Krooninen sairaus

tiivistelmä

MUC1 proteiini on houkutteleva kohde syöpälääkkeen toimitusta, koska sen yli-ilmentymisen useimmissa adenokarsinooman. Tässä tutkimuksessa raportoitu MUC1 proteiini aptameeriin hyödynnetään koska kohdistaminen asiamiehen nanohiukkasten perustuvan lääkeaineen jakelujärjestelmä. Paklitakseli (PTX) ladattu poly (maito-ko-glykolihappo-happo) (PLGA) nanohiukkasten formuloida emulsioksi /haihduttamalla menetelmällä, ja MUC1 aptameerit (Apt) konjugoitiin partikkelin pintaan kautta DNA spacer. Aptameeriä konjugoitu nanohiukkasten (Apt-NP) ovat noin 225,3 nm kooltaan vakaa

in vitro

lääkeaineen vapautumisprofiili. Käyttäen MCF-7-rintasyöpäsolujen kuten MUC1-yliekspressoivassa malli, MUC1 aptameerin lisääntynyt käyttöönottoa nanohiukkasia kohdesoluihin mitattuna virtaussytometrialla. Lisäksi PTX ladattu Apt-NP parannettu

in vitro

lääkeannostelun ja sytotoksisuuden MUC1

+ syöpäsoluja, verrattuna ei-kohdennettu nanopartikkeleita puuttuu MUC1 aptameeriin (P 0,01). Käyttäytyminen Tämän uuden Aptameerin-nanohiukkasten bioconjugates viittaa siihen, että MUC1 Aptameerien voi olla sovellus mahdollisuuksia kohdennettua lääkeannostelun kohti MUC1-yliekspressoivia kasvaimia.

Citation: Yu C, Hu Y, Duan J, Yuan W, Wang C, xu H, et al. (2011) Novel aptameeriin-Nanoparticle Bioconjugates Parantaa Toimitus syöpälääkettä että MUC1-Positive Syöpäsolut

In vitro

. PLoS ONE 6 (9): e24077. doi: 10,1371 /journal.pone.0024077

Editor: Tarl Wayne Prow, University of Queensland, Australia

vastaanotettu: 02 toukokuu 2011; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2011; Julkaistu: 1. syyskuuta 2011

Copyright: © 2011 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tunnustaa rahoitus tukea Kiinan Ministry of Science and Technology (2011CB911003, 2011CB911004, 2011CB933504) ja Natural Science Foundation of China (81071870). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kemoterapia ensisijainen hoitoa syöpään, mutta sen tehokkuus on usein rajallinen, koska niihin liittyviä haittavaikutuksia. Kohdennettu lääkeaineen antojärjestelmä voi poistaa ei-spesifinen myrkyllisyys kemoterapia, koska se voi ohjata syöpälääkkeiden kasvainsoluihin ja välttää myrkyllisyys normaaleille soluille. Monissa tapauksissa nanohiukkasten (NP) on osoittautunut suuret mahdollisuudet lääkeaineen johtuen passiivisen kasvaimeen kohdistaminen vaikutus tehostetun läpäisevyyttä ja säilyttäminen (EPR) näytteillä useimmat nano-harjoittajille [1]. Lisäksi aktiivinen kohdistaminen vaikutus voi toteutua, jos kohdistamisaineena konjugoidaan nanohiukkasten pinnalle. Aiemmin monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) olivat ehdotetun kohdentamisaineita [2]. Viime aikoina uusia kohdistaminen aineiden, mukaan lukien aptameerit [3], lyhyet peptidit [4], ja muut pienet molekyylit, [5], on tullut uuden sukupolven kohdennusmolekyylejä. Aptameerit ovat pieniä säikeitä DNA- tai RNA, jotka voivat muodostaa ainutlaatuisen 3-ulotteinen rakenteita, jotka nimenomaan yhdistyvät kohdemolekyylit, joilla on korkea affiniteetti. Verrattaessa muihin kohdentamisaineita, aptameerit erottamiskyky etuja: alhaiset synteesi kustannukset, matala-immunogeenisyys, pieni koko, että on helppo läpäistä kiinteitä kasvaimia, ja suuri affiniteetti verrattavissa monoklonaalisia vasta-aineita sitovia lähes kaikki molekyylejä. Aiemmin aptameerejä on menestyksekkäästi sovellettu kohdentamisaineita parantaa lääkeaineen eturauhassyöpään [6], [7], [8] ja lymfoblastisen leukemian solut [9].

Edellä esitetyt tutkimukset ovat tasoittaneet tietä hyödyntäen aptameeriin konjugoitu nanohiukkasten kohdennettuja lääkkeenantojärjestelmiä. Kuitenkin useimmat aptameeriin-ohjattu nanohiukkasten tähän mennessä tutkittu, joilla pyritään eturauhassyövän [6], [7], [8], ja aptameeriin-ohjattu nano-kantajina lääkeaineen muihin syöpiin ei ole raportoitu kirjallisuudessa. Olisi parempi, jos aptameeristä kohdistaminen laaja kirjo syöpien käytetään rakentaa kohdistuva lääkkeiden jakelujärjestelmä. MUC1 musiinigeenit on suuri läpäisevä glykoproteiini, jonka ilmentyminen lisääntyi vähintään 10-kertainen useimmissa pahanlaatuinen adenokarsinoomat, joten se on ihanteellinen kohdemolekyyli kemoterapeuttiset [10]. Glykosylaatiota ja jakelu proteiinin solun pinnalla ovat epänormaaleja munasarjojen, keuhkojen, haiman ja eturauhasen syöpiä, samoin kuin primaarinen ja metastaattinen rintasyöpiä, joka on yleisin syöpä naisilla 1,4 miljoonaa tapausta raportoitu vuonna 2008 [11 ]. Viime aikoina useat MUC1 aptameerit kehitettiin C.S.M. Ferreira et ai. [12], ja yksi heistä sovellettiin valikoivasti toimittaa phototoxin syöpäsoluihin

in vitro

[13]. Toistaiseksi kuitenkin nanohiukkasten perustuva syöpälääkettä jakelujärjestelmä kohdistaminen MUC1-proteiinia ei ole raportoitu kirjallisuudessa. Niistä julkaistu MUC1 aptameerejä, S2.2 on 25-base oligonukleotidi, joka sitoutuu MUC1-proteiinin kanssa suhteellisen suurella affiniteetilla ja spesifisyys [12], [13]. Tässä tutkimuksessa, rakensimme MUC1 aptameeriin konjugoitua nanohiukkasten kanssa S2.2 toimittamiseen paklitakselin MUC1-positiivisia kasvainsoluja, edut yhdistyvät Aptameerin kuin kohdistamisaineena ja vahvuuksia nanohiukkasten huumeiden harjoittaja. Tutkimme sen perusominaisuuksia ja arvioitiin sen toimituksen tehoa

in vitro

käyttäen MUC1-yliekspressoivassa malli MCF-7 solulinja. Nyt kertoa, että MUC1 aptameeriin-nanohiukkasten tehostaa toimituksen syöpälääke ja MUC1-positiivisten MCF-7-solujen

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

MUC1 aptameeriin S2.2 (5′-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G-3 ’) syntetisoitiin Invitrogen (Shanghai, Kiina). Modifioitu aptameeriin S2.2-välike, tehty S2.2 ja suunniteltu DNA välike (5’-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG GTT CCC TTC CTT CTC TCT TCC TCT CTC CTT CTC TCT TCC TCT CTC CTT C-3 ’) syntetisoitiin myös. Jotkut aptameerit muunnettiin 3’-NH

2 tai 5′-FITC vain tarvittaessa perusta. Poly (maito-ko-glykolihappo-happo) (PLGA, 50:50, MW = 16000),

N

-hydroxysulfosuccinimide (NHS), 1-etyyli-3- (3-dimetyyliaminopropyyli) karbodi-imidihydrokloridia (EDC ), paklitakseli (PTX), 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI), fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) ja poloksameeri 188: aa olivat analyyttistä laatua.

MCF-7 ja HepG2-solulinjat saatiin Solun Center of Chinese Academy of Medical Sciences (Peking, Kiina). -Soluja viljeltiin DMEM-alustassa, jota on täydennetty 100 yksiköllä /ml vesipitoista penisilliini G, 100 mg /ml streptomysiiniä ja 10% FBS: ää pitoisuuksina, jotta 70% konfluenssiin 24 h.

Nanoparticle valmisteen

paklitakseli kapseloitu nanohiukkasia valmistettiin käyttämällä emulsiota /haihtuminen tekniikkaa. Lyhyesti, 0,1 mg PTX ja 2,0 mg PLGA liuotettiin 0,2 ml: aan etyyliasetaattia ja sekoitettiin 1,0 ml: lla 5%: poloksameeri vesiliuoksessa 30 s ultraäänellä (200 w) jäähauteessa. Emulsiota sekoitettiin varovasti, ja liuotin haihdutettiin 40 ° C: ssa 2 tuntia. Haihduttamisen jälkeen suspensiota sentrifugoitiin 100,000 g: ssä 30 minuutin ajan. Supernatantti poistettiin ja sakka suspendoitiin uudelleen kahteen kertaan tislattua vettä. Arviointiin ottoa solun sisään Apt-NP, FITC kapseloitu nanohiukkasia sijaan PTX, konsentraatiossa 0,25 mg /ml.

karakterisointi nanohiukkasten

Hiukkaskoko määritettiin dynaaminen valonsironta (Malvern Zetasizer Nano ZS, UK). 1,0 mg NP tai Apt-NP liuotettiin 1,0 ml: aan kahdesti tislattua vettä. Hiukkaskokojakaumat mitattiin sironta kulma on 90 °. Intensiteetti painotettu keskiarvo merkittiin muistiin Kolmen mittauksen keskiarvona.

määrittämiseksi PTX lastaus, 1,0 mg kylmäkuivattua PTX-Apt-NP lysoitiin NaOH (1 M) ja UV-absorbanssin (Thermo Nanodrop 1000, US) mitattiin aallonpituudella 227 nm. 1,0 mg kylmäkuivattua tavallinen NP käytettiin rinnakkain valvontaa poistamaan vaikutuksia taustalla. PTX määritettiin kvantitatiivisesti vertaamalla standardikäyrään.

konjugointi aptameerien nanohiukkasten

konjugointi aptameerejä tai satunnaisia ​​DNA nanohiukkasten valmistus suoritettiin silloittumisen -COOH ja -NH

2. Lyhyesti, 50 ui PTX-NP: itä (10 ug /ml DNaasi RNaasi-vapaata vettä) inkuboitiin 100 ui 40 mM 1-etyyli-3- (3-dimetyyliaminopropyyli) karbodi-imidihydrokloridia (EDC) ja 100 ui 10 mM

N

-hydroxysulfosuccinimide (NHS) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa sekoittaen varovasti. Sitten aktivoitu partikkelit kovalenttisesti sidottu 50 ul 3′-NH

2-modifioitu MUC1 aptameeri (1 ug /ml DNaasi RNaasi-vapaata vettä) tai 3′-NH

2, 5′-FITC- muutettu MUC1 aptameeriin vain tarvittaessa pohja, 2 tuntia huoneenlämmössä. Tuloksena aptameeriin-nanohiukkasten bioconjugates pestiin, suspendoitiin uudelleen, ja sitä säilytetään DNaasi RNaasi-vapaata vettä. Konjugaatio 5′-FITC, 3′-NH

2-modifioitu MUC1 aptameerin PLGA mikropartikkeleita (0,5 mg /ml) analysoitiin virtaussytometrialla (Accuri C6, US).

Cellular sitova aptameerien

solujen sitoutumisen aptameerien määritettiin virtaussytometrialla (FCM) analyysi solujen kanssa inkuboinnin jälkeen FITC-leimatun satunnainen DNA (Ran), S2.2 aptameerin tai S2.2-spacer. MCF-7 ja HepG2 solut raaputettiin hellävaraisesti ja pestään D Hankin kahdesti. Solut suspendoitiin sidospuskuriin (100 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, pH 7,2) ja inkuboitiin Ran, MUC1 aptameerin S2.2 tai S2.2-spacer pitoisuudella 300 nM 30 minuuttia. FCM-analyysi suoritettiin tutkimaan sitoutumiseen satunnaisia ​​DNA: n tai aptameerien ja molemmissa solulinjoissa.

In vitro

vapautumisen profiilia PTX peräisin Apt-NP

in vitro

vapautuminen PTX peräisin Apt-NP havaittiin kalvon diffuusion tekniikkaa. PTX-Apt-NP suspendoitiin fosfaattipuskuriin (PBS, pH 7,4), joka sisälsi 0,5% (w /v) poloksameeri. 5 ml suspensiota (2 mg /ml), vietiin dialyysipussiin (MWCO 3500) ja sitten upotettiin 95 ml vapauttamaan väliainetta inkubaattorissa ravistelijassa 120 rpm 37 ° C: ssa. Tällä ennalta määrätyin aikavälein otettiin näytteitä ja korvattiin tuoreella vapautumisen väliaineessa. Nanohiukkasten ja vapautetaan PTX erotettiin ultra-sentrifugoimalla 100.000 x g 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. PTX pitoisuus supernatantissa määritettiin UV-spektrofotometrillä aallonpituudella 227 nm. Kumulatiivinen vapautuminen prosentteina PTX peräisin Apt-NP laskettiin seuraavasti ja ajan funktiona.

Cellular oton koe

soluunottoa hiukkasten määritettiin FCM analyysi solujen kanssa inkuboinnin jälkeen FITC kapseloitu hiukkasia. MCF-7 ja HepG2-soluja kasvatettiin 24-kuoppalevyillä 24 tuntia. Sitten soluja inkuboitiin 50 ug /ml FITC kapseloitu NP tai Apt-NP: 2 tuntia 37 ° C: ssa. FCM-analyysi suoritettiin sitten tutkia solun fluoresenssi oton sekä syöpäsolun linjat.

konfokaali fluoresenssi skannaus mikroskopia

soluunottoa NP tai Apt-NP by MCF-7 oli edelleen tutkittu konfokaalisella fluoresenssi skannaus mikroskopia (Perkin Elmer Ultraview, USA). MCF-7-solujen annettiin kiinnittyä lasipäällyslevyn 6-kuoppalevyllä 24 tunnin ajan. Sitten soluja inkuboitiin 100 ug /ml NP tai Apt-NP, jotka molemmat sisältävät FITC, 2 tuntia 37 ° C: ssa. Sitten solut pestiin D Hank: n ja käsiteltiin 0,25% trypsiinillä 1 minuutin ajan. Suspendoitu solut siirrettiin sentrifugiputkeen washed kahdesti. Sitten solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja analysoitiin konfokaalisella fluoresenssin pyyhkäisymikroskoopilla.

In vitro

sytotoksisuus

arvioimiseksi sytotoksisuuden vaikutukset on PTX-Apt-NP: itä vastaan ​​MCF-7 ja HepG2-soluissa, sekä solulinjoja kasvatettiin 96-kuoppaisilla levyillä. Soluja käsiteltiin pelkällä NP, vapaa PTX, PTX-ladattu NP (PTX-NP: itä) ja PTX-ladattu Apt-NP (PTX-Apt-NP). PTX ladattu NP konjugoitu satunnainen DNA (PTX-R-NP) käytettiin myös palvelemaan toiseen ohjaus. MCF-7, ja HepG2-soluja viljeltiin yhdessä vastaavien aineiden vastaavan PTX annos 0,05 ug /ml 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa, sitten pestiin D Hank: n (2 x 500 kuoppaa kohti). Soluja viljeltiin vielä 48 tuntia ja sitten MTS määritystä (Promega, USA) käytettiin määrittämään solujen elinkelpoisuuden kohti standardin protokollan kaavailema valmistukseen.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Statistical Analysis System (SAS, versio 9.2). Yksisuuntainen ANOVA Fisherin vähiten merkitsevää eroa (LSD) post hoc vertailuissa 99%: n luottamusväli käytettiin tilastollisessa vertailussa. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona sen keskihajonnan osoitetaan (keskiarvo ± SD).

Tulokset

valmistaminen Apt-NP

PTX-Apt-NP: rakennettiin kuten on esitetty kuvassa. 1 käyttämällä rutiinia emulsio /haihduttamalla menetelmällä. PTX otettiin osaksi NP fysikaalisesti loukkuun hydrofobisten vuorovaikutusten välillä PTX ja PLGA (Fig. 1 B). Helpottamiseksi moniarvoisen sitoutumisen välillä aptameerin ja kohde, välike on usein väliin aptameerin ja nanohiukkasten ajoneuvon. Siksi rakensimme DNA spacer laajentamalla 3 ’päähän alkuperäisen S2.2 aptameeri 48 ylimääräistä emästä (Fig. 1A), joka tarjoaa spacer pituus, joka on lähellä PEG 3400, joka on yleisesti käytetty spacer kohdennettua lääkeannostelun järjestelmät [14], [15]. Laajennettu osa DNA ei vaikuta sekundaarinen rakenne S2.2 aptameerin per laskennallisen analyysin (RNAstructure, versio 4.5). Konjugoida aptameeri-spacer monimutkainen PTX ladattu NP: itä, EDC: n ja NHS lisättiin katalysoivat kovalenttisten pari välillä -COOH PLGA on nanohiukkasten pinnan ja 3’-NH

2 MUC1 aptameeri (Fig. 1B). Huumeiden ladattu nanohiukkasten koko on 164,0 ± 7,6 nm ennen kytkemällä aptameerejä, ja nousi 225,3 ± 9,2 nm, kun konjugaatio, oletettavasti siksi, että lisätään koko aptameerin ja välikappale. PTX kapselointi tehokkuus oli 83,6 ± 1,7%: n huumeiden kuorma 4,2 ± 0,1%.

(A) rakenne MUC1 Aptameerin S2.2-välikappale. S2.2-välike on valmistettu MUC1 Aptameerin S2.2 (kuten kohdistamisaineena) ja suunniteltu sekvenssi yksijuosteinen DNA (kuten yhdistää välike). (B) valmistus menettely PTX-Apt-NP käyttäen emulsio /haihtuminen menetelmällä.

Affinity MUC1 aptameerin ja MCF-7 ja HepG2 solulinjat

aptameeriin S2.2 on raportoitu sitoutuvan spesifisesti MUC1-proteiinia suurella affiniteetilla [12]. Sen testaamiseksi, S2.2 olisi differentiaalisesti sitoutua MUC1-positiivisten ja MUC1-negatiivisia soluja, sitoutumisen S2.2 ja MCF-7, ja HepG2-soluissa arvioitiin FCM-analyysi. Satunnainen DNA (Ran) käytettiin kontrollina. Edellinen tutkimus ovat vakiintuneet, että MCF-7 on ihmisen rintasyövän solulinjaa, joka yli-ilmentää MUC1 proteiini pinnallaan [16], ja että HepG2 on MUC1-negatiivinen ihmisen maksan syöpäsolu linjan [17]. Yhdenmukainen alkuperäisen raportin aptameeriin S2.2 (keltainen käyrä) osoittivat suuremman sitoutumisen MUC1-positiivisten MCF-7-solut kuin MUC1-negatiivinen HepG2-soluissa (kuvio. 2 A B). Satunnainen DNA (sininen käyrä) oli paljon pienempi sitoutumista sekä MCF-7 ja HepG2-soluissa, oletettavasti johtui ei-spesifinen sitoutuminen. Lisäksi on tutkittava, S2.2-spacer oli samanlainen sitova parempana MUC1-positiivisten solujen, sitovan koe toistettiin S2.2-välikappale. Tulokset osoittivat, että S2.2-välike (punainen käyrä) oli samanlaisia ​​vuorovaikutus sekä solujen S2.2 (Fig. 2 A B), mikä viittaa siihen, että S2.2-spacer säilytetty selektiivisen sitoutumisen kyky alkuperäisen aptameerin. Keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus FITC-leimatun S2.2-spacer sitoutumisen MCF-7 on 3,5 kertaa suurempi kuin se, HepG2, joten se on pätevä kohdistamisaineena selektiivisesti, jonka tarkoituksena on MCF-7-soluissa. Koska välike voi helpottaa moniarvoinen välisen sitoutumisen aptameerin ja kohde, S2.2-spacer levitettiin kohdistuksen aineena rakentaa lääkeaineen antojärjestelmä tässä tutkimuksessa.

(A) histogrammit FCM-analyysi. FITC-leimattu random DNA, S2.2, tai S2.2-spacer inkuboitiin erikseen MCF-7 (vasemmalla) ja HepG2 (oikealla) soluja. (B) keskimääräinen fluoresoiva intensiteetti MCF-7 ja HepG2-soluissa inkuboitiin satunnainen DNA ja eri Aptameerien.

arviointi konjugaation välillä aptameerit ja nanohiukkasten

MUC1 aptameeriin-spacer oli konjugoitu nanohiukkasten in katalysoiman reaktion EDC ja NHS. Sen varmistamiseksi, että DNA-aptameeri todellakin liittyy partikkelin pinnalla, suoritettiin kaksi koetta. Ensimmäisessä kokeessa, FITC-leimattu aptameeriin oli co-inkuboitiin mikropartikkeleita (kansanedustajaa) joko läsnä ollessa tai poissa ollessa katalyyttien EDC ja NHS, ja sitten analysoitiin FCM. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, hiukkasten fluoresoiva intensiteetti ilman EDC: n ja NHS oli lähes sama kuin tavallinen kansanedustajat, kun taas positiivinen fluoresenssi havaittiin, kun läsnä on EDC: tä ja NHS. Tulokset viittasivat siihen, konjugaation välillä aptameerejä ja hiukkasten sen korvaamattoman käytössä katalyyttejä, ja että aptameerit oli vakaasti konjugoitiin hiukkaset kautta kovalenttisen sidoksen. Toisessa kokeessa tutkittiin olevan DNA Aptameerin on nanohiukkasten UV-spektroskopialla ja arvioitiin konjugoimalla tehoa. Samanlainen FCM tuloksia, lisää aptameerit liittyi nanopartikkelien läsnä ollessa, EDC: n ja NHS (Fig. 3B). Määrä konjugoidun aptameereillä on NP arvioitiin myös. Tässä reaktiossa järjestelmässä, noin 0,1 nmol Aptameerien kovalenttisesti kytketty 1 mg PLGA NP, eli noin 120 aptameerien kullekin nanohiukkasten.

PLGA mikropartikkelit (kansanedustajaa) tai nanohiukkasten (NP) reagoimaan aptameerit puuttuessa ( -EDC NHS) tai läsnä ollessa (+ EDC NHS) katalyyttien. (A) histogrammit FCM analyysin MP reagoimaan FITC-leimatun aptameerit puuttuessa (-EDC NHS, vasen) tai läsnä ollessa (+ EDC NHS, oikealla) katalyyttien. Plain mikrohiukkasia, jotka eivät olleet reagoineet kanssa Aptameerien käytettiin kontrollina. (B) UV-absorptio DNA 260 nm (n = 3) hiukkaset, jotka tehtiin konjugointi prosessi aptameerejä. Vertailuryhmä (NP) osoittaa plain nanohiukkasia, jotka eivät ole reagoineet DNA Aptameerien.

In vitro

-vapauttamisprofiilin PTX peräisin Apt-NP

Seuraava tutki

in vitro

-vapauttamisprofiilin PTX peräisin Apt-NP, välttämätön ominaisuus syövän vastaista aktiivisuutta. Määrä PTX vapautuminen PBS määritettiin ylityö UV absorptio 227 nm: ssä. Tyypillinen kinetiikkaan pitkävaikutteinen prosessin havaittiin PTX, noin 65% lääkkeestä vapautuu vähitellen ensimmäisten 48 tunnin aikana (Fig. 4). Osuus PTX julkaistiin täällä oli linjassa vapauttamalla profiileja monien PLGA lääkeväliaineen järjestelmiä raportoitu kirjallisuudessa [18], [19], [20].

Koe suoritettiin fosfaattipuskurissa (PBS , pH 7,4), joka sisälsi 0,5% (w /v) poloksameeri käyttäen kalvon diffuusio tekniikkaa, (n = 3).

sisäänotto soluihin koe

tärkein ominaisuus on kohdennettu lääkkeenantojärjestelmä on sen spesifisyys kohti kohdesoluja. Tutkia

in vitro

syöpä kohdistaminen Apt-NP vastaan ​​MUC1-yliekspressoivia soluja, vertasimme ottoa solun sisään MCF-7 (MUC1

+) ja HepG2 (MUC1

-) käyttäen FCM-analyysi (Fig. 5). NP ja Apt-NP, molemmat kapselointi FITC, olivat viljeltiin yhdessä MCF-7 ja HepG2. Fluoresoiva intensiteetti MCF-7 ja HepG2-soluja inkuboitiin NP olivat samanlaisia ​​amplitudiltaan. Kuitenkin Apt-NP käsitelty MCF-7-solut, fluoresoiva intensiteetti kasvoi 71%, kun taas HepG2-soluissa juurikaan muuttunut. Ero oli oletettavasti aiheuttama konjugoitua aptameerejä, joka sitoutuu MUC1-proteiinin pinnalla MCF-7-soluissa, mikä lisää nanohiukkasten on kiinnitetty solun pinnalla ja sisäistetään soluun.

Soluja inkuboitiin FITC kapseloitu Apt-NP tai NP 50 ug /ml 2 tunnin ajan ennen kuin niitä on analysoitu.

konfokaali loisteputki skannaus mikroskopia

edellä esitetyt tulokset osoittivat, että Apt-NP: luotu tehostetun fluoresenssin intensiteetti MUC1-positiivisten MCF-7-solut, vertaamalla NP. Kuitenkin, se ei ole täysin selvää, onko Apt-NP kiinnitettiin solun pinnalla tai sisäistetty soluihin. Lisätutkimuksia vuorovaikutusta järjestelmän välillä Apt-NP: itä ja kohdesolut, konfokaali loisteputki skannaus mikroskopia suoritettiin määrittämään sijainnin Apt-NP: itä. Useiden kuvien skannaus läpi eri tasoilla MCF-7-solut hankittiin. Keskeinen taso skannaa joka meni läpi solun keskustaa ja tumat näkyy kuvassa. 6. Kuvien selvästi, että Apt-NP kertyi lähinnä sytoplasmassa tuman ympärillä. Niinpä Apt-NP voitaisiin otetuksi kohdesoluihin ja kuljettaa syöpälääkkeiden sytoplasmaan. Verrattuna Apt-NP, määrä NP: itä tuli MCF-7-solut oli paljon pienempi; viittaa jälleen, että MUC1 aptameeriin helpotti käyttöönottoa nanohiukkasten soluihin.

Green loisteputki FITC kiteytettiin Apt-NP: itä ja NP. Tumat värjättiin sininen DAPI. Oikeassa sarakkeessa osoitti sulautuneen kuvia FITC ja DAPI kanavia. MCF-7-solut altistettiin FITC-kapseloitu Apt-NP tai NP 100 ug /ml 2 tunnin ajan.

In vitro

sytotoksisuus

Matkapuhelinverkko oton koe osoitti, että Apt-NP: tä lisäsi ottoa nanohiukkasia MUC1-yliekspressoivassa syöpäsoluja. Kuitenkin on tuntematon, miten tämä vaikuttaa toimituksen syöpälääkkeen soluihin. Tutkia asiaa,

in vitro

sytotoksisuutta vapaa PTX, tavallinen NP, PTX-ladattu NP (PTX-NP), PTX ladattu NP konjugoitu satunnainen DNA (PTX-R-NP: itä), ja PTX- ladattu NP konjugoitu MUC1 aptameerien (PTX-Apt-NP) verrattiin käyttäen MCF-7 (MUC1 +) ja HepG2 (MUC1-) kohdesoluina. Tulokset on esitetty kuviossa. 7. Plain NP ilmeni vähän sytotoksisuutta, mikä viittaa siihen, että toimitus ajoneuvot ovat suhteellisen myrkyttömiä soluihin ja että sytotoksisuus oli enimmäkseen aiheuttama kapseloidun PTX. Vapaa PTX syntyy samanlainen astetta sytotoksisuuden molemmissa solulinjoissa. PTX-Apt-NP tuotti voimakkaampi sytotoksisuus kuin PTX-NP tai PTX-R-NP: MCF-7-solujen (P 0,01). Kuitenkin sytotoksisuus eroja ei havaittu HepG2-soluissa. Tämä on johdonmukaista tulosten kanssa esitetään kuviossa. 5, jossa MUC1 aptameerin lisäsi ottoa Apt-NP: itä osaksi MCF-7-soluihin (MUC1 +), mutta ei HepG2-soluissa (MUC1-). Tulokset viittaavat siihen, että MUC1-aptameeri voi selektiivisesti parantaa toimituksen syöpälääke ja MUC1-positiivisten syöpäsolujen.

solut pestiin sen jälkeen ja niitä inkuboitiin viljelyväliaineessa, yhteensä 48 tuntia, ennen solujen elävyys kullakin ryhmä arvioitiin tavallisella MTS-määritys (n = 6, keskiarvo ± SD).

keskustelu

Kohdennettu lääkeainekuljetussysteemeihin on ehdotettu ongelman ratkaisemiseksi, että useimmat syövän vastaisia ​​terapeuttisia aineita ei onnistu toimimaan nimenomaan syöpäsoluja ja aiheuttaa myrkyllisyys normaaleille soluille. Tässä tutkimuksessa olemme suunnitelleet MUC1 aptameeriin perustuvia kohdennettuja lääkkeenantojärjestelmä (Fig. 1) parantaa toimituksen paklitakselin MUC1-yliekspressoivassa syöpäsoluja. MUC1 Aptameerien osoitti suurempi affiniteetti ja selektiivisyys vastaan ​​MCF-7-solut (MUC1

+) yli HepG2 solut (MUC1

-) (Fig. 2). Rakentaa Apt-NP, MUC1 aptameerit konjugoitiin aptameerejä kansallisille parlamenteille pinta kemiallisen kovalenttisen kytkennän (Fig. 3). Apt-NP osoitti profiilia lääkeaineen pitkittyneen vapautumisen (Fig. 4). Kohdennusvektori aptameeriin lisäsi otto nanohiukkasia MUC1-yliekspressoivassa kasvainsoluja (Fig. 5 6). Lisäksi Apt-NP tehosti PTX toimitus MUC1-positiivisia kasvainsoluja (Fig. 7), kun taas ei näy yhtään tehoa kohti ohjaus solut.

Aiemmat tutkimukset Aptameerin konjugoitua NP lääkkeen antamista varten ovat parantuneet tehoa eturauhassyöpää vastaan ​​kautta aptameerin eturauhasen-spesifisen membraanin (PSMA) [6], [7], [8], [21]. Kuitenkin, se olisi ihanteellinen rakentaa aptameeri-pohjainen lääkkeenantojärjestelmä kohdistaminen laaja syöpiä. MUC1 proteiini on ilmentynyt ja poikkeavasti glykosyloitu pinnalla eniten adenokarsinoomasolua [10], joten se on erittäin houkutteleva kohde syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa ensimmäistä kertaa, MUC1 aptameeriin hyödynnetään kohdistamisaineena joka nanohiukkasten perustuva lääkeaineen jakelujärjestelmä. MUC1-aptameeri (S2.2), käytettiin tässä tutkimuksessa osoitti suuri sitoutumisaffiniteetti ja MUC1, joka on verrattavissa anti-MUC1-vasta-aine C595 [12], [22]. Tavoiteltu nanohiukkasten jakelujärjestelmä perustuu tähän MUC1 aptameeriin arvioitiin sen kohdistaminen kyky vastaan ​​MCF-7-solujen

in vitro

. Samanlainen lääkeaineen, joka perustuu PSMA aptameeri, havaitsimme parantunutta sisäänottoa Apt-NP: itä by MUC1-yli-ilmentävät MCF-7-solut (Fig. 7). Koska MUC1-proteiini on yli-ilmentynyt pinnalla useiden syöpien soluja, kuten lääkeaineen antojärjestelmä voi mahdollisesti parantaa toimituksen syöpälääkkeiden useita pahanlaatuisia kasvaimia, kuten haimasyövän [23], eturauhassyöpä [24], munasarjasyöpä [25 ], jne.

Kuten edellä on esitetty, parannettu toimitus syöpälääke pääasiassa indusoitiin MUC1 aptameeri. Konfokaalinen pyyhkäisymikroskoopilla kuvia (Fig. 6), ja lisääntynyt sytotoksisuus vertaamalla vapauttaa PTX (Fig. 7) osoitti, että NP: itä hoidettaviksi soluihin. Yleensä ajatellaan, että lääkeaineella täytetyt PLGA NP ovat siirtyy solujen kautta sisäistämisen, ja myöhemmin vapauttaa lääkeaineen solujen sisällä [26]. S2.2 aptameerit konjugoitu NPS luultavasti edisti vuorovaikutusta NP: itä ja MCF-7-solujen kautta ligandi-reseptori tunnustamista. Erityisesti, S2.2 sidottu MUC1 oletettavasti toimivat kuten ankkuri ja vedetään nanohiukkasten läheisyyteen solun, ja parantaa todennäköisyyttä, että nanohiukkasten ollessa sisäistää MCF-7-soluissa. MUC1-negatiivinen HepG2-soluissa, aptameeri ei parantaa imeytymistä nanohiukkasten (Fig. 5), luultavasti koska se ei paranna vuorovaikutusta nanohiukkasten ja solun.

spacer molekyyli on usein tarpeen kohdemolekyylin ja kuljettajan nanohiukkasten: pituus ja joustavuus välike sallii kohdistaminen aptameerit tunkeutua solun pinnan molekyylejä ja sitoutuvat tavoitteet moniarvoisen tavalla [14]. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet uusi lähestymistapa rakentaa välike, joka voisi yksinkertaistaa valmistusmenetelmää. Olemme laajennettiin 25-base S2.2 aptameerin lisäämällä 48-base DNA-sekvenssin 3′-päähän aptameerin, tehdä 73-base nauha. DNA spacer on suunniteltu välttämään muodostaen sekundäärisen rakenteen ja sillä oli suunnilleen saman pituinen kuin enimmäkseen käytetään spacer PEG-3400 (25 nm). Sitoutumistutkimus (Fig. 2) osoitti, että aptameeriin S2.2 ja S2.2-spacer oli samanlaisia ​​sitovia profiileja MUC1-positiivisten kohdesoluja ja MUC1-negatiivisen kontrollin soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että laajennettu DNA-juostetta ei vaikuta sitovan kyvyn S2.2 ja voisi olla toteutettavissa spacer. Välttämällä PEG välike Tämä valmistusmenetelmä yksinkertaistettu kemiasta konjugoimiseksi kohdistamisaineena ja välike nanohiukkasten. Koska edut välike on hyvin hyväksytty [27], [28] ja S2.2-spacer osoitettu hyvä affiniteetti MUC1-positiivisiin kohdesoluihin, aptameerit DNA spacer käytettiin rakentaa kohdennettuja lääkeaineen antojärjestelmä tässä tutkimuksessa . Kuten odotettua, S2.2-spacer konjugoitu Apt-NP näkyy suuri spesifisyys ja affiniteetti MUC1-yliekspressoivia soluja

in vitro

.

MUC1 proteiini on tärkeä kasvaimeen liittyvä antigeeni (TAA) havaittiin useimmissa adenokarsinooman. Äskettäin ryhmä MUC1 aptameerejä on tunnistettu, mukaan lukien aptameerin S2.2 [12], jolla on potentiaalia toimia kohdistaminen aineena MUC1-proteiinin. Ensisijainen tavoite Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tutkia mahdollisuutta kehittää nanomittakaavan lääkeaineen, joka perustuu S2.2 ja alustavasti arvioida sen syöpää kohdistaminen kyky

in vitro

. Täällä rakennetaan uusi PTX ladattu nanohiukkasten konjugoitu MUC1 aptameeriin S2.2 kautta DNA välikappale. Aptameeri havaittiin lisäävän käyttöönottoa nanohiukkasten MUC1-positiivisten MCF-7-soluissa. Lisäksi PTX ladattu Apt-NP tehosti sytotoksisuutta MCF-7-solujen

in vitro

. Kuitenkin, jotta käytännössä ymmärtää MUC1-kohdistuva lääkkeiden annostelu, laaja tulevaa tutkimusta Apt-NP pysyvyyden lisätietoa, mukaan lukien

in vivo

arvioinnissa farmakokinetiikkaa, farmakodynamiikkaa, haittavaikutukset ja pitkäaikainen biologinen yhteensopivuus eläinten tutkimuksissa.

Johtopäätös

Yhteenvetona todettakoon, että MUC1 aptameeriin-ohjattu nanomittakaavan lääkkeenantojärjestelmä kehitettiin uusi konjugaatio strategiaa. Tulokset osoittavat, että järjestelmä voi tehokkaasti parantaa PTX toimitus MUC1- yli-ilmentävät MCF-7-solujen

in vitro

. Koska monet syövät yli-ilmentää MUC1 proteiini, me olettaa, että kohdennettua lääkeannostelun joilla pyritään MUC1 voi toimia mahdollisena strategia parantaa hoitotuloksia näistä kasvaimista.