuoteen regressioanalyysimme. Analysointiin T16356C polymorfismin merkittävää p-arvo korjattiin useita vertailuja Bonferroni analyysi johtaa uuteen vaaditun merkitsevyystasolla 0,0004 (vertailujen lukumäärä = 125). Kytkentäepätasapaino- analyysi tehtiin kaikkien parien CR polymorfismien käyttää 10.000 askelia Markovin ketju ja 1000 dememorization vaiheita. D, D ’, ja r2 kertoimet laskettiin kanssa merkitsevyystasolla 0,05 käyttäen Arlequin v3.5 ohjelmisto [60].

tukeminen Information

Taulukko S1.

Ohjaus alue polymorfismien ja Haploryhmä luokittelu 239 potilaalla on satunnaista eturauhassyöpää.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041201.s001

(PDF) B Taulukko S2.

Ohjaus alue polymorfismien ja Haploryhmä luokittelu 150 säätimet satunnaista eturauhassyöpä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041201.s002

(PDF) B Taulukko S3.

Merkittäviä kytkentäepätasapaino- CR polymorfismien.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041201.s003

(PDF) B

Kiitokset

Kiitämme kaikkia lahjoittajia ja palvelu of Urology yliopiston ”sairaalan Virgen de las Nieves” (Granada, Espanja) tehdä tämän tutkimuksen mahdollista. Kiitämme myös Granadan yliopiston käyttöön asettamisessa koko ohjelmistopaketti käytetään analyysissa.