Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

potilaiden määrä, joilla kohtukarsinooma (EMCA ) kanssa pitkälle edenneessä vaiheessa tai korkea histologinen arvosana kasvaa ja ennusteen ei ole parantunut viime vuosikymmenen aikana. On kiireesti löytö uusia molekyylikohteista diagnoosiin, ennusteen ja hoidon EMCA, mikä on mahdollista parantaa kliinistä strategiaa ja tuloksista tämän taudin.

Menetelmät ja tulokset

Käytimme ”pora-alas” proteomiikka lähestymistapa tunnistamisen helpottamiseksi uusien molekyylikohteista diagnoosiin, ennustetta ja /tai terapeuttisen intervention EMCA. Perustuen peptidi-ioneja tunnistetaan ja niiden retentioajat ensimmäisen LC-MS /MS-analyysia poissulkemisluettelon luotiin myöhempää toistojen. Kaikkiaan 1529 proteiineja on tunnistettu alle Proteinpilot® 5% virhe kynnyksen seitsemän sarjaa iTRAQ kokeita. Keskimäärin toisen iteroinnin lisätty 78% uusia peptidejä niille tunnistetaan sen jälkeen kun ensimmäisen kierroksen, kun taas kolmas iteraatio lisätty 36% ylimääräistä peptidejä. Niistä 1529 proteiinit tunnistettu, vain 40 täytti meidän kriteerit merkittävä ero ilmentyminen EMCA verrattuna normaaleihin proliferatiivisten kudoksiin. Nämä proteiinit sisältyvät metabolisia entsyymejä (pyruvaattikinaasia M2 ja laktaattidehydrogenaasi A); kalsiumia sitovia proteiineja (S100A6, calcyphosine ja calumenin), ja proteiinit, jotka ottavat säätelyyn tulehduksen, proliferaation ja invaasiota (anneksiini A1, interleukiini tehostajana sitova tekijä 3, alfa-1-antitrypsiini, makrofagin rajaaminen proteiinia ja katepsiini B). Verkko-analyysit paljastivat sääntely näiden molekyylikohteista c-myc, Her2 /neu ja TNF-alfa, mikä viittaa intervention näiden reittien saattaa olla lupaava strategia kehittää uusia molekyylitason kohdennettuja hoitoja EMCA.

Johtopäätökset

analyysit paljastivat merkitys lähennys proteomiikka lähestymistapa yhdistettynä iTRAQ ratkaista joitakin rajoituksia nykyisen proteomiikka strategioita. Tutkimuksen pohjalta tunnistamiseen useita uusia molekyylikohteista ottaa terapeuttisia mahdollisuuksia kohdennettujen molekyylien hoitoja kohtukarsinooma.

Citation: Voisin SN, Krakovska O, Matta A, DeSouza LV, Romaschin AD, Colgan TJ, et ai. (2011) tunnistaminen Novel Molecular tavoitteet endometriumsyöpään käyttäminen Lähennä- LC-MS /MS lähestyminen iTRAQ. PLoS ONE 6 (1): e16352. doi: 10,1371 /journal.pone.0016352

Editor: Yang Cai, The Research Institute for Children, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 elokuu 2010; Hyväksytty: 20 joulukuu 2010; Julkaistu: 31 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Voisin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tuki Kanadan Cancer Society Research Institute (aiemmin National Cancer Institute of Canada) kiitettävällä. AB SCIEX tarjotaan infrastruktuurin ja reagenssi tukevat tätä tutkimusta; Ajay Matta on vastaanottajaa MITACS Accelerate Fellowship, Ontario, Canada. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa. AB SCIEX tarjoaa infrastruktuurin ja reagenssi tukevat tätä tutkimusta, mutta ei ole toimituksellista panosta käsikirjoitus. Edelleen, tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

kohtukarsinooma (EMCA) on neljänneksi eniten esiintyy syöpä naisilla Pohjois-Amerikassa, jossa 42160 uutta tapausta ja 7780 kuolemantapausta odotetaan tänä vuonna pelkästään Yhdysvalloissa [1]. On olemassa kaksi erilaista kohdun limakalvon syöpä: tyyppi I EMCA of endomet- histologian ja tyypin II EMCA joka on serooseista tai selvä solun morfologia, jälkimmäistä tyyppiä tyypillisesti aggressiivisempia kahdesta. Tyyppi I EMCA on yhteinen muoto kohdun limakalvon syöpä, joka muodostaa noin 70-80% kaikista tapauksista [2], [3]. Diagnoosi perustuu pääosin histologinen tutkimus kudosten jälkeen saatu koepala, invasiivisen toimenpiteen tyypillisesti seurauksena tutkiva diagnoosin yhteydessä epänormaali kohdun verenvuotoa esitys. Kohdun limakalvon karsinoomat ovat hoitaneet pääasiassa avulla leikkauksen ylimääräisiä säteilyä ja /tai kemoterapiaa, ja suhteellisen suotuisia on saavutettu toimittaneet syövät havaitaan aikaisessa vaiheessa. Kuitenkin potilaiden määrä EMCA edennyt pitkälle tai korkea histologinen arvosana, joka on osoitus huono ennuste, on kasvussa [2], [4]. On kiireesti löytö uusia molekyylikohteista diagnosointiin, ennusteen ja hoidon EMCA, mikä on mahdollista parantaa kliinistä strategiaa ja tuloksista tämän taudin.

Viime aikoina on ollut voimakasta kiinnostus tutkimuksessa globaalin proteiinin ilmentymisen, ja proteomiikka lähestymistavat näyttävät esittää uuden strategian syöpätutkimuksen ja tunnistaakseen uusia biomarkkereita kliiniseen käyttöön. Lukuisat proteomic suorittamat tutkimukset ovat viime vuosina yritetty löytää mahdollisia syöpää biomarkkerit läpi ero proteiinin seulonnan avulla syöpä ja ei-syöpä kudoksiin [5] – [9]. Yksi laajalti käytetty teknologia biomarkkereiden löytö on alhaalta ylöspäin suuntautuva lähestymistapa, johon liittyy kemiallisia merkintöjä peptidien johtuvat entsymaattisesti näytteen proteiinien, minkä jälkeen sekoitettiin ohjaus- ja testinäytteet ennen nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (LC MS /MS) analyysi varmistaa samanlainen kohtelu näytteistä [6], [7], [9]. Yleisimpiä näistä merkinnöistä reagenssien käytössä hetkellä isobaarinen tunnisteita suhteellisen ja absoluuttisen kvantifiointi (iTRAQ) [10]. Koodaus mahdollistaa erottaa muuten samanlaisia ​​peptidejä, jotka ovat peräisin yksittäisten näytteiden seoksessa kautta reportteri-ioneja muodostuu nämä tunnisteet, jotka sallivat suhteellisen kvantifioinnin tietyn peptidin näytteet, ja siten vastaavan proteiinin. Monimutkaisuuden vuoksi kudosnäytteitä, ennalta fraktiointi Näytteiden avulla voimakasta kationinvaihtohartsia (SCX) suoritetaan tyypillisesti ennen analyyttinen erottaminen on nanomittakaavan käänteisfaasi (RP) pylväs, joka on kytketty verkossa massaspektrometrin. Tästä huolimatta kaksiulotteinen kromatografisen erotuksen, on vielä taipumus suuri määrä peptidejä myötäeluoituvat aikana RP erottamisen, koska näytteen monimutkaisuus. Tämän seurauksena massa spektrometri on tyypillisesti vain voi tutkia osa peptidien ajan puutteen vuoksi. Eräässä automaattiset tiedonkeruu-, MS ohjelmisto suosii analyysiin runsain peptidien kustannuksella keraeluoituvan peptidien alemman runsaus. Kuten monet syövän kannalta relevantteja proteiineja, kuten signalointi ja säätelyproteiinit, tyypillisesti ilmaistu pieninä pitoisuuksina, tämä alhaalta ylöspäin, haulikko lähestymistapa on taipumus jäädä ilman hankkimisesta eniten arvokasta tietoa [11]. Mahdollinen ratkaisu tähän ongelmaan on toistuva analyysi samasta näytteestä, yhdistettynä poissulkemisluettelon tunnistettujen peptidien, joka syntyy jokaisen laskun jälkeen ja käytettiin huomioon valittaessa ionit, jotka on suunnattu MS /MS-analyysi myöhemmissä ajoja. Tämä strategia pakottaa massaspektrometri kohdistaa uusia, vähemmän runsas peptidien MS /MS-analyysi jokaisen peräkkäisen iteraation. Muunnelmia tämän lähestymistavan on raportoitu matriisi laserdesorptio /(MALDI) MS /MS ja ESI-MS /MS [12], [13].

Tutkimuksessa käytimme iteratiivista analyysiä , viitataan tässä ”porautua lähestymistapaa”, tunnistamisen helpottamiseksi uusien molekyylikohteista diagnoosiin, ennustetta ja /tai terapeuttisen intervention kohdun limakalvon syöpään. Päätavoitteena on tämän pora-alas tapa on kaivaa enemmän peptidejä. Kun ensimmäinen LC-MS /MS-analyysissä identifioitu peptidi-ionit ja niiden retentioajan lisättiin tuottamaan poissulkemisluettelossa edelleen toistojen LC-MS /MS-analyysi. Meidän lähestymistapamme on käsitteellisesti samanlainen ”valikoiva esiaste ionieksklusioon” (sel-PIE) kuvattua aiemmin Wang

et al.

[11]. Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta, kun tällainen yhdistelmä proteiinin kvantifiointiin käytetään iTRAQ merkintöjä ja iteratiivista analyysiä lähestymistapaa on käytetty löydettiin syöpä biomarkkereita.

Tulokset

tunnistaminen proteiinien avulla iteratiivista analyysi iTRAQ

yhteensä 1529 proteiinien on todettu Proteinpilot® luottamustasolla 95% seitsemästä sarjaa iTRAQ suoritettujen kokeiden tässä tutkimuksessa. Ensimmäisen ajon Kaikkien fraktioiden havaintojen mukaan yhteensä 1137 ei-tarpeeton proteiineja, toisen ja kolmannen toistojen osuus on loput 392 ei-tarpeeton proteiineja. Keskimäärin toisen iteroinnin lisätty 78% uusia peptidejä niille tunnistetaan sen jälkeen kun ensimmäisen kierroksen, kun taas kolmas iteraatio lisätty 36% enemmän peptidejä kuten kuvassa 1 ja taulukossa 1. Määrätyn joukon, noin 12% peptidien olivat yleisiä Minkä tahansa kahden peräkkäisen toistojen; kuitenkin vain 3-6% peptidien havaittiin kaikissa kolmessa toistojen. Kuten odotettua, nämä ylimääräiset peptidit paransi kattavuus tunnistettu proteiineja. Itse asiassa toisen iteroinnin lisätty 34% uusia proteiineja keskimäärin, kun taas kolmas iteraatio lisätään vain 14% yhdistetyn luettelon toistojen 1 ja 2; Näin ei ollut tarpeeksi halua tehdä vielä toistojen. 40% proteiineista tunnistettu ensimmäisen ajon aikana havaittiin myös kahden seuraavan toistojen (taulukko 1). Ja 1529 proteiinit, 623 tunnistettiin yksi peptidi; 423 joka osoitti ≥99% luottamuksellisesti. Loput 906 proteiinit tunnistettiin keskimäärin kuusi peptidejä proteiinia kohti, kun otetaan huomioon vain peptidien ≥95% luottamus tulokset. Ja 1529 tunnistettujen proteiinien tässä tutkimuksessa, 1260 proteiineista (ts 82%) oli iTRAQ suhde raportoitu EMCA kudosnäytteistä. Täydellinen luettelo tunnistetuista proteiineista ja niiden keskiarvo iTRAQ suhteet on saatavana taulukossa S1. Piirakkakuviota esittäen jakelun solutoiminnoille näistä proteiineista on esitetty kuviossa 2.

Keskimäärin toisen iteroinnin lisätty 78% uusia peptidejä niille tunnistetaan sen jälkeen kun ensimmäisen kierroksen, kun taas kolmas iteraatio lisätty 36% enemmän peptidejä. Tietyllä joukko, noin 12% peptidien olivat yhteisiä kaikille kahden peräkkäisen iteraation; kuitenkin vain 3-6% peptidien tunnistettiin kaikissa kolmessa toistojen.

tunnistaminen ilmentyvät eri proteiinien EMCA

Määritä ilmentyvät eri proteiineja jotka voivat toimia mahdollisina molekyylikohteista arviointia varten diagnoosin ja /tai ennusteeseen EMCA, kaikki proteiinit (n = 1529), joiden on tässä tutkimuksessa arvioitiin käyttäen kuvatut kriteerit Material Menetelmät jaksossa. Luettelo 40 proteiineja, jotka voivat toimia mahdollisina biomarkkereita EMCA on esitetty taulukossa 2. Näistä 40 biomarkkereiden ehdokasta, 38 tunnistettiin vähintään kaksi peptidejä. Kaksi poikkeusta (S100 kalsiumia sitova proteiini A6 ja beeta-2-glykoproteiini 1) otettiin mukaan, koska ne tunnistettiin peptidi ≥99% luottamuksellisesti, ja manuaalinen tarkastus osoitti erinomaista MS /MS spektrin laatu (kuviot S1 ja S2) . Yksittäiset iTRAQ arvot proteiini kvantifiointiin ovat taulukossa S2a; luettelon kaikista tunnistettu peptidien kanssa Proteinpilot luottamustasolla ≥95% on saatavana taulukossa S3. Taulukossa S4 luetellaan toistojen näytteen analyysissä proteiineja taulukossa 2 kvantitoitiin. Koska EMCA ja normaali proliferatiivisia kudokset saatiin eri henkilöitä ja olivat siksi ole samoja (ts analyysit eivät jäljittelee), tyypillinen käsite keskihajonta kvantitatiivinen analyysi voi olla harhaanjohtava mittana analyysilaatua. Meillä on siis päättänyt ilmaista jakaumia yhdistetyn analyyttisen ja yksilöllisiä eroja seuraavalla tavalla: meidän analyysit, 28% yksittäisten iTRAQ arvojen poiketa ± 10% niiden avulla, 54% ± 20%, ja 88% ± 50% (katso taulukko S2b lisätietoja). Nämä jakaumat ovat tueksi meidän hypoteesia, että 50% muutos iTRAQ suhteissa on osoitus differentiaalikaavojen. Olemme todellakin tunnistettu ryhmä 16 ylimääräisiä proteiineja, jotka vain jäi cutoff meidän kriteerit ero ilmaisun ja joka voi vielä luokitella ottamalla huomioon lisänäytteitä (taulukko 3).

arviointi diagnostiset mahdollisuudet ilmentyvät eri proteiinien EMCA

Muut tiedot liittyvät diagnostiikkaan potentiaaleja arvioitiin myös. Näitä ovat positiiviset ennustearvojen (PPV) ja alueet käyrän alla (AUC) saatavana vastaanottimen käyttöominaisuudet (ROC) analyysi. Arvot yksittäisille biomarkkereiden ehdokkaita on lueteltu taulukossa 2.

tarkastaminen ero proteiinien ekspressiota EMCA kudoksissa

yli-ilmentyminen valitun biomarkkerin ehdokkaille: katepsiini B, calumenin, S100A6, laktaattidehydrogenaasi (LDHA), ja HNRNPA1 in EMCA kudoksissa varmistettiin Western blot -analyysit alaryhmässä on sama kudosnäytteiden käytetään iTRAQ LC-MS /MS: llä. Kuvio 3 esittää vertailun neljä EMCA kudosten (T), jossa on neljä normaalia endometria (N) viiden biomarkkereiden ehdokkaiden β-aktiini toimii latauskontrollina. Lisäksi immunohistokemiallinen analyysit riippumaton sarja kudosnäytteistä (n = 5 kussakin) paljasti voimakkaan soluliman ja /tai ydin- immunovärjäyksen S100A6 proteiinin tuumorisolujen endomet- EMCA kudosleikkeiden (tyypilliset tulokset on esitetty kuviossa 4), kun taas mitään merkittävää immunovärjäyksen havaittiin epiteelisoluissa normaalin proliferatiivisen endometria.

Yhtä suuret määrät proteiineja (50 ug /kaista) erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) -polyacrylamide geeli ja sitten elektro-siirrettiin polyvinylideenifluoridia difluoridi (PVDF) membraanille. Blokkauksen jälkeen blotteja inkuboitiin kunkin hiiren monoklonaalisen vasta-aineen kanssa sopivia laimennoksia 4 ° C: ssa O /N. Membraaneja inkuboitiin 2 h huoneenlämmössä sekundaarisen vasta-aineen. Proteiinivyöhykkeet havainnut parannettu kemiluminesenssin menetelmällä (GE Health Care) Kodak Hyperfilm. Western blot-analyysi osoitti yli ilmentymistä (i) S100A6, (ii) calumenin, (iii) katepsiini B: n, (iv) laktaattidehydrogenaasia A (LDHA), ja (v) heterogeenistä proteiinia A1 (HNRNPA1) endometriumin syövän kudoksissa (T1, T2, T3 ja T4), verrattuna normaaleihin kohdun limakalvon (N1, N2, N3 ja N4). β-aktiini toimi latauskontrollina esittää yhtä suuri kuin proteiinin määrä kussakin vyöhykkeessä.

immunohistokemiallinen analyysi S100A6 proteiinia suoritettiin riippumaton parafinoidut kudosleikkeiden kohdun limakalvon syövän ja normaalin kohdun limakalvon (n = 5 kutakin), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Paneeli esittää (a) ei immunovärjäyksen S100A6 proteiinin normaali endometrium; (B) kohdun limakalvon syövän osoittaa sytoplasmista ekspressiota S100A6 proteiinia; ja (c) negatiivinen kontrolli näkyvissä mitään ilmentymistä S100A6 proteiinin.

Network Analysis

Suoritimme Ingenuity Pathway Analysis (IPA) tuottaa verkkoihin osoittaa suoraa ja epäsuoraa asetukset /vuorovaikutuksen proteiineja tunnistettu tässä tutkimuksessa. Nämä verkot osoittavat osallistuvat keskeisten toimijoiden kuten TNF-alfa, NFKB, c-myc, Her2 /Neu, β-kateniinin, ja Erk1 /2-proteiineja, jotka säätelevät tulehdusta, ja selviytyminen ja kasvainsolujen lisääntymistä (kuvio 5). Useimmat molekyylikohteista tunnistettu tässä tutkimuksessa säätelevät c-myc, Her2 /neu, ja TNF α, mikä viittaa siihen, väliintuloa näiden reittien avulla voi olla mahdollista, että kehityksen molekulaarisen kohdennettujen hoitojen kohdun limakalvon syöpä.

Mahdollinen uusi molekyylikohteista tunnistettu tässä tutkimuksessa tehtiin polku analyysien avulla Ingenuity Pathways Analysis (IPA) ohjelmisto, versio 7.5. Kuviossa on esitetty suora (lihavoidut viivat) ja epäsuora (pisteviivat) asetukset (→) /vuorovaikutukset (-) joukossa biomarkkereita tunnistettu tässä tutkimuksessa ja muissa merkittävästi liittyneet proteiinit. Nämä verkot paljastavat osallistuminen keskeisten proteiinien kuten TNFa, NFKB, c-myc, Her2 /Neu, β-kateniinin, Jnk ja Erk1 /2, jotka säätelevät tulehdusta, selviytymistä ja proliferaatiota.

Keskustelu

on ollut hyvin viime aikoina kiinnostus potentiaalisten syövän merkkiaineita diagnosointiin ja ennusteen kautta ero proteomiikka-analyysi. Eri asioita, karikot, ja onnistumisia Näiden proteomiikkaa-pohjainen biomarkkereiden tutkimuksissa on keskusteltu ja tarkistetaan [14] – [17]. Tutkimuksemme perusteella on yksilöity 40 proteiinien osoittaa merkittävää ero ilmentyminen EMCA verrattuna normaaliin proliferatiivinen kudoksiin. Nämä proteiinit sisältävät metaboliaentsyymeistä [pyruvaattikinaasia M2 (PKM2) ja laktaattidehydrogenaasin A (LDHA)]; kalsiumia sitovia proteiineja (S100A6, calcyphosine ja calumenin); ja proteiinit, jotka osallistuvat säännellä tulehdus, leviämisen ja invaasion [anneksiini A1 (ANXA1), interleukiini tehostajana sitova tekijä 3 (ILF3), alfa-1-antitrypsiini (AAT), makrofagin rajaaminen proteiini (CAPG) ja katepsiini B]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet vaikutuksen estrogeenireseptorin (ER) ja p53 ilmentymistä näiden proteiinien, mikä takaa varmistettava näiden havaintojen EMCA kudoksissa suuremmassa mittakaavassa. Niistä proteiinit tunnistettu tässä tutkimuksessa olemme aiemmin raportoitu muuttuneen ilmentymisen AAT, CAPG, pyruvaattikinaasin M1 /​​M2, ja creatinase kinaasi B. Kaksi näistä proteiineista (pyruvaattikinaasia M2 ja creatinase kinaasi B) on sisällytetty tähän vastiketta, kuten manuaalista tutkimuksen tiedot osoittivat, että vaikka ilmaisu suhde muuttuu näiden kahden proteiinien oli hieman alle 50% (pyruvaattikinaasin M1 /​​M2, 1,43, ja creatinase kinaasi B, 0,69), he täyttävät muut kaksi kriteeriä (katso Materiaalit ja menetelmät). Lisäksi riippumattoman tutkimuksen avulla immunohistokemia kudoksen mikrosirulla (n = 148 potilasta), jota ryhmämme osoitti merkittävää potentiaalia AAT ja PKM2 diagnostisina biomarkkereita EMCA [18] – [20]. On huomattava, että lisääntynyt määrä tuumori-PKM2 on myös raportoitu, että kasvainsolujen ja EDTA plasmassa potilailla, joilla on syöpiä, munuaisten, keuhkojen, rintojen, kohdunkaulan ja ruoansulatuskanavassa, sekä ulostenäytteissä potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen syöpä ja mahasyöpä [21]. Näin PKM2 voi toimia yleisenä indikaattorina maligniteetin, sen sijaan, että spesifinen EMCA. Tämä yhdistys tuumorigeneesiin yleensä on ehkä valossa ymmärrettävää PKM2 tehtävänä [21]. Kytkin M2 isomuodon pyruvaattikinaasin kasvainsoluissa on tarpeen indusoida Warburg vaikutus. Lisääntynyt ilmentyminen PKM2 edistää aineenvaihdunnan ympäristössä, jota voidaan käyttää solujen lisääntymisen hypoksisissa olosuhteissa ja edistää kasvainsolujen kasvua [22], [23]. Näin ollen, PKM2 toimii aineenvaihdunnan anturi, joka mahdollistaa tuumorisolun mukauttaa aineenvaihduntaa vaihtelut ravinteita. Mielenkiintoista on, LDHA osoitti myös yli-ilmentymisen EMCA kudoksissa tässä tutkimuksessa, ja PKM2 tiedetään edullisesti sukkulat pyruvaatin laktaattidehydrogenaasin [24]. Tyrosiinifosforylaatio laktaattidehydrogenaasin helpottaa proteiinin sitoutumista PKM2 ja kanavoi tuote pyruvaattikinaasin ja laktaatti [25]. Tämä auttaa synnyttämään nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD

+) tarvitaan yllä korkeita glykolyyttisissä flux kasvainsoluissa. Tämä metabolinen muuntaminen tekee Glykolyysivaiheen omavarainen, kunhan kohonnut glukoosin ottoon on toteutettavissa. Korkea glykolyyttisissä nopeus tarjoaa synteettisen välituotteita nopeasti lisääntyviä tuumorisoluihin, tarvitaan jäljitellä solubiomassan ja genomin kummassakin solunjakautumisen [24], [26].

Toinen tärkeä ryhmä proteiineja havaittiin vapautettiin EMCA kudoksissa sisältää neljä kalsiumia sitovia proteiineja: S100A6, calcyphosine (CAPS), calumenin (CALU), ja anneksiini A1 (taulukko 2). S100A6 on pääasiassa sytoplasminen proteiini, mutta kun läsnä on Ca

2+, se voi liittää solukalvon kanssa ja ydin- kuori. Meidän immunohistokemiallinen analyysi osoitti soluliman ja /tai tumavärjäystä of S100A6, pääasiassa tuumorisolujen endomet- EMCA. Tämä tukee edelleen läsnäolo S100A6 proteiinin sytoplasmassa ja ytimet keuhkojen, ihon, ja haiman adenokarsinooma soluihin [27] – [29]. S100A6 on tärkeä rooli solun tukirangan uudelleenjärjestelyn, invaasio, selviytymistä ja proliferaatiota säätelemällä tehtäviä useita molekyyli- tavoitteita, mukaan lukien p53, β-kateniinin, annexins, tropomyosin, calponin, calcyclin sitova proteiini /Siah-1-vuorovaikutuksessa proteiinin (CacyBP /SIP ), ja Hsp90 /Hsp70-järjestäminen proteiini (Hop) [30] – [33]. Yliekspressio S100A6 on yhteydessä huonoon ennusteeseen keuhko-, maha- ja haimasyövän [27], [31], [33]. Neljästä Ca

2+ säätelyproteiineihin havaittu ilmentyä erilailla Tässä tutkimuksessa vain calcyphosine on aiemmin raportoitu liittyvän huonoon ennusteeseen EMCA potilailla [34]. Anneksiini A1 (ANXA1), havaittiin yliekspressoituvan EMCA kudoksissa tässä tutkimuksessa, on endogeeninen anti-inflammatorinen proteiini. Annexins ovat perheen Ca

2 + /lipidiä sitovia proteiineja, jotka liittyvät erilaisten solun toimintojen, kuten kalvo aggregaatiota, tulehdus, fagosytoosin, proliferaatiota ja apoptoosia [35]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että kalsium-fosfatidyyli ja syklisen AMP kaskadeja voi olla tärkeä rooli sääntelyn solujen toiminta, lisääntymistä ja erilaistumista endometriumin syövän syntymistä.

On huomattava, tutkimuksemme osoittaa myös tärkeä rooli tulehdus sääntely- ja RNA sitovat proteiinit korkealaatuista EMCA. Säätelyä edellä mainitun anneksiini A1 yhdessä downregulation apolipoproteiinien, fibronogeenit ja haptoglobiini ehdottaa tukahduttaminen tulehduksellinen prosessi ympäröiviin kudoksiin kasvaimen. Interleukiini tehostajana sitova tekijä 3 (ILF3 tai NF90) ja heterogeeninen ribonukleoproteiini A1 (hnRNP A1) ovat RNA-sitovia proteiineja, jotka säätelevät useiden proteiinien ekspressio mukana eloonjäämistä ja kasvainsolujen proliferaation [36] – [38]. Muun muassa, yliekspressio serpin H1, F-aktiini rajaaminen proteiinialayksikkö beta (CAPZB), makrofagin rajaaminen proteiini (CAPG), villiini 2 (EZR), ja katepsiini B (CTSB) tiedetään edistää solujen liikkuvuuteen ja invaasio kasvainkudoksissa [ ,,,0],39] – [42]. Niistä mahdollisia molekyylimarkkereiden joka voisi tukea diagnoosi tai prognoosi on EMCA, jotkut kuten PKM2, LDHA ja katepsiini B on jo tutkittu niiden terapeuttista potentiaalia muissa syövissä. Esto PKM2 ja LDHA, käyttämällä lyhyitä häiritsevä RNA (siRNA) tai estäjiä, oli vähentynyt soluproliferaatiota induktion takia oksidatiivisen stressin seurauksena apoptoosin [43] – [47]. Lisäksi siRNA-välitteinen downregulation PKM2 herkistynyt keuhkosyövän soluja sisplatiinin ja doksorubisiini. Mahdollisuuksia näiden proteiinien palvelemaan kohteina uusia molekyyli, tavoitteita hoitojen vuoksi on määritettävä yhteydessä kohdun limakalvon syövän samoin.

Tässä tutkimuksessa, pora-alas lähestymistapa paransi numero proteiinien tunnistettu, vaikka ydinjoukko peptidien todettiin kaikissa ajojen kaikista näytteistä. Näissä tapauksissa toistuvien havaitsemisen johtuvat muutoksia retentioaika, huippu pyrstön, useita maksuja, ja muutokset (esim de-amidointi ja metioniinin hapetus). Analysoinnin jälkeen ensimmäisen iTRAQ asetettu, paransimme tarkkuus fraktion injektio ja laajentanut poissulkuikkunat sekä aikaa ja

m /z

, mistä ± 5 ± 7 min, ja 100 MDA 120 ppm vastaavasti lieventää joitakin näistä haasteista. Päätimme se ei sulje pois ioneja erojen perusteella korvauksetta tai muuttamista, sillä tämä olisi lisännyt poissulkemisluettelon pidemmälle käytännön kokoa, ja lisäksi päättelimme, että jotkut irtisanominen erojen perusteella korvauksetta tai muutos voi auttaa lisäämään luottamusta tunnistamista. Siten iteratiivinen analyysien käytimme iski tasapaino syvällistä analyysia ja tractability. Tämä tunnistaminen useiden eri peptidien merkitsi, että tunnistettujen proteiinien luultavasti kasvoi hitaammin kuin olisi ollut mahdollista, jos olisimme toteuttaneet syrjäytymisen eri varaustiloissa ja muutoksia. Mielenkiintoista, kokonaismäärä proteiinien tunnistettu tässä tutkimuksessa olivat verrattavissa tunnistettu edellisessä tutkimuksessa (1529 vs. 1388 proteiineja, vastaavasti), vaikka täällä töissä vain puolet määrästä lähtöaineen (100 vs. 200 ng /näyte aiemmin julkaistuun ) [18].

Yhteenvetona analyysimme paljastaa selvästi merkitystä lähennys proteomic lähestymistapa yhdistettynä iTRAQ tunnistamaan biomarkkerina ehdokkaiden kohdun limakalvon syöpään. Tämä tutkimus onnistuneesti paljastaa uusia ilmentyvät eri proteiineja, jotka voisivat toimia molekyylikohteista diagnosoinnissa ja /tai prognoosi endomet- EMCA kudoksiin. Jotkut näistä proteiineista näytteille potentiaalit kuin molekyyli tavoitteita terapeuttisten.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kohdun limakalvon kudokset haettiin in-house, oma tutkimus kohdun-kudoksen pankki kuten aiemmin on kuvattu [18]. Kokoelma ja käyttää näitä materiaaleja hyväksynyt Research Ethics hallitusten York University, Mount Sinai Hospital, University Health Network, ja North York General Hospital. Näytteet olivat peräisin potilaista, joille tehdään hysterectomies tai muita kliinisiä menettelyjä, joihin kuuluu koepaloja. Kaikki nämä näytteet saatiin kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen kaikki osallistujat mukana tässä tutkimuksessa.

Näytteet ja reagenssit

Ellei toisin mainita, kaikki reagenssit olivat saatavissa Sigma-Aldrich (St-Louis, MO ). Tässä tutkimuksessa, endomet- karsinooma tapauksissa (tyyppi I EMCA, n = 10) ja normaalin lisääntymiskyvyn kohdun limakalvon (n = 10), valittiin. Viisi tyypin I EMCA kudosnäytteet biopsioista joka oli tutkittu edellisessä tutkimuksessa. Sillä proteomiikka-analyysi, kudosnäytteet saatiin peilin-face jäljellä olevan lohkon käytetään histopatologista arviointia patologi. Kudosnäytteet pestiin kolme kertaa ~ 1 ml: ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), jossa on proteaasi-inhibiittorien seos (1 mM 4- (2-aminoetyyli) bentseenisulfonyyli fluoridi, 10 uM leupeptiiniä, 1 ug /ml aprotiniinia, ja 1 uM pepstatiini), kuten aiemmin on kuvattu [18]. Pesty näyte homogenisoitiin 0,5 ml: lla PBS: ää, jossa proteaasi-inhibiittoreita käyttäen kädessä pidettävää homogenisaattoria, flash-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti [18]. Haun jälkeen varastoinnin -80 ° C: ssa, näytteet sulatettiin, kirkastettiin sentrifugoimalla ja proteiinikonsentraatio määritettiin käyttämällä Bradford-määritystä (Bio-Rad, CA). Kaikkien iTRAQ sarjaa, vertailunäytteeseen, joka sisältää altaan kymmenen normaalin proliferatiivinen näytettä (100 ug lysaattia kustakin kudoksesta) käytettiin. Kutakin koetta varten 100 ug proteiineja pilkottiin trypsiinillä ja yksittäin varustaa sopivan iTRAQ tag. Tehtävät on tunnisteita näytetyypeille satunnaistettiin minimoidaan mahdolliset harha merkintöjen tehokkuuden välillä yksittäisten versioiden iTRAQ tunnisteita. Yhteensä seitsemän iTRAQ sarjaa tutkittiin, kukin käsittää kolme kaikkiaan 20 yksittäistä näytettä – kymmenen EMCA ja kymmenen normaalin endometria – ja viitekorin. Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita calumenin ja HNRNPA1 oli saatavilla Abcam, katepsiini B Calbiochem, ja S100A6 Santa Cruz Biotech. Kanin polyklonaaliset laktaattidehydrogenaasi A (LDHA) saatiin myös Santa Cruz Biotech.

voimakasta kationinvaihtohartsia (SCX) Separation

Jokainen iTRAQ setti erotettiin SCX käyttämällä HP1050 HPLC väline (Agilent, Palo Alto, CA), jossa on 2,1 mm: n sisähalkaisija x 100 mm pituus yhtiö PolyLC Polysulfoethyl pylväs oli pakattu 5 um: n helmiä 300-Å huokoset (Nest Group, Southborough, MA) kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, iTRAQ joukko laimennettiin latauspuskuria (koostumukseltaan samanlainen puskuri A: 15 mM KH

2PO

4 25% asetonitriili, pH 3,0) kokonaistilavuuteen 1,8 ml, ja pH säädettiin 3,0 fosforihapolla. Liuos suodatettiin sitten 0,45 um: n ruiskun suodattimen (Millipore, Cambridge, ON, Kanada) ennen lataamista kolonniin. Erotus suoritettiin käyttämällä lineaarista binary gradientti 1 h, ja 30 min kolonnin uudelleen tasapainotuspuskurilla (taulukko 4). Kuten aiemmin on kuvattu, puskuri A oli koostumukseltaan samanlainen kuin latauspuskuri; Puskuri B oli puskuria A, joka sisälsi 350 mM kaliumkloridia; ja puskuri C oli puskuri A, joka sisältää 1 M kaliumkloridi. Fraktiot kerättiin joka 2. min käyttäen SF-2120 Super Fraction Collector (Advantec MFS, Dublin, CA) ensimmäisen odotus 2 min sijoittaa huokostilavuus. Tämä johti yhteensä 30 SCX jakeet per iTRAQ setti. Nämä jakeet kuivattiin käyttämällä speed-vac (Thermo Savant SC110 A, Holbrook, NY) ja liuotettiin uudelleen mahdollisimman pieneen tilavuuteen 5% asetonitriiliä 0,1% muurahaishappoa: tyypillisesti 8 ui kunkin fraktion nro 6-9, 12 ui for No. 10-13, 16 ui varten nro 14-16, 20 ui varten No. 17-19, 25 ui varten No. 20-21, ja 30 ui viimeiset jakeet, nro 22-30. Suuremmat volyymit myöhemmin fraktiot edellyttämä tarve kokonaan liuennut suuremman suola pelletit johtuva vastaavasti suurempi suola sisältöä. Fraktiot nro 1-5 ei analysoitu jo jakeet useimmiten sisälsi iTRAQ sivutuotteita.

Reverse-Phase (HE) LC-MS /MS

SCX jakeet No. 6-30 kutakin iTRAQ sarjan analysoitiin verkossa nano LC-MS /MS käyttäen LC Packings Ultimate väline (Amsterdam, Alankomaat) varustettu 10-ul näytettä silmukka. Autosampler käytettiin mikrolitra pick-up-tilassa. Kutakin näytettä varten 1 ui liuosta ladattiin 5 mm käänteisfaasi (RP) C18 esikolonni (LC Packings) 25 ul /min ja pestiin 4 min, ennen kuin vaihtamalla esikolonnin mukaisesti erotuskolonniin. Erotuspylväästä käytettiin oli 75 um sisähalkaisija x 150 mm: n pituus kapillaarikolonnia (Integrafrit kapillaarinen New tavoite, Woburn, MA) pakattu talon sisällä 3,5 um C18 helmiä jossa 100 Å huokosiin Kromasil (Akzo Nobel /EKA Chemicals inc, NY). Käytetty virtausnopeus erottamiseen RP pylväs oli 200 nl /min. Liuotin A oli 5% asetonitriili 0,1% muurahaishappoa; Liuotin B oli 95% asetonitriiliä 0,1% muurahaishappoa. Liuotin kaltevuus on esitetään taulukossa 5. Uusi pylväs käytettiin kunkin iTRAQ asetettu.

Online MS /MS suoritettiin sijoitukset QSTAR Pulsar hybridi kvadrupoli /aika-of-lennon (QqTOF) tandem massaspektrometriin (Applied Biosystems /MDS SCIEX, Foster City, CA) tieto- riippuva keräysmoodin kanssa scan syklit perustettu suorittamaan 1-s MS scan seurasi viisi MS /MS skannaa viisi eniten runsas piikit 2 s kukin ja dynaaminen jäädyttämisen jälkeen 30 s. Suorituskyky LC-MS /MS-järjestelmä arvioitiin vähintään kerran kolmen päivän välein avulla standardin 80 fmol naudan seerumialbumiinia tryptisiin sulatella.