Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syöpätyyppien kehittyneissä maissa. Tunnistaa molekyyli- verkostoja ja biologisia prosesseja, jotka vapautettiin CRC verrattuna normaaliin paksusuolen limakalvolle, haimme Gene Set rikastus Analysis kaksi riippumatonta transcriptome aineistoja, mukaan lukien yhteensä 137 CRC ja kymmenen normaalin paksusuolen limakalvon näytteitä. Kahdeksankymmentäkaksi geenin sarjaa kuten kuvataan Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit tietokanta oli merkittävästi muuttunut geeniekspressio sekä aineistoja. Näihin sisältyy verkkoja liittyy solujen jakautumista, DNA huolto- ja aineenvaihduntaa. Niistä signalointipolkujen joilla tiedetään muutoksia keskeisten geenien ”Fosfatidyyli signalointiverkolla”, joka käsittää osan PI3K koulutusjakson, todettiin vapautettu. Vaimentua geenit tämän reitin kuului useita jäseniä fosfolipaasi C proteiini perhe, ja alennetun ilmaus kaksi näistä,

PLCD1

ja

PLCE1

, saatiin onnistuneesti validoitu CRC koepaloja (n = 70) ja solulinjat (n = 19) kvantitatiivisen analyysin. Tukahduttaminen Molempien geenien havaittiin liittyvän

KRAS

mutaatioita (

P

= 0,005 ja 0,006, tässä järjestyksessä), ja havaitsimme, että mikrosatelliittimerkkien vakaa karsinoomat alentunut

PLCD1

ilme useammin oli

TP53

mutaatioita (

P

= 0,002). Promoottori metylaatio analyysit

PLCD1

ja

PLCE1

suoritetaan solulinjoissa ja kasvainbiopsioissa paljasti, että metylaatio on

PLCD1

voi osaltaan vähentää ilmentymistä 40% microsatellite instable karsinoomat . Yhteenvetona olemme tunnistaneet merkittävästi vapautettu reittejä CRC, ja validoitu tukahduttaminen

PLCD1

ja

PLCE1

ilme. Tämä osoittaa, että GSEA lähestymistapa voi ohjata löytö uusien biomarkkereiden syövän.

Citation: Danielsen SA, Cekaite L, Ågesen TH, Sveen A, Nesbakken A, Thiis-Evensen E, et ai. (2011) fosfolipaasi C isotsyymien sääntely on purettu kolorektaalisyövässä – Insights saadut Gene Set rikastus Analyysi transcriptome. PLoS ONE 6 (9): e24419. doi: 10,1371 /journal.pone.0024419

Editor: Baochuan Lin, Naval Research Laboratory, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 20, 2011; Hyväksytty: 10 elokuu 2011; Julkaistu: 1. syyskuuta 2011

Copyright: © 2011 Danielsen ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat avustusta Norja Cancer Society (https://www.kreftforeningen.no/english) (RAL: no. PR-2006-0442, kuten PhD apurahoja SAD ja Tha; GEL: PR-2008-0163; RIS : PR-2007-0166), jota avustusta Research neuvoston Rikshospitaletin-Radiumhospitalet Health Enterprise (RAL: lukien tohtorin apurahan AS), jota avustusta Kaakkois-Norja terveydenhuoltopiirin (http: //www .helse-sorost.no /omoss /englanti /Sider /page.aspx) (RAL: PR-2009-093, mukaan lukien post doc avustus LC), ja avustusta Norja Foundation for Health and Rehabilitation (http: //www. extrastiftelsen.no/) kautta EXTRA varat (ETE: HF-52015/002). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Paksusuolisyöpä (CRC; MIM # 114500) on kolmanneksi eniten syövän esiintyvyys maailmanlaajuisesti kanssa arviolta 1,2 miljoonaa uutta tapausta vuodessa [1]. Mukaan American sekakomitean Cancer (AJCC) 5 vuoden eloonjäämisluvut potilaiden diagnosoitu vaiheessa I ja vaiheessa IV CRC, ovat 93% ja 8%: lla, mikä potilaan ennuste on erittäin riippuvainen kasvaimen vaiheessa diagnoosi [2 ]. CRC kehittyy selvä histopatologiset vaiheissa hyvänlaatuinen esiasteleesioita pahanlaatuisia kasvaimia, tunnetaan adenooma-karsinooma järjestyksessä. Kehitys ohjaa kasautumista geneettisiä ja epigeneettiset muutokset tiettyjen geenien, ja niitä ylläpidetään signalointi verkot, jotka aiheuttavat pleiotrooppisia vaikutuksia syöpäsolujen joutuvat usein. Tyypillisesti, pahanlaatuiset kasvaimet on tunnusomaista molekyylien fenotyypit mikrosatelliitti epävakaus (MSI), kromosomaalinen epävakaus (CIN) ja CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) [3]. Yleisimmin muuttunut geenejä aikana CRC kehitys muodostavat perustan näille fenotyyppien ja koskea useita signalointireitteihin ja verkot (kuvio 1A).

A) Keskeiset geenit suunnattu eri CRC fenotyypit aikana kehittämiseen esiasteleesioita ja karsinoomat . Geenit lihavoitu edustavat MAPK, PI3K, ja TP53 signalointi verkkojen ja niiden mutaatio asema on aiemmin määritetty [38]. B) Kuvassa näkyy, kuinka osa-inositoli verkko on vuorovaikutuksessa kanoninen PI3K koulutusjakso. Geenit joista mutaatiostatus tietoja käytetään yhdistyksen analyysien nykyisessä paperi ovat värillisiä sininen, vaaleanpunainen ja ruskea. Lyhenteet: GPCR, G-proteiiniin kytketty reseptori; RTK, reseptori tyrosiinikinaasin.

Lähetti-RNA (mRNA) ilmentyminen profilointi tutkimuksissa on lisätä ymmärtämystä roolit useiden geenien tärkeä taudin alkamisen ja etenemisen syövän, mukaan lukien CRC [4]. Kasvusta huolimatta tietämystä ilmentymismalleja yksittäisten geenien sekä lupaavia geeni allekirjoitukset, vähemmän oivallus on saavutettu korjauksilla molekyyli verkkojen ja signalointireitteihin suuresta määrästä dataa tällaisissa tutkimuksissa syntyneiden. Soveltamalla tilastollista lähestymistapaa Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) ja geenien ilmentyminen tietojen vuorovaikutuksessa geenit, joiden ilmentymistasot ovat koordinoidusti muutetaan voidaan tutkia [5]. GSEA menetelmä otetaan huomioon ilmaus kaikkien geenien selityksin varustettua geeniperimä /reitin. On olemassa useita tietokantoja ja geeni asettaa määritelmät yhdistää geenien toiminnallista merkintöjä. Yleisimmin käytetty on Gene ontologia (GO) tietokanta, joka perustuu yhdistelmään laskennallisten ja manuaalitoimeksiantolomakkeen geenien GO termejä [6]. Nämä termit eivät vastaa suoraan tiedossa polkuja. Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) on ​​rakenteisen tietokannan käsin kuraattorina ja päivitetään usein metabolinen, sääntelyyn, ja signalointireitteihin [7]. Käyttämällä tätä konservatiivisesti selityksin tietokannan redundanssia sisäkkäistä rakennetta geenin yhdistysten edustaa GO termejä voidaan välttää. Verrattuna yksittäisiin geenin ilmentymisen analyysit, GSEA antaa selvän käsityksen koordinoitua ilmentyminen muuttuu geenien sisällä polkuja, joten muuttunut signalointipolkujen ja geenien tässä ei tiedetä olevan osallisena karsinogeneesissä voitiin tunnistaa.

tärkeys kanoninen Fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) väylän syöpä on vahvistettu lukuisissa julkaisuissa viime vuosikymmenellä [8]. Tämä signalointiverkolla on vaikutus useisiin syöpää kriittinen fenotyypit, kuten solujen lisääntymisen, selviytyminen, aineenvaihduntaa, ja kasvaimen kasvu [8]. Haara verkon päällekkäinen Fosfatidyyli signalointia verkkoa, jota välittävät signaaleja fosfolipaasi C (PLC) proteiineja (kuvio 1 B). Tämä verkosto todennäköisesti ylikuulumisyhdistelmää kanssa MAPK ja TP53 kulkuväylillä tärkeitä reittejä CRC kehittämiseen. PLC proteiini perhe koostuu kolmestatoista isotsyymien jaettu kuuteen erilliseen alatyyppeihin, β, γ, δ, ε, ζ, ja η, rakenteen perusteella ja sääntelyn aktivointi mekanismeja. PLC-isotsyymien sisältävät useita yhteisiä verkkotunnuksia sekä alatyypin erityisaloilta, jotka voivat tehdä niistä kykenee säätelemään lipaasi-riippumaton reaktiot [9]. Lisäksi ne ovat liukoisia ja pääasiallisesti paikallinen sytosoliin, mutta tulee kulkeutua solukalvoon vasteena reseptorin aktivoitumisen [10]. Tällä kalvo ne hydrolysoituvat fosfatidyyli (4,5) fosfaatin (PIP

2) ja tuottaa tärkeitä toisiolähetiksi diasyyliglyserolia (DAG) ja inositoli 1,4,5-triphospate (IP

3). Epätasapaino fosfoinositidi tasojen (PIP

2 ja PIP

3) on osoitettu aiheuttavan puutteita kanavan aktiivisuuden, kaupan, ja normaalin solun polariteetti [9]. Siten oikea sääntely Fosfoinositidien mukaan esim. PLC entsyymejä on välttämätöntä ja poikkeava sääntely osallistuu erilaisiin ihmisen sairauksia, kuten syöpää [9].

Tutkimalla geenin ilmentymistä ennalta biologisten prosessien ja molekyylitason piirien kaksi CRC ja normaalin paksusuolen limakalvo aineistot saadaan käyttämällä erilaisia ​​microarray alustoille, luettelo reittejä muuttunut merkittävästi ero geeniekspression CRC todettiin. Valitsimme ”Fosfatidyyli signalointi verkko” ja kaksi vapautetuilla komponenttien siinä,

PLCD1

(HGNC: 9060) ja

PLCE1

(HGNC: 17175), yksityiskohtaisia ​​tutkimuksia ja verrattiin tuloksia kliinis data ja mutaatiostatus useiden geenien tiedetään muuttaa CRC.

tulokset

vapautettiin Kegg reittejä CRC

Kaikkiaan 152 Kegg geeni sarjaa olivat läsnä molemmissa geenien ilmentyminen aineistot. Näiden, GSEA paljasti 33 merkittävästi voimistunut ja 49 merkittävästi vaimentua biologisia prosesseja ja reittejä CRC verrattuna normaaliin paksusuolen limakalvon (

P

≤0.05; kuvio 2). Yksitoista merkittävästi muuttunut verkoissa oli päinvastainen rikastamiseen tulokset välillä aineistoja, kun taas 44 todettiin merkittävästi muuttuneet vain yksi aineistot. Kegg verkot merkittävästi vapautettiin CRC verrattuna normaaliin limakalvoon sekä aineistot on esitetty taulukossa S1 (n = 82). Se, että nämä reitit olivat huomattavasti muuttunut (

P

≤0.05) kahdessa itsenäisesti analysoida aineistoja, saada eri microarray alustoille, antaa riski vain 1/400 kunkin väylän sisällytetään merkittävästi muuttunut pelkästään sattumalta. Näin ollen, ei ylimääräisiä korjausta useille testaus suoritetaan (tämä selittää myös yläosan taulukko 1). 82 verkkoja ovat geenin sarjaa vastaavan syöpäsolun piirteitä, eri aineenvaihdunnan piirien sekä enemmän tunnettu signalointikaskadien kuten TP53 ja MAPK polkuja. Käyrät geeni-ilmentymisen tasot CRC näytteissä

vs.

on normaalia koolonin limakalvoa yksilöiden kaikkien geenien kolme kaikkein ilmen- tymisen lisääntymisen ja kolme kaikkein vaimentua verkkojen CRC on esitetty kuviossa S1, ja niiden tilastollisesti differentiaalisesti ilmentyvien geenien lueteltu Taulukko S2.

Kuvassa näkyy, että tulokset GSEA olivat hyvin toistettavissa 33 ja 49 polkuja yhdessä ylä- ja vaimentua poikki kaksi aineistoja, vastaavasti.

”Fosfatidyyli merkinantojärjestelmän”

”Fosfatidyyli merkinantojärjestelmän” oli yksi molekyyli polkuja todettu vaimentua CRC verrattuna normaaliin limakalvolle,

eli

ottaa enemmän vaimentua kuin ilmen- tymisen lisääntymisen geenejä. Yhteensä 22/59 ja 27/76 geenien kulkee laatukriteerit merkittävästi vapautettiin CRC AB ja HuEx aineistoja, vastaavasti (kuvio 3, taulukko 1). Niistä 11 geenit löytyy vapautettiin molemmissa sarjoissa, jotka käsittävät inositoli kinaasien, diasyyliglyseroli- kinaasien, ja fosfolipaasit, kaksi oli merkittävästi voimistunut, kun taas yhdeksän oli vaimentua. Mielenkiintoista, löysimme neljä vaimentua lipaasit (

PLCD1

,

PLCD3

,

PLCE1

, ja

PLCG2) B, jotka liittyvät läheisesti isotsyymien kuuluva Phospholipase C (PLC) perheen proteiineja.

PLCD1

ja

PLCE1

, kaksi PLC geenit ”Fosfatidyyli opastinjärjestelmästä” merkittävimmin vaimentua verrattuna normaaliin limakalvon näytteitä HuEx ja AB aineistoja, vastaavasti, valittiin lisävalidointia .

Kaikkiaan 38 geenien ”Fosfatidyyli opastinjärjestelmästä” muutettiin yhdessä tai molemmissa aineisto, yksitoista geenit löydettiin vapautettiin sekä kautta aineistoja.

validointi

PLCD1

ja

PLCE1

mRNA ilmaisu

Vuodesta kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR,

PLCD1

ja

PLCE1

selvästi tukahdutettu syöpäkudoksessa näytteissä verrattuna normaaliin limakalvo (

P

= 3 x 10

-16 ja

P

= 4 x 10

-15), mikä vahvistaa downregulation löytyy microarray ekspressiotietojen (kuva 4) . Kaikki yhdeksäntoista analysoitu koolonsyöpäsolulinjaa näytetään myös merkittävä tukahduttamisesta kahden geenin verrattuna normaaliin limakalvo (

P

= 2 x 10

-10 ja

P

= 1 x 10

-8).

ekspressiotasot

PLCD1

ja

PLCE1

CRC ja koolonsyöpäsolulinjoissa arvioitiin RT-PCR: llä olivat merkittävästi vaimentua verrattuna normaaliin paksusuolen limakalvo.

PLC

ilmaus arvot liittyvät geneettiset ja kliinis muuttujien

Mielenkiintoista oli vahva yhdistysten välillä heikkoa ilmentymistä sekä

PLCD1

ja

PLCE1

ja

KRAS

mutaatioita CRC näytteistä (taulukko 2). Lisäksi vähensi ekspressiotasot

PLCD1

liittyi merkittävästi

TP53

mutaatioita ja MSS fenotyypin. Sekä PLC geenien ilmentyminen pitoisuus väheni kehittyneempää tautien vaiheissa. Expression arvot

PLCE1

pieneni II vaiheessa (

P

= 0,06) ja laski merkittävästi vaiheessa III kasvaimet (

P

= 0,005) verrattuna vaiheeseen I kasvaimia . Kuitenkin tämä ei ollut kaukaisten etäpesäkkeitä (vaihe IV). Sama suuntaus oli nähtävissä myös

PLCD1

, jossa ilmaisun tasot olivat merkittävästi vähentynyt vaiheessa III verrattuna vaihe I (

P

= 0,03). Ei esiintynyt eroja

PLCD1

ja

PLCE1

ilmaisun ja mutaatioita

BRAF

,

PIK3CA

tai

PTEN

. Taulukkoon 2 on huomattava, että koska useita testaus (n = 16), on olemassa riski väärien merkitseviä.

Promoottori metylointianalyysi

PLCD1

ja

PLCE1

PLCD1

ja

PLCE1

voisi olla tavoitteita promoottori metylaation koska niiden ekspressiotasot olivat alhaiset CRC verrattuna normaaliin paksusuolen limakalvon näytteitä. Molemmat geenit hallussaan CpG saaria niiden promoottorien ja niiden ilmaisun tuli yläreguloituja solulinjoissa käsitelty epigeneettisellä reaktivoiville aineille (5-atsa-2’deoxycytidine, AZA ja Trichostatin A; TSA). Täydellinen tai osittainen metylaatio

PLCD1

promoottorin todettiin 79% (15/19) ja paksusuolen syövän solulinjat, havaitaan sekä laadun että kvantitatiivinen metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio (MSP ja qMSP, vastaavasti ). Loput neljä solulinjat olivat täysin metyloitumaton. Metylaatiostatuksen paksusuolen syövän solulinjoissa vahvistettiin bisulfiitti-sekvensoinnilla käyttämällä kaksi ei-päällekkäistä sarjaa alukepareja, jotka kattavat yhteensä 69 CpG sivustoja. Ei ollut yhdistyksen välillä metylaatio ja MSI-asema solulinjoissa. Ensisijaiset karsinoomat, vain yhdeksän 70 (13%) näytteistä metyloitiin, arvioimana MSP ja qMSP. Suurin osa kasvaimista pidetään positiivisena metylaation näkyy pieni PMR-arvot (mediaani 5,69). Mielenkiintoista, kahdeksan yhdeksästä metyloitua kasvaimet olivat MSI tuottaen metylaation esiintymistiheys on 40% (8/20) tässä alaryhmässä. Lisäksi kaikki metyloitua MSI kasvainten oli mutaatioita

BRAF

, kun taas metyloitu MSS kasvain oli villityypin. Sillä

PLCE1,

vain yksi 19 koolonsyöpäsolulinjoissa osoitti promoottorin metylaation. Tämä vahvistettiin bisulfiitti sekvensoimalla kattavat 47 CpG sivustoja. Alhaisen

PLCE1

promoottori metylaatio taajuuden joukkoon solulinjoja, kudosnäytteitä ei suoritettu metyloinnin analyysejä.

Keskustelu

Tutkimalla geenien ilmentymisen sisällä ennalta molekyyli reittejä kaksi riippumatonta CRC transcriptome aineistoja, olemme tunnistaneet useita molekyyli- verkostoja ja komponentit siinä, että sääntely on purettu CRC ja saattavat edistää syövän syntymistä.

”Cell cycle” ei yllättävää laajimmin muunneltu geeni asettaa analyysimme. Sen asianmukainen sääntely on tärkeää varmistaa oikea siirto geneettisen informaation yhdeltä sukupolvelta näin vapautuminen useiden solukierron komponentit määritellään syövän tunnusmerkkejä. Meidän havainto on linjassa useiden vertailukelpoisten tutkimusten CRC jossa geenin sarjaa koske pelkästään syöpään liittyvien reittien [11] ja useita online-tietokantojen käsittää yleisempiä reittejä, on tutkittu [12] – [14]. CRC näkyy ilmentymisen muutoksia lukuisissa metaboliareitit,

eli

”Oksidatiivinen fosforylaatio” oli kaikkein merkittävästi vaimentua metabolisen laajuiseen molemmat aineistoja, kun taas metabolia puriinien, pyrimidiinien ja N-glykaanien, lisäksi ”Pentoosi fosfaatti polku ”oli voimistunut. Puriini ja pyrimidiini aineenvaihdunta oli äskettäin löydetty voimistuvan myös adenoomien verrattuna normaaliin limakalvo, mikä osoittaa, että korjauksilla nämä verkot ovat varhainen tapahtumia kasvainten synnyssä [14]. Uudelleenohjelmointi energia-aineenvaihdunnan hiljan nousevana tunnusmerkki syöpä, ja havainnot ovat myös yhtä mieltä siitä, mitä Otto Warburg kuvattu puoli vuosisataa sitten, kutsutaan ”Warburg vaikutus”. Hän tunnisti muutos glukoosiaineenvaihdunnan välillä oksidatiivisen fosforylaation aerobinen Glykolyysivaiheen kasvainsoluissa [15]. Rajoittaminen aineenvaihdunta pitkälti glykolyysistä sallii muuntamisen glykolyyttisten välituotteiden osaksi nukleosidit ja aminohappoja. Tämä puolestaan ​​helpottaa biosynteesissä makromolekyylien ja soluelimiin tarvitaan tuotannon kasvu uusien solujen. Biologiset prosessit, joihin liittyy DNA: n replikaatiota ja erilaisia ​​DNA korjausmekanismit havaittiin myös vapautettiin meidän aineistoja. Nämä perustavaa laatua järjestelmät ovat usein laittaa poissa pelistä ei vain syövän, mutta myös muiden sairauksien ja oireyhtymien, mikä korostaa vakavuus ei pysty kopioida DNA tai korjata virheitä oikealla tavalla.

Lisäksi yleisempiä syöpäsolun piirteet, Keski piirit CRC kuten MAPK-, TP53-, ja Fosfatidyyli opastinjärjestelmistä, joissa yleensä yksi tai muutama näkyvä pelaajat raportoitu usein muuttaa DNA-tasolla (johtuen pistemutaatioiden monistumiset, ja /tai poistot; [8], [16]), todettiin merkittävästi vapautettiin meidän analyyseissä. Tämä tarkoittaa, että muuttuneen geeniekspression useiden vähemmän ”kuuluisa” jäsenten reittejä myös osaltaan kolorektaalisyövän karsinogeneesissä. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että geenit, kuten

PIK3CA

ja

PTEN

ilmaistiin Tuumorinäytteissä, mutta ei merkittävästi eri tasoilla normaalista paksusuolikudos molemmissa aineistoja. Me ja muut ovat osoittaneet, että nämä geenit kärsivät usein aiheuttanut muutoksia DNA- tai proteiinin tasot sijaan muutokset mRNA ilmaisun [8], [17] – [19].

Jotta paljastaa ylimääräisiä geenejä ”Fosfatidyyli merkkijärjestelmä” kasvaimien syntyyn liittyvien selvitimme ekspressiotaso kaikkien sen komponenttien selityksin in Kegg. Sekä inositoli fosfataasit, diasyyliglyseroli kinaasit, ja fosfolipaasit havaittiin olevan muuttunut ilmentyminen. Niistä fosfolipaasi entsyymien jäsenet fosfolipaasi C perhe olivat hyvin edustettuina, mikä osoittaa merkittävä rooli tämän perheen CRC. Tämä on korostetusti RT-PCR-analyysit validoida, että ekspressiotasot

PLCD1

ja

PLCE1

olivat laajasti vaimentua CRC verrattuna normaaleihin paksusuolen limakalvolle. Tukahduttaminen

PLCD1

on tulosten mukaisesti esittämien Nomoto ja kollegat vuonna 1995, jossa he raportoivat havaitsemattomia tasoja PLCD1 proteiinin kahdeksassa koolonsyöpäsolulinjaa ja alentuneet kahdestoista kolmentoista paksusuolikarsinoomat verrattuna niiden pariksi normaali limakalvo näytteen [20]. Useat ryhmät ovat ehdottaneet rooli PLCD1 säätelyssä solusyklin G

1 /S-tarkastuspiste kuitenkin on olemassa ristiriitaisia ​​tuloksia, onko se onkogeenisessä tai tuumoria tukahduttavan funktion [21] – [23]. Perustuu tämän havainnoista, suosittelemme jälkimmäinen vaihtoehto on

PLCD1

CRC. Samanlaisia ​​tuloksia on raportoitu myös ruokatorven okasolusyöpää (ESCC), maha- ja rintasyövän [21], [24] – [26]. Mielenkiintoista on, että pieni ekspressiotasot

PLCD1

olivat yhteydessä mutaatioita

TP53

ja

KRAS

sekä kasvainten MSS fenotyyppi; vaikka biologista merkitystä näiden yhdistysten on vielä määrittämättä.

Havaittu tukahduttamista

PLCE1

, toinen geeni tutkittu yksityiskohtaisesti, tukevat tulokset SØRLI

et al

. joka osoitti myös merkittävästi vähentää mRNA: n ilmentymisen tasot paksusuolen ja peräsuolen syövän näytteitä ja koolonsyöpäsolulinjoissa, sekä Wang ja kollegat, jotka ilmoitetaan taajuudella 36% heterotsygoottisuuden menetys (LOH) ja 10q23, jossa

PLCE1

sijaitsee ja downregulation PLCE1 in 21/50 kolorektaalisyövässä näytteitä verrattiin vastaaviin normaaleihin kudoksen [27] – [29]. Lisäksi havaitsimme, että ekspressiotasot

PLCE1

olivat laskussa kanssa edenneessä vaiheessa, mikä osoittaa, että tukahduttaminen tämän geenin on hyödyllistä syövän etenemisen. Erityisesti taso näyttää nousevan, kun saavutetaan etäpesäkkeitä (vaihe IV), ilmiö on aikaisemmin kuvattu

PLCD1

ja

PLCD3

rintasyövässä [24]. Tästä huolimatta on syytä varovaisuuteen tulkittaessa tuloksia tässä vaiheessa IV ryhmä, sillä vain seitsemän kasvaimet ovat mukana. Ilmentymistasojen

PLCD1

ja

PLCE1

korreloivat, ja kuten odotettua, vähentää molempien geenien ilmentymistä on liittynyt kehittyneempiä kasvaimen vaiheessa (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin yksittäiset ekspressiotasot ja ekspressiotasot Molempien geenien Yhdistetyt ei korreloi potilaan eloonjäämisen (tuloksia ei ole esitetty). Kiehtovan, kuten

PLCD1

, alhainen ilmentyminen

PLCE1

oli voimakkaasti yhteydessä mutaatioita

KRAS

. Koska PLCE1 on todettu olevan sekä ylävirran ja alavirtavaikuttajainhibiittorit Ras proteiinit [30], korrelaatio mutatoitunut

KRAS

kanssa vähensi ekspressiotasot todennäköisimmin on keskeisessä asemassa CRC kasvainten synnyssä. Lisäksi viime aikoina on raportoitu, että yliekspressio PLCE1 on koolonisyöpäsolulinja inhiboi kasvainsolujen proliferaatiota, vähentää muodostuneiden pesäkkeiden määrästä, vähentää päivityksestä ja lisääntynyttä apoptoosia [29], mikä viittaa siihen, tuumoria tukahduttavan rooli tämän geenin CRC.

olivatko alennettua ekspressiotasot

PLCD1

ja

PLCE1

voi johtua promoottorin hypermetylaatio. Tämä on yleinen tapa inaktivoida tuumorisuppressorigeeneille, ja molemmat phopholipases ovat esittäneet ehdolle promoottori hypermetylaation [27]. Tämä on kuitenkin toistaiseksi vain vahvistettu

PLCD1

vaihteluvälillä 52-62% metylaation ESCC, maha- ja rintasyövän [21], [25], [26]. Tuloksemme qMSP ja bisulfiitti sekvensointi voi vahvistaa

PLCE1

tavoitteeksi tämäntyyppiselle epigeneettiset hiljentämisen, ja huolimatta korkea tiheys metylaation koolonsyöpäsolulinjaa, metylaatio

PLCD1

promoottori voi vain selittää alentunut ilmentyminen alaryhmä karsinoomien. Mielenkiintoista kuitenkin, huomasimme, että kaikki yhtä lukuun ottamatta metyloitua kasvaimet olivat MSI tuottaen metyloinnin taajuudella lähes neljäkymmentä prosenttia keskuudessa karsinoomat kidevirheen mismatch korjaus. Lisäksi metyloitu MSI kasvaimia lokalisoitu oikealla puolella suoliston ja oli

BRAF

mutaatio, linjassa CIMP fenotyyppi [3].

alistamalla kaksi CRC transcriptome aineistoja GSEA olemme tunnistaneet useita tilastollisesti merkitsevä vapautetuilla geeni setit CRC, ja osoittaneet, että tämä lähestymistapa voi ohjata löytö uusien molekyylikohteista ja biomarkkereita syöpään. Tarkastaminen analyysit valittujen geenien yksi tunnistettu vapautettu signalointireittejä,

PLCD1

ja

PLCE1

, vahvisti kevyemmästä näiden transkriptien CRC verrattuna normaaliin limakalvolle näytteitä. Sekä kasvaimen ehkäisevästä ja kasvaimen edistämisen rooli näiden geenien ja proteiinien tuotteita on ehdotettu suhteessa syövän kehitykseen, riippuen kudoksesta peräisin [9]. Esillä tulokset tukevat kasvaimen tukahduttava rooli

PLCD1

ja

PLCE1

CRC, joka on

PLCD1

mahdollisesti selittyy epigeneettisestä mekanismi Mikrosatelliittimarkkerien epävakaa karsinoomia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kirjallinen suostumus saatiin kaikkien aineiden mukana. Kaikki näytteet noudetaan tutkimus biopankit osana tutkimusprojekteja hyväksyttyjen mukaisesti kansallisten eettisten ohjeiden. Biopankin sarja on rekisteröity kansallisen lainsäädännön mukaisesti ja hyväksyy alueneuvoston Medical Research Ethics (REK Kaakkois-S-09282c2009 /4958, Biopankkiverkosto 2781; REK South: 2003, S-02126, Biopankkiverkosto 296-2005-174211 ).

transcriptome aineistot

Kaksi itsenäistä peräsuolen kudokseen transcriptome profilointi aineistot aiemmin tuotettu laboratoriossamme käytettiin tähän GSEA tutkimuksen [31], [32]. Raakadata ovat käytettävissä NCBI Gene Expression Omnibus julkisen säilytyspaikkana microarray data (liittymistä numerot GSE25071 ja GSE24550). Ensimmäinen aineisto sisältää geeniekspressioprofiilien 46 CRC ja neljä normaalia paksusuolen limakalvoa näytteet saadaan käyttämällä Applied Biosystems 1700 alusta (Applied Biosystems Life Technologies, Foster City, CA, USA, AB) [31]. Toinen geenien ilmentymisen aineisto sisältää 91 CRC ja kuusi normaalia paksusuolen limakalvo yksilöitä luotu käyttäen Affymetrix GeneChip- Human eksoni 1.0 ST paneelit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA, HuEx) [32]. Ei ollut päällekkäisiä näytteitä välillä microarray aineistot. Yhteenveto kliinisten tietojen potilaille sisältyvät aineistot löytyvät taulukosta S3.

kudosnäytteitä ja syöpäsolulinjat

Potilas näytteet ovat tavoite todentaminen analyyseissä muodosti osajoukko kasvaimet, joita käytetään HuEx aineisto (n = 70), ja 17 on normaalia koolonin limakalvoa näytteet (mukaan lukien kuusi päässä HuEx aineisto). Kaikki näytteet otettiin potilailta, joille suoritetaan ensisijainen leikkaus CRC Oslon yliopistollisessa sairaalassa, Aker, Oslo, vuosina 2005 ja 2008 normaalia paksusuolen limakalvo Näytteet otettiin taudista vapaan alueita resektio marginaali CRC yksilöt (≥10 cm kasvain). Kliinis kuvaus löytyy taulukosta S4.

Yhdeksäntoista koolonsyöpäsolulinjaa (Co115, Colo320, EB, FRI, HCT15, HCT116, HT29, IS1, IS2, IS3, LoVo, LS1034, LS174T, RKO, SW48, SW480, TC7, TC71, ja V9P) sisällytettiin tutkimukseen, ja perusteellisesti kuvattu [33]. Näitä viljeltiin tavanomaisissa olosuhteissa, jotka annetaan pyynnöstä. Kuusi solulinjojen (HCT15, RKO, SW48, HT29, LS1034, ja SW480), alistettiin epigeneettisiä hoitoon käytetään demetyloiva lääkkeen AZA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; 1 uM 72 tuntia), histonideasetylaasi-inhibiittori TSA (Sigma-Aldrich, 0,5 uM 12 tuntia), ja molempia lääkkeitä (1 uM AZA: ssa 72 tuntia ja 0,5 uM TSA lisätään viimeisen 12 tunnin). Samanaikaisesti samoja solulinjoja viljeltiin ilman hoitoa 72 tuntia. Kaikki kaupallisesti saatavilla solulinjat autentikointia AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems).

eristäminen nukleiinihappojen

DNA tuoreista pakastettujen koolonin kudokseen ja paksusuolen syöpäsolulinjoissa uutettiin jonka vakio fenoli /kloroformi-protokollaa. RNA: ta kasvainkudoksen uutettiin käyttäen Qiagen AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa), kun taas RNA: ta on normaalia koolonin limakalvoa näytteitä ja koolonsyöpäsolulinjoissa eristettiin Ambion RiboPure ™ Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ja Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), vastaavasti. Kaikki toimenpiteet suoritettiin valmistajan protokollien.

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) B

GSEA geenin sarjaa määriteltiin mukaisesti Kegg koulutusjakson kokoelma (Homo sapiens (ihmisen) Release 53,0 ) [7]. Analyysi suoritettiin käyttämällä GSEABase paketin Bioconductor /R versio 2.9.2 [34]. Kaksi microarray geenien ilmentymisen aineistoja CRC

versus

normaalin paksusuolen limakalvo tarkastettiin riippumattomasti altistettiin GSEA. Data esikäsittely suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [31], [32]. Kvartiiliväli (IQR) käytettiin mittana vaihtelua. Geenit kanssa IQR 0,5 jätettiin edelleen analyyseja GSEA. Geenejä kohteena useita transkripti klustereita (HuEx) tai antureista (AB), toimittaja suurimmilla vaihtelua käytettiin. Geenit ole osoitettu mihinkään Kegg polkuja jätettiin pois analyysistä. Kaikkiaan 3361 ja 4797 geenien selityksin varustettua asema 205 ja 220 Kegg väyliä arvioitiin AB ja HuEx aineistoja, vastaavasti. Polkuja, jotka sisältyvät alle 10 selityksin geenit poistettiin lisäanalyysiä, jättäen 167 ja 185 reittejä kyseisissä tietokannoissa. Kaksipuolinen, kahden luokan t-testejä olettaen yhtä suuri varianssien poikki CRC ja normaali näytteet tehtiin kaikki mukana geenejä. Geeni asettaa rikastamiseen pisteet laskettiin summana havaittu t-tilastot geenien sarjassa, jaettuna neliöjuuri geenien lukumäärän asetettu. Gene set

P

-arvot laskettiin perustuen vektori todennäköisyydet t-tilastot poikki mukana geenit [35].

validointi PLCD1 ja PLCE1 ekspressiotasot kvantitatiivisen Reverse Transcription- PCR

Yhteensä RNA CRC kudoksesta ja normaali limakalvo näytteet muunnettiin cDNA käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). CDNA: n kahden endogeenisen valvonnan,

ACTB

(Hs99999903_m1) ja

GUSB

(Hs99999908_m1), samoin kuin cDNA: n geenien

PLCD1

(Hs00979908_m1) ja

PLCE1

(Hs00275279_m1) monistettiin erikseen 384 hyvin levyt valmistaja on kuvannut (Applied Biosystems). Geenien ilmentyminen mitattiin reaaliaikaisesti käyttäen 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Näytteet analysoitiin kolmena kappaleena ja mediaanin arvo käytettiin tietojen analysointia. Sarjalaimennokselle cDNA Universal Human Viite-RNA (Agilent, Santa Clara, CA, USA) käytettiin tuottamaan standardikäyrän. Ilmentymistasojen

PLCD1

ja

PLCE1

normalisoituivat vastaan ​​keskiarvo endogeenisen valvontaa.

bisulfiittikäsittelyn ja edistäjänä metylaatiomääritystä suunnittelu

Ennen laadullisten ja määrällisten MSP ja bisulfiitti sekvensointi, 1,3 ug DNA: ta kustakin näytteestä oli natriumbisulfiitti hoitaa käyttäen Epitect bisulfiittimodifiointi Kit (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa.