Krooninen sairaus

tiivistelmä

1-metyyli-D-tryptofaani (1-D- MT) käytetään nykyisin kliinisissä tutkimuksissa potilailla, joilla oli uusiutunut tai refraktorinen kiinteiden kasvaimien tavoitteenaan estävä indoleamine-2,3-dioksigenaasin (IDO) -välitteisen kasvain immuuni paeta. IDO ilmaistaan ​​kasvaimia ja kasvaimen tyhjennys imusolmukkeiden ja heikentää tryptofaani (trp) luomaan immunsuppressive micromilieu sekä kuluttamalla trp ja keräämällä immunosuppressiivisten aineenvaihduntatuotteet kynurenine (KYN) kautta. Tässä osoitamme, että leviäminen alloreaktiivisten T-solut viljellään kanssa IDO1-positiivisten ihmisen syöpäsoluja paradoksaalisesti estyi 1-D-MT. Yllättäen inkubaatio 1-D-MT lisääntynyt KYN tuotantoa ihmisen syöpäsoluja. Cell-free-määritykset paljastivat, että 1-D-MT ei muuttanut IDO1 entsymaattista aktiivisuutta. Sen sijaan 1-D-MT aiheuttama IDO1 mRNA ja proteiini ilmaisun reittejä, joihin liittyy p38 MAPK ja JNK signalointi. Syövän hoitoon potilailla, joilla on 1-D-MT on transkription vaikutuksia, jotka voivat edistää sen sijaan tukahduttaa kasvaimen vastaisen immuunivasteen paeta lisäämällä IDO1 syöpäsoluissa. Nämä off-tavoite vaikutukset olisi analysoitava huolellisesti meneillään olevissa kliinisissä tutkimuksissa 1-D-MT.

Citation: Opitz CA, Litzenburger UM, Opitz U, Sahm F, Ochs K, Lutz C, et al. (2011) indoleamine-2,3-dioksigenaasin (IDO) inhibiittori 1-metyyli-D-tryptofaani ylössäätelee IDO1 Human Cancer Cells. PLoS ONE 6 (5): e19823. doi: 10,1371 /journal.pone.0019823

Editor: Matej Oresic hallitusneuvos teknillinen tutkimuskeskus Suomi, Suomi

vastaanotettu 25 marraskuuta 2010 Hyväksytty: 18 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 20, 2011

Copyright: © 2011 Opitz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Helmholtz Association (VH-NG-306) ja MP ja Hertie säätiön WW. CAO tukee Heidelberg University Medical Faculty Postdoctoral Fellowship. Kuten Uta Opitz ja Christian Lutz ovat työntekijöitä Heidelberg Pharma, Heidelberg Pharma oli rooli tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että ole kilpailevia intressejä olemassa. Uta Opitz ja Christian Lutz ovat työntekijöitä Heidelberg Pharma. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Viime vuosina tryptofaani (trp) hajoaminen on saanut yhä enemmän huomiota kuin tehokas immunosuppressiivinen mekanismi ylläpitämiseen liittyviä immunologisen toleranssin. Trp-hajottavaa entsyymiä indoleamine-2,3-dioksigenaasin (IDO) on ollut mukana äidin suvaitsevaisuutta allogeenisen concepti [1], valvontaan autoimmuunisairauksia [2], [3] ja krooninen infektio [4], sekä edistää kasvaimen immuuni paeta [5], [6], [7]. IDO-välitteistä trp hajoamista ei rajoitu kasvainsoluihin [7], mutta on myös havaittu kasvaimia tyhjennys imusolmukkeiden [8]. Molemmissa kasvaimeen tyhjennys imusolmukkeet ja kasvaimia, IDO1 luo paikallista siedettävyyttä suoraan tukahduttamalla T-soluvasteita ja parantamalla immunosuppression välittämä säätelijä-T-solujen (T

reg

) [6]. IDO on kroonisesti aktivoidaan monilla syöpäpotilailla [9] ja sen ilmaisun tai entsyymiaktiivisuuden korreloi huonon ennusteen potilailla, joilla on eri syöpien, kuten munasarjasyöpäpotilailla [10], [11], endometriumsyöpä [12], [13], hepatosellulaarinen kohdunkaulan [14] ja peräsuolen syöpä [15].

Vaikka pääosa todiste rooli IDO edistämisessä kasvainmuodostusta ja kasvaimen immuuni paeta on ollut tutkimuksia, jotka osoittavat kasvaimen vastaisen aktiivisuuden IDO1. Induktio IDO1 on kuvattu mekanismi, jolla interferoni (IFN) -γ estää pahanlaatuisten solujen uudiskasvun [16], [17]. Jotkut eläinkokeet osoittivat, että IDO1 ilmentyminen positiivisesti poistamiseen liittyvät pahanlaatuisten solujen [18], [19]. Näitä havaintoja tukevat kliinisissä tutkimuksissa osoittavat, että huolimatta siitä, että vahva induktori IDO1, IFN-γ oli tehokas hoito munasarja- ja virtsarakon syöpä [20], [21], [22]. Lisäksi IDO1 ilmentyminen maksasolukarsinoomassa yksilöiden ja endoteelisoluissa munuaissyövän korreloi positiivisesti ilman taudin etenemistä ja pysyvyyttä, vastaavasti [23], [24]. On siis edelleen epävarmuutta kliinistä merkitystä IDO1 ilmaisun kasvaimissa.

prekliinisissä tutkimuksissa IDO-inhibiittori 1-metyyli-tryptofaani (1-MT) vähensi kasvaimen tilavuutta hiirillä im- munisoitu kasvainantigeenina [7 ] ja – yhdistettynä kemoterapia-aineiden – aiheutti regressio vakiintuneiden hiiren rintasyövistä [5]. Esto IDO yhdessä kemoterapian tai rokoteadjuvanttina siksi on houkutteleva lähestymistapa syövän immunoterapiassa [5], [6], [7], [25], [26]. Äskettäin uusi IDO isoformi, jota kutsutaan IDO2 havaittiin, joka – kuten IDO1 – ilmaistaan ​​kasvaimia ja kasvaimen tyhjennys imusolmukkeiden [27]. Kolmas trp-hajottavaa entsyymiä ihmisissä, tryptofaani-2,3-dioksigenaasin (TDO) ilmentyy pääasiassa maksassa ja säätelee trp pitoisuudet jälkeen ravitsemukselliset trp ottoa. IDO-inhibiittori 1-MT esiintyy kahtena stereoiso-, 1-D-MT: n ja 1-L-MT. Useimmat prekliinisissä tutkimuksissa on käytetty raseemisen seoksen 1-D /L-MT estävän IDO. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että IDO1 on ensisijaisen tavoite 1-L-MT, kun taas 1-D-MT inhiboi ensisijaisesti IDO2 [26], [27], [28], [29]. 1-D-MT käytetään nykyisin vaiheen I kliinisissä kokeissa lisänä tavanomainen kemoterapia perustuu prekliinisissä tutkimuksissa hiirimalleissa syöpä. Olimme kiinnostuneita immunomodulaarisia vaikutukset 1-D-MT in IDO1-positiivisten ihmisen syöpäsoluja.

Tulokset

1-D-MT indusoi immunosuppressio ihmisen syöpäsolujen

SKOV-3-solujen konstitutiivisesti hajoavat trp KYN ja ilmaista korkea IDO1 mRNA taas IDO2 ja TDO mRNA ilmaistaan ​​matalalla tasolla (Fig. 1A). Knockdovvn IDO1 siRNA in SKOV-3-solujen vähentynyt IDO1 mRNA ilmentyminen 87,5% (Fig. 1 B), joka johtaa voimakasta vähenemistä IDO1 proteiinin ilmentymistä osoituksena Western Blot (Fig. 1 C) ja immunosolukemiallinen (Fig. 1 D). Lopuksi KYN tuotanto estyi 91,4% vuoden IDO1 pudotus soluja verrattuna keskimääräiseen KYN tuotantoa SKOV-3 transfektoitu ilman siRNA tai ei-suunnattu siRNA ohjaus (Kuva. 1 E), mikä viittaa siihen, että IDO1 on pääasiassa vastuussa perustava KYN tuotannon SKOV-3-soluissa. Vaikutuksen määrittämiseksi 1-MT käsittely immunomodulatorinen fenotyypin syöpäsolut, SKOV-3 /MLR yhteisviljelmä kokeet suoritettiin. Lisäämällä KYN (Fig. 2A) tai läsnäolon SKOV-3-solut (Fig. 2B) esti alloreaktiivisten T-solujen lisääntymistä MLR. Knockdovvn IDO1 siRNA paitsi päinvastaiseksi SKOV-3 soluvälitteistä suppression T-soluproliferaation, mutta jopa lisääntynyt T-soluproliferaation (kuvio. 2C), mikä johtui todennäköisesti lisää allogeenisen stimulaation T-solujen IDO-puutteellinen SKOV-3 solut. Seuraavaksi testattiin vaikutuksia kahden stereoisomeerien 1-MT. Lisäksi 1-metyyli-L-tryptofaani (1-L-MT) myös kääntyi poistaminen T-solujen proliferaation SKOV-3 /MLR yhteisviljelmä kokeissa (Fig. 2D). Yllättäen, T-solujen proliferaatio ei lisääntynyt, mutta inhiboitui keraviljelmiä käsiteltiin 1-metyyli-D-tryptofaani (1-D-MT, Fig. 2E). Lisääminen trp ei muuttanut tätä estoa, mikä osoittaa, että trp ehtyminen ei ole mukana tässä paradoksaalinen vaikutus 1-D-MT (Fig. 2F). Seuraavaksi analysoitiin vaikutusta 1-D-MT on solusyklin etenemisen ja leviämisen SKOV-3-soluja, kuten estävä vaikutus 1-D-MT SKOV-3-soluja voisi selittää vähentää

3H tymidiinin yhteisviljelmä kokeissa (Fig. 3). Kuitenkin 1-D-MT muuttunut kumpikaan

3H tymidiinin (Fig. 3A) eikä solusyklin etenemistä SKOV-3-solut (Fig. 3B). Sulkea pois, että 1-D-MT ehkä esti

3H tymidiiniotto SKOV-3-soluja ainoastaan ​​silloin, kun nämä viljeltiin MLR T-soluproliferaatiota keraviljelmien on SKOV-3-solujen MLR: n läsnä ollessa eri pitoisuudet 1-D-MT mitattiin CFSE värjäys ja virtaussytometria (Fig. 3C). 1-D-MT pitoisuus riippuvasti esti T-soluproliferaatiota myös näissä määrityksissä (Fig. 3C), mikä vahvistaa, että 1-D-MT inhiboi T-solujen lisääntymistä eikä leviämisen SKOV-3 solujen keraviljelmiin.

(A) Suhteellinen mRNA ilmaus kolmen trp hajottavien entsyymien IDO1, IDO2 ja tryptofaani-2,3-dioksigenaasin (TDO) (valkoiset pylväät) ja KYN tuotanto (musta palkki) on SKOV-3-soluissa mitattuna kvantitatiivinen RT-PCR: llä ja suuren erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC). (B) knockdovvn

IDO1

mRNA siRNA mitattuna qRT-PCR. (C) Western blot-analyysi osoittaa IDO1 proteiinin ilmentymistä SKOV-3 solujen siRNA välittämää knockdovvn IDO1 verrattuna kontrolleihin. (D) Immunosytokemia (punainen, IDO1 värjäys, sininen, DAPI tumavärjäystä) valvonta- SKOV-3-soluissa ja Skov-3 solujen IDO1 knockdown. (E) Kyn vapautuminen SKOV-3-solujen jälkeen knockdovvn IDO1 verrattuna kontrolleihin. Kokeet suoritettiin vähintään kolmena kappaleena. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM. * (P 0,05).

(A) Alloreaktiiviset T-solujen lisääntymisen jälkeen lisätty 25 uM KYN sekalaisia ​​valkosolujen reaktioita (MLR). (B) Alloreaktiiviset T-solujen proliferaatiota, kun läsnä on 6000 SKOV-3-soluja. (C) T-solujen lisääntymistä MLR viljellään kanssa 2000 ohjaus SKOV-3-solut (valkoiset bar) tai 2000 SKOV-3 solut knockdovvn IDO1 (musta palkki). (D) T-solujen lisääntymistä keraviljelmistä MLR kanssa 2000 SKOV-3-soluja lisäyksen jälkeen kasvavia konsentraatioita 1-L-MT. (E) T-solujen lisääntymistä keraviljelmistä MLR kanssa 2000 SKOV-3-soluja lisäyksen jälkeen kasvavia konsentraatioita 1-D-MT. (F) edustaja tulos MLR /SKOV-3 yhteisviljelmä kokeiluja PBMC viidestä eri luovuttajien ja 2000 tai 6000 SKOV-3-soluissa. Soluja käsiteltiin tai ilman 1 mM 1-D-MT yhdessä tai ilman 250 uM trp. Proliferaatio mitattiin

3 [H] methylthymidine ottoa. Kokeet suoritettiin vähintään kolmena kappaleena. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM. * (P 0,05).

(A)

3 [H] methylthymidine sisällyttäminen SKOV-3-solut käsiteltiin 1 mM 1-D-MT (musta palkki) tai ajoneuvo (valkoiset bar) 6 päivää. (B) Cell cycle analyysi SKOV-3-soluja käsiteltiin 1 mM 1-D-MT tai ajoneuvon 48 tuntia. (C) leviämisen analyysi CFSE-värjättyä imusolujen 6 päivää keraviljelmistä MLR kanssa 2000 SKOV-3-soluissa, käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla 1-D-MT (ylempi paneeli). Juoni solujen määrä jokaisessa sukupolvessa yllä kokeen (alempi kuva).

1- D-MT lisää KYN tuotantoa ihmisen syöpäsoluja

testataan vaikutus 1-MT on KYN tuotannon SKOV-3-soluissa. Yllättäen 1-D-MT pitoisuus riippuvalla kasvoi KYN muodostumista (Kuva. 4A), kun taas sen stereoisomeerin 1-L-MT esti KYN muodostus odotetusti (Fig. 4A). Raseeminen seos 1-MT, jota on käytetty monissa tutkimuksissa, mukaan lukien ne, jotka ovat perustaneet IDO1 immunosuppressiivisena entsyymi, inhiboi KYN muodostumista, vaikkakin vähemmän kuin 1-L-MT yksinään (Fig. 4A). Kuten trp pitoisuudet media voi olla rajoitettu kasvu KYN tuotantoa, olemme mitattiin myös KYN pitoisuudet tuotetaan SKOV-3-soluja vasteena 1-D-MT: n läsnä ollessa yhä trp pitoisuuksina. Näissä olosuhteissa paljon korkeampia KYN pitoisuudet saavutettiin (Fig. 4B), mikä viittaa siihen, että tasanko edellä todetaan pitoisuudet noin 250 pM 1-D-MT (Fig. 4A) johtui rajoitettu trp saatavuus. Trp pitoisuudet soluviljelyalustoissa yleensä vaihtelevat välillä 12 ja 20 uM, kun taas pitoisuudet ihmisellä seerumin välillä 50 ja 70 uM. Kyn muodostumista soluissa, joita käsiteltiin 1-D-MT oli selvempi, kun trp-pitoisuuksia on läsnä ihmisen seerumissa (62,5 uM) kuin trp pitoisuudet läsnä soluviljelyaineessa (15 uM) käytettiin (Fig. 4C). Kuitenkin kertainen nousu Kyn lisäämällä trp oli sama käsitellyissä soluissa tai ilman 1-D-MT (Fig. 4C). Edelleen testata, onko 1-D-MT suoraan vaikuttaa IDO1 entsyymiaktiivisuuden mittasimme IDO1 välittämää KYN tuotantoa SKOV-3 solu-uutteiden. 1-D-MT ei muuttanut KYN muodostumista riippumatta siitä, onko trp oli läsnä kiinteä pitoisuus on 100 uM (Fig. 4D) tai pitoisuuksina ekvimolaarinen 1-D-MT (Fig. 4E), mikä viittaa siihen, että kasvu KYN muodostumiseen 1-D-MT in SKOV-3 ei välitä suoraa vaikutusta 1-D-MT IDO1 entsymaattiseen aktiivisuuteen.

(A) Kyn pitoisuudet vapautuu SKOV-3-solujen hoidon jälkeen 1- D-MT (valkeat ympyrät), 1-L-MT (mustat ympyrät), ja raseeminen seos 1-MT (musta kolmio) mitataan 48 tunnin kuluttua HPLC: llä. (B) Kyn vapautuminen SKOV-3-soluja vasteena 500 uM 1-D-MT: n läsnä ollessa yhä trp pitoisuuksina. (C) Kyn vapautuminen SKOV-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla trp yksinään (avoimet ympyrät) tai yhdessä 1 mM 1-D-MT (täytetyt ympyrät) mitataan 48 tunnin kuluttua HPLC: llä. (D) Kyn tuotannon IDO1 entsyymitestejä suorittaa, kun läsnä on 100 uM trp yhdessä yhä 1-D-MT pitoisuudet. (E) Kyn tuotanto IDO1 entsyymin läsnä ollessa kasvavia pitoisuuksia trp yksinään (avoimet ympyrät) tai yhdessä 1-D-MT (täytetyt ympyrät). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM. * (P 0,05).

IDO1 ilmentymistä tehostaa 1-D-MT ihmisen syöpäsoluissa

Seuraavaksi tutkimme, 1-D-MT vaikuttanut ilmaus trp-metaboloivia entsyymejä. Yllätykseksemme huomasimme, että 1-D-MT kasvoi IDO1 mRNA ja proteiini SKOV-3-soluissa, kun taas IDO2 ja TDO pysyi muuttumattomana (kuvio. 5A). Säätelyä IDO1 mRNA oli pitoisuudesta riippuva (Fig. 5B) ja havaittiin ensimmäisen kerran sen jälkeen, kun 16 tunnin inkubaation 1-D-MT (Fig. 5C). Tärkeää on, että IDO1 edistävät vaikutukset eivät rajoitu SKOV-3-soluja. Vaikka 1-D-MT ei indusoinut

de novo

IDO1 mRNA ilmaisun ja KYN tuotannon IDO1-negatiivisten HeLa kohdunkaulankarsinooma soluja, se lisäsi IDO1 mRNA ja KYN tuotannon jälkeen induktion IDO1 ilmaisun ja KYN tuotannon IFN- γ (Fig. 6A, B). Mielenkiintoista on, että 1-D-MT-välitteistä säätelyä IDO1 mRNA monissa IDO1-negatiivinen syöpäsoluja oli differentiaalisesti riippuvainen pitoisuudesta IFN-γ, jota on käytetty indusoimaan

de novo

ilmentymisen IDO1 (Fig. 6C). Stimulaation jälkeen asianmukaiset IFN-γ pitoisuudet, 1-D-MT kasvoi IDO1 mRNA ja KYN tuotannon paneelin eri syöpäsoluja (Fig. 6C-F), joka ilmaisee yleisen mekanismin 1-D-MT-aktivaatio IDO1 .

(A) Vasen paneeli: mRNA ilmaus IDO1, IDO2 ja TDO in SKOV-3-solujen hoidon jälkeen 1 mM 1-D-MT, analysoida sen jälkeen 24 h qRT-PCR. Oikea paneeli: Western Blot analyysi IDO1 ilmentymisen SKOV-3-soluissa suoritettiin 48 tunnin jälkeen 1 mM 1-D-MT. GAPDH toimi latauskontrollina. (B) IDO1 mRNA: n ekspressio vasteena kasvavia konsentraatioita 1-D-MT mitattiin 24 tunnin kuluttua, jonka qRT-PCR: llä. (C) Aika tietenkin analyysi IDO1 mRNA induktion 1 mM 1-D-MT, analysoitiin qRT-PCR. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM. * (P 0,05).

(A) edustaja HPLC kuvaajat KYN tuotannon HeLa-solut, jotka olivat joko käsittelemättömiä, käsiteltiin 1 mM 1-D-MT: n ja /tai 1000 U IFN y 72 tuntia. Imeytyminen KYN mitattiin 365 nm. (B) hoitamattomien HeLa-soluja 1 mM 1-D-MT ei indusoinut

de novo

IDO1 mRNA, mutta kasvoi IDO1 mRNA jälkeen induktion 1000 U IFN-γ-mRNA: n ilmentyminen analysoitiin qRT-PCR: llä 24 h hoidon jälkeen. (C) edustaja esimerkki vaikutus eri IFN-γ pitoisuudet IDO1 mRNA induktion 1-D-MT, esitetään U251 glioomasoluissa. (D) IDO1 mRNA: n ilmentymisen näyttämän solulinjoja stimuloitiin 24 tuntia asianmukaiset konsentraatiot IFN-γ yksinään (valkoiset pylväät) tai yhdessä 1 mM 1-D-MT (mustat palkit). (E) Havaintoesimerkki IDO1 mRNA induktion 200 uM 1-D-MT IFN-γ-stimuloitujen T98G gliooma soluja. (F) Kyn vapautuminen osoitetun solulinjoja stimuloitiin 72 tunnin asianmukaiset konsentraatiot IFN-γ yksinään (valkoiset pylväät) tai yhdessä 1 mM 1-D-MT (mustat palkit), HPLC: llä mitattuna. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM. * (P 0,05).

1-D-MT-välitteisen IDO1 ekspressioon liittyy JNK ja p38 MAPK

Sitten tutkitaan signalointireiteissä mukana ylösajon IDO1 vastauksena 1-D-MT hoitoon. IFN-välitteisen STAT1 fosforylaation on mukana induktioon IDO1 monissa eri soluissa ja kudoksissa [30], mutta pudotus ja STAT1 siRNA ei vähennä KYN tuotantoa 1-D-MT-käsitellyt solut (Fig. 7A). Tämän mukaisesti tulos, 1-D-MT ei indusoinut mRNA: n ilmentymisen IFN-β tai IFN-γ (Fig. 7B). Mitogeeni aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) väyliä on raportoitu moduloivan raseemisen seoksen 1-MT ja siten vaikuttaa polarisaatio dendriittisolujen (DC) [31]. Siksi testataan, onko estyminen MAPK signaloinnin vaikutti 1-D-MT-välitteisen kasvu IDO1 ilme. Esto ERK fosforylaation PD98059 vaikuttaa IDO1 mRNA ilmaisun ja KYN vapautuminen ei käsittelemättömästä eikä 1-D-MT käsitellyt solut (Fig. 8A). Vaikka p38-MAPK fosforylaatiota SB203580 [32] laskee hieman IDO1 mRNA käsittelemättömissä soluissa, se lähes kokonaan lieventää kasvu IDO1 mRNA ilmaisun vastauksena 1-D-MT (Fig. 8B). Lievä esto IDO1 aukikirjoitettuna käsittelemättömissä soluissa eivät johtaneet merkittävästi vähentää KYN julkaisu, kun taas väheneminen KYN julkaisu tuli merkittävä 1-D-MT käsitellyt solut (Fig. 8B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun inhiboivat JNK mukaan SP600125 (Fig. 8C) [33]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että p38 MAPK ja JNK signalointi ovat mukana välittämässä induktioon IDO1 vasteena 1-D-MT.

(A) knockdovvn STAT1 mRNA: si-RNA: ta (valkoiset pylväät) ei vaikuttanut Kyn release (mustat palkit) 1-D-MT (1 mM) käsiteltiin SKOV-3-soluissa. (B) analyysi IFN-γ: n ja IFN-β-mRNA: n ilmentyminen SKOV-3-soluja stimulaation jälkeen 1 mM 1-D-MT: ssa 24 tuntia.

IDO1 mRNA (vasen paneeli) ja KYN julkaisu (oikea paneeli) ja SKOV-3-soluja käsiteltiin (A) 50 uM MEK1-inhibiittori PD98059, (B) 20 uM p38 MAPK-inhibiittori SB203580 ja (C) 20 uM JNK-inhibiittori SP600125 tai valvontaa 1 tunnin ajan ennen lisäämällä 1 mM 1-D-MT analysoitiin qRT-PCR: llä 24 tunnin kuluttua, ja HPLC 48 tunnin jälkeen, vastaavasti. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM. * (P 0,05).

Keskustelu

Aiemmin IDO inhibitio oli enimmäkseen saavuttaa käyttämällä raseeminen seos 1-MT [34]. Kuten kävi ilmi, että IDO esto voi olla lupaava kohde syövän hoidossa, yksittäiset stereoisomeerit 1-MT tutkittiin tarkemmin [5], [35]. Vaikka 1-L-MT osoitettiin tehokkaammin estää IDO1 entsyymimäärityksissä ja syöpäsolulinjoissa, 1-D-MT osoitti parempia tuumorin vastaista aktiivisuutta hiiren malleja ja valittiin siksi kliinisissä tutkimuksissa [35]. Myöhempi tutkimus ehdotti, että ylivoimainen anti-kasvain aktiivisuutta 1-D-MT voi johtua esto IDO2 isoformin [27]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että 1-D-MT estää IDO aktiivisuutta ole dendriittisoluissa eikä kasvainsoluissa [26], [28] eikä tehokkaasti palauta IDO aiheuttama pidätys T-solujen lisääntymistä [36]. Tutkimuksessamme 1-D-MT tukahdutetaan T-solujen proliferaatiota, kun konstitutiivisesti IDO1-ilmentävien SKOV-3-soluja viljeltiin yhdessä kanssa sekalymfosyyttireaktiot (Fig. 2E, F). Tutkimuksen taustalla olevien mekanismien yllättäen ilmi, että 1-D-MT lisäsi KYN tuotantoa syöpäsolut IDO1 aktiivisuutta (Fig. 4, 6), mikä johtuu säätelyä IDO1 mRNA ja proteiinin ilmentymisen (Fig. 5, 6). Ylössäätelyyn IDO1 ilmentymisen ja aktiivisuuden havaittiin vain syöpäsolut joko konstitutiivisia tai IFN-γ-indusoidun IDO1 ilmentymistä (Fig. 5, 6). Säätelyä IDO1 1-D-MT monissa syöpäsoluissa oli voimakkaimmillaan kohtalainen pitoisuudet IFN-γ, jotka todennäköisesti muistuttavat fysiologisia pitoisuudet (Fig. 6C). Pieninä pitoisuuksina IFN-γ ei ehkä indusoi riittävää IDO1 ilmentymistä (Fig. 6C), mahdollisesti miksi 1-D-MT ei lisätä IDO1 näissä pitoisuuksissa, kun taas stimulaatio erittäin suuria pitoisuuksia IFN-γ voivat aiheuttaa maksimaalisen IDO1 induktio (Fig. 6C), mikä selittää edelleen nousevat 1-D-MT ei havaittu. Kaikissa tutkittiin IDO1 ilmentävien solujen lisääntymistä IDO1 ilmaisun ja KYN vapautuminen havaittiin vasteena käsittelemällä 1-D-MT, joka osoittaa yleisesti mekanismi, joka osallistuu 1-D-MT-välitteisen IDO1 induktio (Fig. 4, 5, 6).

Aikaisemmassa tutkimuksessa, raseemisen seoksen 1-MT on raportoitu muuttaa polarisaation dendriittisolujen (DC) moduloimalla MAPK [31]. P38 MAPK fosforylaation esti kasvua IDO1 mRNA ja KYN tuotanto 1-D-MT (Fig. 8B), mikä viittaa siihen, että p38-MAPK osallistuu 1-D-MT-välitteistä signalointia. Tämän mukaisesti tulos, p38 MAPK on aiemmin osoitettu myötävaikuttavan induktioon IDO1 on leukemiasolulinja ja DC [37], [38]. Lisäksi esto JNK signaloinnin lieventää induktion IDO1 mRNA: ta ja KYN vapautumista, kun läsnä on 1-D-MT (Fig. 8C). Esto JNK fosforylaation on hiljattain ilmoitettu vähentävän IDO1 ilmaisun aiheuttama LPS hiiren microglia [39]. 1-D-MT välittämää modulaatio p38-MAPK ja JNK ehdottaa, että 1-D-MT voi olla enemmän vaikutusta kuin vain säätelyä IDO1.

Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti 1-D- MT-välittämiä vaikutuksia geenien ilmentyminen ihmissoluissa. Stereoisomeeria 1-D-MT, 1-L-MT raportoitiin äskettäin tukahduttaa IFN-γ-indusoima IDO1 hiiren peräsuolen karsinooman solut [40]. Lisäksi se on kuvattu aikaisemmin, että 1-MT vaikuttaa DC: n kypsymistä riippumatta IDO [31]. Kuitenkin raseemisen seoksen 1-MT käytettiin tässä tutkimuksessa, ja sitä on siksi ei tiedetä, mikä stereoisomeeri on vastuussa havaituista vaikutuksista [31]. On vielä selvittämättä, onko 1-D-MT kykenee enemmän vaikutuksia geenien ilmentymisen kuin sääntelyn IDO1. Toisin IDO1, trp-katabolisoimien entsyymin IDO2 ei indusoitunut 1-D-MT. Tämä havainto korostaa käsitystä, että IDO1 ja IDO2 differentiaalisesti säädellään transkription tasolla [27]. Mahdolliset muut vaikutukset 1-D-MT-geenin ilmentyminen voi edistää korkean antituumoritehoon 1-D-MT havaittiin hiiren kasvainmalleissa [35]. Merkittävät erot IDO ilmaisun ja sääntelyn välillä ihmisten ja hiirten [29], [41], joka voisi selittää havaitun poikkeamia: 1-D-MT toimintaa hiiren malleissa ja ihmisen soluja. Tutkimuksessa, jossa käytettiin 1-D-MT SIV-tartunnan reesusapinat, malli muistuttavat enemmän ihmisten kuin hiiren mallia, Boasso ja kollegat havaittu, että KYN plasmassa eivät vähentää, vaan indusoidun hoidon aikana 1-D-MT [42 ]. Lisääntynyt IDO1 mRNA ilmaisun imusolmukkeissa makakit jälkeen 1-D-MT hoito tulkittiin korvaavia counterregulatory mekanismi aktivoidaan 1-D-MT, joka on saattanut muodostaa puuttumisen vaikutusta plasman KYN [42]. Tuloksemme osoittavat, että säätelyä IDO1 ja KYN tapahtua myös eristetyissä ihmisen soluissa, jossa counterregulatory mekanismin, joka välittää immunosuppressio on epätodennäköistä.

Koska on olemassa näyttöä, että IDO1 voi rajoittaa kasvaimen kasvua välittäjänä tuumorisidistä IFN -γ kokeellisissa malleissa ja potilaat [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22] ja kuten IDO1 ilmentyminen kasvaimissa korreloi positiivisesti ilman taudin etenemistä ja pitkä- aikavälillä säilyttämään joissakin tutkimuksissa [23], [24] on houkuttelevaa spekuloida, että induktio IDO1 1-D-MT voi todella selittää osan anti-kasvain vaikutuksia 1-D-MT.

Yhteenvetona olemme tunnistaneet voimistumista IDO1 ilmentymistä ihmisen syöpäsoluja niin syvällinen vaikutus 1-D-MT, yhdiste käytetään nykyään kliinisissä tutkimuksissa potilailla, joilla oli uusiutunut tai refraktorinen kiinteiden kasvaimien tavoitteenaan estävä (IDO ) -välitteisen kasvain immuuni paeta. IDO1 ilmaisun tiedetään olevan immunosuppressiivisia, ja se voi parantaa kasvaimen immuunijärjestelmän paeta, mutta se on myös liitetty suoraan antituumorivaikutuksia. Lisää tutkimuksia tarvitaan paremmin ymmärtää roolin IDO syövän biologian ja mahdollista käyttöä 1-D-MT kuin solunsalpaajaksi.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

SKOV-3 ja NIH: OVCAR-3-munasarjakarsinooma- soluja viljeltiin McCoyn 5A Medium (BioConcept, Allschwil, Sveitsi), johon oli lisätty L-trp kuten (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa), 300 mg /L Glutamiini (Carl Roth, Karlsruhe, Saksa), 10% FBS (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) ja 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (PAA Laboratories, Pasching, Itävalta). HeLa kohdunkaulan karsinooman solut, A375 pahanlaatuinen melanooma-soluja, LN18, LNT229, T98G ja U251 malignia glioomaa soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, PAA), joka sisälsi 10% FBS: ää (Thermo Fisher Scientific Inc) ja 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (PAA Laboratories). Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC) eristettiin viidestä terve, ei-liittyvä veren luovuttajilta tiheys-gradienttisentrifugoinnilla käyttämällä lymfosyyttien erotusväliaineeseen LSA 1077 (PAA Laboratories) ja niitä viljeltiin RPMI 1640 (PAA Laboratories), joka sisälsi 10% FBS: ää (Thermo Fisher Scientific Inc) ja 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (PAA Laboratories). Kaikki solut testattiin rutiininomaisesti saastumiselta Multiplex solu Epäpuhtaudet Test [43]. Viljelmiä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä.

20 mM kantaliuoksia 1-metyyli-D-tryptofaani (1-D-MT, eränumeroita: 09315BH, 08007EJ) ja 1-metyyli-L-tryptofaani (1-L-MT, eränumeroita: 08023HE, 15399MJ) (Sigma-Aldrich) valmistettiin liuottamalla inhibiittorit 0,1 N NaOH: lla. PH säädettiin arvoon 7,5 käyttäen suolahappoa. Saastumisen välttämiseksi on soluviljelmien kantaliuokset filfotered läpi 0,2 um suodattimia. IFN-γ hankittiin Immunotools (Friesoythe, Saksa). ERK-fosforylaation estyi käyttämällä MEK1-inhibiittori PD98059 (Cell Signaling Technology, Beverly MA, USA). C-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) estäjä SP600125 ja inhibiittori p38-kinaasin fosforylaation SB203580 ostettiin Enzo Life Sciences (Lörrach, Saksa).

Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) B

korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) -analyysi suoritettiin [44] käyttäen Beckman HPLC-fotodiodimatriisilla (PDA) havaitseminen ja Lichrosorb RP-18-kolonnia (250 mm x 4 mm ID, 5 um, Merck, Darmstadt, Saksa ). Kyn vapautuminen ja trp hajoaminen mitattiin keskipitkällä 3 * 10

5 solua 2 ml: ssa McCoyn 5A Medium (BioConcept), joka sisälsi 10% FBS (Perbio), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (PAA Laboratories ) täydennettynä 0-125 uM L-trp (Sigma-Aldrich). Elatusaine kerättiin 6 kuoppalevyille ilmoitettuina ajankohtina, sentrifugoitiin ja pakastettiin lisäanalyyseihin saakka. Sulatuksen jälkeen näytteet täydennettiin trikloorietikkahapolla proteiinin saostumisen, sentrifugoitiin ja 100 ui supernatanttia analysoitiin HPLC: llä. Standardikäyrät tuotettu L-KYN ja L-trp (Sigma-Aldrich) samassa väliaineessa. Koska FBS sisältää KYN, alhainen KYN pitoisuuksina (~ 1 uM) havaittiin kaikissa näytteissä ja keskisuurten ilman soluja oli aina mitataan ja niitä verrataan.

Quantitative (q) RT-PCR

Yhteensä RNA eristettiin Qiagen RNAeasy RNA: n eristys-kittiä (Hilden, Saksa) ja DNA syntetisoitiin Applied Biosystems käänteistranskriptiotuotteiden-Kit (Foster City, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. QRT-PCR muotoon ABI 7000 -lämpösyklilaitteella kanssa SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) standardimenetelmien mukaisesti. PCR-reaktiot tarkistettiin sisällyttämällä ei-RT-valvonnan laiminlyöntiin malleja ja sekä sulamiskäyrä- ja geeli analyysi. Standardikäyrät luodaan jokaista geeniä. Suhteellinen kvantitointi geenin ilmentyminen määritettiin vertaamalla raja-arvoja. Kaikki tulokset normalisoitiin GAPDH, joka vaihteli ei ole IFN-γ eikä 1-D-MT hoitoon.

Alukesekvenssit olivat (5′-3 ’eteenpäin, taaksepäin):

CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC, TGAGCGATGTGGCTCGGCT (GAPDH),

TTCAGTGCTTTGACGTCCTG, TGGAGGAACTGAGCAGCAT (IDO1),

TGCTTCATGCCTTTGATGAG, GAAGGCCTTATGGGAAGGAG (IDO2),

ACTGCCTCAAGGACAGGATG; AGCCAGGAGGTTCTCAACAA (IFN-β),

TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA; TCCTTTTTCGCTTCCCTGTTTT (IFN-γ),

AGGAAAAGCAAGCGTAATCTTCA; TATTCCCCGACTGAGCCTGAT (STAT1),

GGTTCCTCAGGCTATCACTACC; CAGTGTCGGGGAATCAGGT (TDO)

siRNA kokeita

pudotus IDO1 (INDO) ja STAT1 ON-TARGETplus SMART-allas siRNA by Dharmacon RNA Technologies (Lafayette, CO, USA) käytettiin.

sekvenssit olivat seuraavat:

Human INDO, NM_002164

, sense, 5′-UCACCAAAUCCACGAUCAUUU-3 ’, antisense, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′; sense, 5’-UUUCAGUGUUCUUCGCAUAUU-3 ’, antisense, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′; sense, 5’-GUAUGAAGGGUUCU GGGAAUU -3 ’, antisense, 5′-PUUCCCAGAACCCUUCAUACUU-3′; sense, 5’-GAA CGGGACACUUUGCUAAUU-3 ’, antisense, 5′-PUUAGCAAAGUGUCCCGUUCUU-3’

Human STAT1, NM_139266

, sense, 5′-GCACGAUGGGCUCAGCUUUUU-3 ’, antisense, 5 ”-PAAAGCUGAGCCCAUCGUGCUU-3 ’; sense, 5’-CUACGAACAUGACCCUAUCUU-3 ’, antisense, 5′-PGAUAGGGUCAUGUUCGUAGUU-3′; sense, 5’-GAACCUGACUUCCAUG CGGUU-3 ’, antisense, 5′-PCCGCAUGGAAGUCAGGUUCUU-3′; Tavallaan 5’-AGAAAGAG CUUGACAGUAAUU-3 ’, antisense, 5′-PUUACUGUCAAGCUCUUUCUUU-3’.

ON-TARGETplus siCONTROL Non-kohdistaminen allas (D-001810-10-05, Dharmacon) ja transfektio ilman siRNA käytettiin negatiivisina kontrolleina.

transfektion siRNA, The Amaxa Nucleofector Kit V (Amaxa Biosystems, Köln, Saksa) käytettiin. Lyhyesti, 3 * 10

5-solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan Nucleofector liuoksen V ja sekoitetaan 1,5 ug siRNA, sitten elektroporaatiolla käyttäen ohjelmaa V005. Medium vaihdettiin 24 tunnin kuluttua, analyysi KYN sisällön väliaineen HPLC, sadonkorjuu solujen RNA uuttamalla tai tuottaa lysaatit ja immunosolukemiallisten analyysi tehtiin 48 tunnin jälkeen.

Western blot-analyysi

kokosolulysaateille valmistettiin jääkylmään tris (hydroksimetyyli) aminometaani-hydrokloridia (tris-HCI, 50 mM, pH 8,0, Carl Roth), joka sisälsi 150 mM NaCl: a (JT Baker, Deventer, Alankomaat), 1% Triton X-100 (AppliChem, Darmstadt, Saksa), 10 mM EDTA (GERBU Biotechnik, Gaiberg, Saksa), 200 mM ditiotreitoli (Carl Roth), 3% 2-merkaptoetanolia (Sigma-Aldrich), 100 uM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi (PMSF), 10 ug /ml aprotiniinia ja 5 ug /ml leupeptiiniä (Carl Roth), ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa (10 min, 13 000 rpm).