Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

väheneminen lisääntymään tekijät usein aiheuttaa solukuoleman syöpäsoluja. Ehtyminen Cdc7, kinaasi olennainen aloittamaan DNA-replikaation, indusoi syöpäsolun kuoleman riippumatta sen p53 asema, mutta tarkka polkuja solukuoleman induktio ei ole selvitetty.

Menetelmät /Principal Havainnot

Olemme käyttäneet viime aikoina kehitetty solukierron indikaattori, Fucci, tarkasti luonnehtia solukuoleman aiheuttama Cdc7 ehtyminen. Olemme myös syntyy ja hyödynnetään kaltaiset loisteputki solusyklin indikaattoreiden fuusiota muiden solujen lukiertosäätelijöistä analysoida liikennemuotojen solukuoleman elävissä soluissa sekä p53-positiivisia ja -negatiivisilla taustoja. Osoitamme, että erillisiä solusyklin vasteita indusoituu p53-positiivisten ja -negatiivisilla solujen Cdc7 ehtyminen. p53-negatiiviset solut pääasiallisesti pidättämään ajallisesti G2-vaiheessa, varaamiseen CyclinB1 ja muut mitoottisiin sääntelyviranomaisten. Pitkäaikainen pidätys G2-vaiheessa ja äkilliset tuloa poikkeavaan M-vaiheen läsnäollessa kertynyt CyclinB1 seuraa solukuolema klo postmitoottisia tilassa. Kumoaminen sytoplasmisen CyclinB1 kertymisen osittain vähentää solukuolemaa. ATR-MK2 koulutusjakson vastaa varastoimalla CyclinB1 kanssa 14-3-3σ proteiinia. Sen sijaan, p53-positiiviset syöpäsolut eivät kerry CyclinB1, mutta näyttävät kuolemaan enimmäkseen tuloa poikkeavaan S-vaiheen jälkeen Cdc7 ehtyminen. Yhdistelmä Cdc7 esto tunnettujen syöpälääkkeiden merkittävästi stimuloi solukuolemaa vaikutuksia syöpäsolujen genotyypin riippuvaisella tavalla, jolloin saadaan strateginen perusta tuleville yhdistelmähoitoja.

Johtopäätökset

tulokset osoittavat, että käyttö Fucci, ja vastaavat fluoresoivat solusyklin indikaattoreita, tarjoaa kätevän määritysjärjestelmä, jolla voidaan tunnistaa solusyklin liittyvät tapahtumat syöpäsolun kuoleman. Ne osoittavat myös genotyyppispesifinen solukuolemaa tilat aiheuttama puutteellinen aloittamista DNA-replikaation syöpäsoluissa ja sen mahdollisia hyödyntämistä varten kehittää tehokkaita syövän hoitomuotoja.

Citation: Ito S, Ishii A, Kakusho N, Taniyama C, Yamazaki S, Fukatsu R, et ai. (2012) Mechanism of Cancer Cell Death syntyvät sen seurauksena olennaisen replikointi Regulator. PLoS ONE 7 (5): e36372. doi: 10,1371 /journal.pone.0036372

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 tammikuu 2012; Hyväksytty: 30 maaliskuu 2012; Julkaistu: 4. toukokuuta 2012

Copyright: © 2012 Ito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grants-in-tuki Basic Scientific Research (A) ja Grant-in-tuki tieteellisen tutkimuksen Painopisteala ”kromosomi Cycle” alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology of Japan (HM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cdc7 on säilynyt seriini-treoniinikinaasi joka on keskeisessä asemassa vuonna ampumisen lisääntymään alkuperä [1] – [3]. Keskeinen substraatti on MCM, komponentti prereplicative kompleksin (pre-RC), ja fosforylaation MCM2, 4 ja 6 alayksiköt MCM kompleksin Cdc7 laukaisee yhdistys Cdc45 valmiiksi RC, ratkaiseva askel sukupolven aktiivinen replikaatiohaarukan [4] – [6]. Cdc7 muodostaa kompleksin Dbf4, aktivointi alayksikkö, tuottaa aktiivista kinaasikompleksi [2]. Ihmisillä kaksi aktivointia alayksiköstä, ASK ja Drf1 /ASKL1, tiedetään olevan [2], [7] – [9].

Knockout of Cdc7 hiirillä aiheuttaa alkion varhaisvaiheen kuolleisuutta. Inaktivointi Cdc7 geenien hiiren ES-solujen on myös tappava [10]; solut lakkaavat DNA-synteesin, kerääntyä DNA vahinkoja, ja lopulta tehdään solukuoleman p53-riippuvainen tavalla. Knockdown kokeissa nisäkässoluissa osoittavat, että ASK on olennaista, kun Drf1 /ASKL1 voi olla tarpeeton elinkelpoisuuden [9], [11]. Itse asiassa, inaktivointi ASK geenien hiiren ES-soluissa johtaa myös kuolleisuutta [12]. Nämä tulokset osoittavat, että Cdc7-ASK on välttämätöntä leviämisen nisäkässoluissa. Toisaalta, Drf1 /ASKL1 voi olla hallitseva rooli aktivaattorina Cdc7 varhaista kehitystä sammakkoeläinten [13], [14]. Ortologi Drf1 /ASKL1 ei havaittu hiirillä.

solutasolla, knockdovvn Cdc7 osoitettiin aiheuttavan solukuolemaa syöpäsoluissa, mutta ei normaaleissa soluissa, joissa p53-riippuvaisen reittien pidätys solusyklin oletettavasti G1 vaiheessa [15], [16]. On myös raportoitu, että Cdc7 pudotus indusoi p38-riippuvaista solukuolemaa HeLa-soluissa [17]. Kuitenkin, Cdc7 ehtyminen aiheuttaa solukuoleman myös p53-positiivisten solujen, viittaa siihen, että p53 voi yksin ei estä indusoimaa solukuolemaa Cdc7 ehtyminen syöpäsoluja. Tällä hetkellä hienomekanismin p53-riippumattoman solukuoleman Cdc7-köyhdytettyä syöpäsolut eivät ole tiedossa. Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet vaikutuksia Cdc7 ehtymisen syöpäsoluissa käyttäen äskettäin kehitetty solusyklin indikaattori Fucci [18] sekä vastaavia fluoresoivia solukierron indikaattoreita. Tuloksemme viittaavat differentiaaligeometriaan vaikutuksia p53 tila solukuoleman Cdc7-köyhdytettyä syöpäsoluja.

Tulokset

ehtyminen Cdc7 kinaasin ihmisen syöpäsoluja aiheuttaa solukuoleman

ehtyminen Cdc7 HeLa, U2OS tai muut syöpäsolut siRNA johti DNA-synteesin estoa, kertyminen kromosomi vahingoista [edustaa γ-H2AX pesäkkeet) ja lopulta tappio elinkelpoisuuden elinkelpoisuus [15], [19], [20] . Solukuolemaa aiheutettiin sekä p53-positiivisia tai p53-negatiivinen syöpäsolujen, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [15], [19]. FACS-analyysit DNA sisällön osoitti, että Cdc7 ehtyminen johtaa aluksi väheni G1 väestö, jota seurasi lisäys Saharan G1 väestö, ohjeellinen solukuoleman (Fig. S1A ja Fig. S2B).

Tutkiakseen tila indusoimaa solukuolemaa Cdc7 ehtyminen, käytimme HeLa-soluja, jotka ilmentävät solusyklin ilmaisin, Fucci (Fluorescent ubikitiini-pohjainen solusyklin indikaattori; [18]), joka mahdollistaa visualisoinnin solusyklin tilan (punainen G1 ja vihreä S /G2 /M). HeLa-Fucci transfektoitiin Cdc7 siRNA ja solut seurattiin määrittämiseksi solusyklin vaihe, jossa ne tehdään solukuolemaa. Solukuolema tapahtuu sekä postmitoottisia G1 ja aikana S /G2 /M-vaiheen HeLa-Fucci (Fig. 1A ja C, elokuvia S1 ja S2). Olemme myös syntyy U2OS-Fucci ja tutki solukuoleman tilassa U2OS jälkeen Cdc7 ehtyminen. Vuonna U2OS, yli 70% soluista kuoli S /G2 /M-vaiheen (vihreä, Fig. 1B ja C). Sen sijaan, Cdc7 ehtyminen ei aiheuttanut solukuoleman NHDF (normaali ihmisen ihon fibroblasti) solut ja johti pääasiassa G1 pidätys kuten aiemmin on kuvattu (Fig. S1 ja tietoja ei ole esitetty, [15]).

(A ja B) HeLa (A) tai U2OS (B) soluja, jotka ilmentävät Fucci käsiteltiin kontrolli tai Cdc7-D siRNA, ja Viivästys kuva tallennettiin Olympus LCV100 (elokuvia S1 ja S2). Kuvat otettu Viivästys data aikoina osoitettu esittelyyn. Ylimmäinen paneelit (ohjaus siRNA) osoittaa solujen käynnissä normaali solunjakautumisen. Numerot kussakin paneelissa näyttää aika (h) jälkeen siRNA transfektion. Alempi kaksi paneelia (a ja b) esittävät Cdc7 siRNA käsiteltyihin soluihin. Jotkut solut kuolivat punaisena (G1 vaiheessa a), ja muut solut kuolivat vihreä (S /G2 /M vaiheessa b). Pituudet solukierron vaiheet on esitetty paneelien (G1, nuolet katkoviivoin; S /G2 /M, nuolella kiinteät viivat). Bar, 20 um. (C) Kuolleet solut in Cdc7 siRNA saaneilla HeLa-Fucci (vasen, 324-solut) tai U2OS-Fucci (oikealla, 180 solua) laskettiin pois Viivästys tietojen määrittämiseksi jakeet kuolleiden solujen punaisella ja vihreällä. Solukuolema tapahtuu sekä G1 ja S /G2 /M vaiheita Cdc7 siRNA käsitelty syöpäsoluja. (D, E ja F) HeLa-solut transfektoitiin ohjaus- tai Cdc7-D siRNA ja kerättiin 48 tuntia (D) tai aikoina esitetty (E ja F). Koko solu-uutteita (D) tai CSK-liukoinen uutteet (E) analysoitiin western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita, on ilmoitettu. (F) Cdc2-CyclinB1 kinaasin aktiivisuus mitattiin käyttäen CSK-liukoinen uutteet. Immunosaostumat (IP), joita käytetään määrityksissä ja panos uutteet analysoitiin western-blottauksella. Laajuus Cdc7 ehtyminen oli samanlainen HeLa- ja U2OS. Cdc7 ollut havaittavissa Länsi jälkeen siRNA kohtelu sekä soluissa. (G) HeLa-soluja käsiteltiin ohjaus- tai Cdc7-D-siRNA on ilmoitettu ajat, kerättiin talteen, pestiin PBS: llä, turvonnut 75 mM KCl: a 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja kiinteä jääetikalla /metanolia (01:03) liuos kolme kertaa. Kiinteä kromosomeja pudotettiin objektilasille, ilmakuivataan ja värjättiin 5% Giemsa’n liuosta 1/15 M PBS. Levitä kromosomeja havaittiin alle All-in-One mikroskopia (Keyence). Mitoosi solut poikkeavasti kondensoidaan kromosomeja laskettiin ja fraktiot esitetään. Sisäkkeet osoittavat edustavat kuvat poikkeavasti kondensoitu kromosomien havaittu Cdc7 siRNA käsitelty HeLasoluista (vasemmalla) ja oikein kondensoidaan kromosomien havaittu säätökenno (oikealla). Bar, 50 pm. (H) HeLa-soluja käsiteltiin ohjaus- tai Cdc7-D siRNA 48 tunnin ajan, pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen värjättiin Hoechst 33342. Soluja tutkittiin konfokaalimikroskoopilla LSM510 (1427-soluissa [Cdc7] ja 1023 solua [ohjaus]), ja solut M vaiheessa vaiheissa pisteytettiin. Jakeet solujen kussakin mitoosi vaiheessa esitetään. (I) Levitä ja kiinteän kromosomeja valmistettiin U2OS kuten edellä on kuvattu havainnoitiin FSX100 Olympus mikroskoopilla. Mitään merkittävää eroa ei havaittu mitoosi soluissa jälkeen Cdc7 ehtyminen. Kuitenkin apoptoottisten lukumäärissä kasvoi Cdc7-köyhdytettyä U2OS soluja. Bar, 32 um. C, G ja H, ”n” edustaa numerot riippumattomien kokeiden.

Sytoplasmiset kertymistä CyclinB1 proteiinin Cdc7-köyhdytettyä HeLa-soluissa

FACS Cdc7- köyhdytettyä HeLa-solut eivät osoittaneet kertymistä G2 /M väestöstä (Fig. S1A ja Fig. S2B). Kuitenkin Länsi analysoidaan erilaisten proteiinien jälkeen Cdc7 ehtymisen HeLa-soluissa osoitti että tasot CyclinB1, AuroraA ja PLK1 proteiinien lisääntynyt (kuvio. 1D, E ja F). Tasot Molempien Cdc25C, Cdc25CS216 (Fig. 1 E) ja tyrosiinin 15 fosforylaatiota Cdc2 myös noussut (Kuva. 1 F), mikä viittaa siihen, että G2 /M tarkastuspiste voidaan indusoida Cdc7-köyhdytettyä HeLa-soluissa. Vaikka taso CyclinB1 proteiinin lisääntynyt, CyclinB1 riippuvainen Cdc2-kinaasin aktiivisuus oli lähes sama kuin kontrolliryhmän (Fig. 1 F). Tämä saattaa johtua siitä, että yhdessä 14-3-3 proteiineja, jotka saattavat estää kinaasiaktiivisuutta (katso jäljempänä), sekä tarkistuspisteen aiheuttama estävä tyrosiinin 15 fosforylaatiota. Toisaalta, p53-positiivisia U2OS, ehtyminen Cdc7 ei aiheuttanut CyclinB1 kertymistä, ja ei vaikuttanut CyclinB1 riippuvainen Cdc2 kinaasiaktiivisuutta tai tyrosiinin 15 fosforylaation Cdc2 (Fig. 1 F).

värjäys ja havainnointi M vaiheen kromosomien osoitti kasvua poikkeuksellisesti kondensoitu kromosomien Cdc7 siRNA-käsitellyt solut (Fig. 1G). Noin 50% mitoosi solujen näytteillä poikkeavasti kondensoitunut kromosomeja Cdc7-köyhdytettyä HeLa-soluissa. Myös metafaasissa on telophase solupopulaatioiden laski Cdc7 siRNA-käsiteltyjen HeLa-solut (Fig. 1 H). Nämä tulokset osoittavat, että suuri populaatio soluista pidätys tai hidastaa G2 jälkeen köyhtyminen Cdc7 kinaasin HeLa solujen poikkeavasti kondensoitu kromosomeja, ja osa soluista kuolee G2 /M vaiheessa mahdollisesti metafaasissa. Kuitenkin tarkka ajoitus solukuoleman aikana M vaihe ei ole määritetty. Vuonna U2OS ei ole merkittävää eroa M vaihe kromosomien välillä Cdc7 vaje ja ohjaus soluja. Kuitenkin numerot apoptoottisten tumien lisääntynyt jälkeen köyhtyminen Cdc7 vuonna U2OS (Fig. 1I). Näin ollen, nämä tulokset osoittavat myös, että ajoitus indusoimaa solukuolemaa Cdc7 heikkeneminen voi vaihdella HeLa ja U2OS soluja.

Sitten analysoimme sijainti solun CyclinB1 proteiinin immunovärjäyksellä. Totesimme lisääntyminen CyclinB1-positiivisten solujen Cdc7 siRNA-käsiteltyjä soluja, odotetusti kasvoi yleistä CyclinB1 proteiinin taso. Totesimme myös, että huomattava väestö Cdc7-köyhdytettyä HeLa solut sisältävät CyclinB1 proteiinia solulimassa (Fig. 2A ja B). Vahvista tämä tulos, tutkimme vaikutus Cdc7 ehtymisen käyttäen HeLa-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti mKO2 fuusioituneen CyclinB1 proteiinia. Tässä solulinjassa, punaista fluoresoivat signaalit ensiesiintyminen sytoplasmaan noin 10-14 tunnin kuluttua solujen jakautumista. Signaalit olivat havaittavissa noin 5-6 tuntia. Koska synkronointi kokeet viittaavat siihen, että G2 /M vaiheiden HeLa-soluissa kestää noin 3-5 tuntia, CyclinB1 todennäköisesti ilmaista myöhään S-vaiheen läpi metafaasissa. Nämä signaalit siirtävät tumiin ja häviävät metafaasissa (Fig. 2C, ylempi paneeli; elokuva S3), sopusoinnussa odotettu toiminta endogeenisen CyclinB1 proteiinin, kuten on esitetty aiemmin [21] – [23]. Kun soluja käsiteltiin Cdc7 siRNA, väestö solujen vahvan sytoplasmisen punainen signaalit lisääntynyt, ja nämä signaalit jäivät sytoplasmassa pidempään (Fig. 2C, alapaneeli ja elokuva S4). Tarvittava aika translokaatiota punaisen signaaleja tumiin kuluttua sen ulkonäkö sytoplasmassa oli muutama tunti valvonnassa soluissa, kun taas se kasvoi Cdc7-köyhdytettyä soluja (Fig. 2C ja D, elokuvia S3 ja S4). Tämä havaittiin myös eri Cdc7 siRNA (Fig. S2 ja tietoja ei ole esitetty). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa ajatus, että CyclinB1 kertyy sytoplasmaan HeLa-soluissa käsitelty Cdc7 siRNA. Meillä on myös luotu ilmentävien HeLa-solujen mKO2-AuroraA. Ilmentäminen ja aktiivisuuden AuroraA yksi mitoosi kinaasien, tiedetään huippu G2 /M-vaiheessa [24]. Johdonmukaisesti, The AuroraA signaalit ilmestyi G2 vaiheessa, ja katosi lopussa M vaiheen kontrollisoluissa, kun taas kesto AuroraA signaalit tuli paljon kauemmin, kun Cdc7 loppuminen (Fig. S3, elokuvia S5 ja S6). Tämä vaikutus oli jälleen havaittu muiden Cdc7 siRNA (Fig. S3C ja tietoja ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että Cdc7 ehtyminen aiheuttaa G2 solusyklin viivästyminen HeLa-soluissa samanaikaisesti lisääntynyt CyclinB1 ja AuroraA proteiinin tasot.

(A) HeLa-soluja viljeltiin kansi lasit, transfektoitu ohjaus tai Cdc7-D siRNA varten 48 tuntia, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin anti-CyclinB1 vasta-ainetta ja sen jälkeen FITC-konjugoitua anti-hiiri-IgG ja Hoechst33342. Vasen, Cdc7 siRNA; oikea, ohjaus siRNA. Green, CyclinB1; sininen, DNA. Kuvat ottanut FSX100 Olympus mikroskoopilla. Bar, 16 um. (B) Yli 3000 solut tutkittiin ja solujen ydin- CyclinB1 signaaleja pisteytettiin ja fraktiot esitetään. ”N” edustaa numerot riippumattomien kokeiden. (C) HeLa-soluja, jotka ilmentävät mKO2-CyclinB1 käsiteltiin Cdc7-D siRNA tai kontrolli-siRNA. Viivästys kuvat tallennettiin Olympus LCV100 (elokuvia S3 ja S4). Kuvat otettu Viivästys data aikoina osoitettu esittelyyn. Ylä, ohjaus siRNA; alempi, Cdc7 siRNA. Punainen signaalit osoittavat mKO2-CyclinB1. Ohjaus- siRNA-käsitellyt solut osoittavat joilla on meneillään määräajoin sytoplasminen ulkomuoto, ytimen siirto, ja hajoaminen (ylempi paneeli), kun taas Cdc7 siRNA-käsitellyt solut osoittavat jatkuvaa vahvaa cytoplamic signaaleja pitkään (alempi kuva). Numerot kussakin paneelissa näyttää aika (h) jälkeen siRNA hoidon. Bar: 20 pm. (D) Aika (h) ensimmäisen ulkonäkö sytosolin mKO2-CyclinB1 signaalin ja sen translokaation tumaan mitattiin Viivästys kuvien valvonta- tai Cdc7-D siRNA käsiteltyjen HeLa-solut. P-arvo kaksisuuntainen paritonta t-testiä laskettiin Prism-ohjelmisto.

Monet Cdc7 vaje solujen korkea soluliman CyclinB1 äkillisesti tulevat mitoosin pitkien G2 pidätyksen, ja hyvin usein tehdään ilmeinen solukuolemaa seuraavat tunnit. Tämä on samanlainen kuin mitoottisiin katastrofin raportoitu aiemmin [25], mutta solut lakkasi etenemiselle M vaihetta estämällä tumaansiirtymiseen of CyclinB1, ei siinä vaiheessa karan tarkistuspisteen, kuten on raportoitu aikaisemmin eri järjestelmässä [26]. Itse asiassa, kumoamisen karan tarkistuspiste siRNA suunnattu Mad2 ei vaikuttanut CyclinB1 säilyttämistä sytoplasmassa, joka tapahtuu vasteena Cdc7 ehtyminen HeLa-soluissa (tietoja ei esitetty).

14-3-3σ sitoo CyclinB1 vuonna solulima jälkeen Cdc7 ehtyminen

seuraava kysymys on, miten CyclinB1 kertyy sytoplasmaan. 14-3-3σ säilyy, hyvin tunnettu tekijöitä, joiden tiedetään sitoutuvan erilaisiin solu- lukiertosäätelijöistä ja säilytettävä ne sytoplasmassa tietyissä tilanteissa [25]. Jokainen seitsemästä 14-3-3 isoformit ilmennettiin, ja sen vuorovaikutus Cdc2-CyclinB1 tutkittiin. 14-3-3σ oli vahvimpia sideaineet (tuloksia ei ole esitetty). Tutkimme, onko kertynyt CyclinB1 sitoutuu 14-3-3σ in Cdc7-köyhdytettyä HeLa-soluissa ja havainneet, että CyclinB1 sidottu 14-3-3σ merkittävästi lisääntynyt Cdc7-köyhdytettyä soluja (Fig. 3A, kaista 2). Lisäksi, immunosaostus ekspressoida ohimenevästi 14-3-3σ jälkeen Cdc7 väheneminen osoitti, että CyclinB1 ja Cdc2 liittyvät 14-3-3σ (Fig. 3B). Kuitenkin emme onnistuneet havaitsemaan yhdistyksen 14-3-3σ ja Cdc25C, kuten aikaisemmin on kuvattu [25], [27]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että 14-3-3σ sitoo Cdc2-CyclinB1 monimutkainen sytoplasmassa, kun Cdc7 ehtyminen HeLa-soluissa.

(A) HeLa-soluja käsiteltiin ohjaus- tai Cdc7-D siRNA 24 tuntia. -Uutteet valmistettiin ja im- anti-CyclinB1 vasta-aineella (kaistat 1 ja 2) ja tulo uutteet (kaistat 3 ja 4, 20% uutetta käytetään immunosaostus) analysoitiin western-blottauksella. (B) HeLa-solut käsiteltiin kontrolli tai Cdc7-D siRNA, minkä jälkeen transfektion Flag-merkityn 14-3-3σ ilmentävän plasmidin. -Uutteet valmistettiin 48 tunnin kuluttua siRNA transfektion ja immunosaostumat anti-Flag-vasta-ainetta (kaistat 1 ja 2) tai normaali (kontrolli) IgG (kaistat 3 ja 4) ja tulo uutteet (kaistat 5 ja 6, 17% uutetta, jota käytetään immunosaostukseen) analysoitiin western-blottauksella. Sitominen Cdc2 /CyclinB1 kanssa 14-3-3σ kasvaa jälkeen Cdc7 siRNA hoidon, mikä viittaa siihen, että 14-3-3σ säilyttää CyclinB1 sytoplasmassa jälkeen Cdc7 ehtymisen HeLa-soluissa. (C ja D) HeLa-soluja käsiteltiin Cdc7-D siRNA, 14-3-3σ ja Cdc7-D siRNA: t, 14-3-3σ siRNA ja hallita siRNA 48 tuntia. (C) Western blot -analyysi koko solu-uutteiden. (D) DNA-sisältö solua C analysoitiin FACS: lla (10000 solua kukin) ja osa soluista kussakin solusyklin vaiheessa on esitetty. (E) ilmentävien HeLa-solujen mKO2-CyclinB1 hoidettiin Cdc7-D ja /tai 14-3-3σ siRNA kuten on osoitettu. Aika (h) ensimmäisen ulkonäkö sytosolin mKO2-CyclinB1 signaalit ja sen translokaation tumaan mitattiin käyttämällä Viivästys kuvia, joka alkoi 24 tunnin kuluttua siRNA transfektion. P-arvo kaksisuuntainen paritonta t-testiä laskettiin Prism-ohjelmisto. Co-ehtyminen 14-3-3σ vähensi yleisessä CyclinB1 proteiinin taso (C), vähentää solukuolemaa (D), ja vähensi kesto sen soluliman retention (E).

vähentäminen sytoplasmisen kerääntymisen CyclinB1 osittain vähentää solukuolemaa

Koska solut kertyvät CyclinB1 sytoplasmassa ovat alttiita solukuoleman, tutkimme jos vähentäminen sytoplasmisen CyclinB1 antagonisoi solukuoleman vaikutuksesta Cdc7 ehtyminen. Co-ehtyminen sekä Cdc7 ja 14-3-3σ HeLa-soluissa vähensi CyclinB1, AuroraA PLK1 ja Cdc25C proteiini tasoilla (Fig. 3C). Tarvittava aika ydin- translokaatio CyclinB1 lyhentää ja sub-G1 solupopulaatio vähentynyt (Fig. 3d ja E). Nämä havainnot ehdottivat, että puuttuminen 14-3-3σ helpottaa G2-M siirtyminen ja eteneminen seuraavaan solusyklin vaiheessa osittain pelastaminen soluja solukuolemaa.

ilmaisi seuraavaksi mKO2-NLS-CyclinB1, joka konstitutiivisesti paikantuu ytimien HeLa solujen myöhään S kautta metafaasissa. Näissä soluissa, aika, joka tarvitaan siirryttäessä myöhään S G2 /M lyheni verrattuna mKO2-CyclinB1 ilmentäviä soluja ja solukuolemaa osittain kierretty 48 tunnin kuluttua Cdc7 loppuminen (Fig. 4A ja B). Tämä vastaa aiemman raportin, joka ektooppinen ilmentyminen NLS-CyclinB1 HeLa-soluissa vähensi G2-viive esiintyy vastauksena röntgensäteilytysjakso [28]. Kuitenkin solut, jotka ilmentävät mKO2-NLS-CyclinB1 vielä koki apoptoosin myöhempinä ajankohtina jälkeen Cdc7 ehtyminen. Tämä voidaan odottaa, koska ilmentyminen ydin- CyclinB1 tiedetään indusoivan apoptoosia syöpäsoluissa [29]. Co-ehtyminen CyclinB1 vähentää G2-venymä ja osittain pelasti indusoimaa solukuolemaa Cdc7 ehtyminen (Fig. 4C, D). Nämä tulokset tukevat käsitystä, että sytoplasmisen kerääntymisen CyclinB1 ja sen äkillinen translokaation tumaan ainakin osittain vastuussa havaitusta solukuoleman HeLa-soluissa indusoiman Cdc7 ehtymisen ja että solukuolemaa voidaan ainakin osittain estää helpottamalla mitoosin.

(A) HeLa-soluja, jotka ilmentävät mKO2-NLS-CyclinB1 (vasen) tai mKO2-CyclinB1 (oikealla) käsiteltiin ohjaus- tai Cdc7-D siRNA ja tarkkailtiin Olympus LCV100. Kuolleet solut laskettiin aika raukeavat kuvia aikoina ilmoitettu. Solukuolemaa tukahdutettiin vuonna mKO2-NLS-CyclinB1 ilmentävien HeLa-solujen jopa 72 tuntia (jossa puolet Cdc7-köyhdytettyä HeLa-solut ovat yleensä kuolleita). mKO2-NLS-CyclinB1 plasmidi rakennettiin insertoimalla NLS-sekvenssi (PPKKKRKVEDP) SV40: n suuren T-antigeenin osaksi mKO2-CyclinB1 plasmidin välillä mKO2 ja CyclinB1. Noin 200 tai 60 soluja, jotka ilmentävät mKO2-NLS-CyclinB1 tai mKO2-CyclinB1, vastaavasti, laskettiin. ”N” edustaa numerot riippumattomien kokeiden. (B) ilmentävien HeLa-solujen mKO2-CyclinB1 (WT) tai mKO2-NLS-CyclinB1 (NLS) käsiteltiin kontrolli tai Cdc7-D siRNA ja keston CyclinB1 ilmaisun ennen niiden M faasi mitattiin Viivästys kuvia. Kun Cdc7 ehtyminen, Maanmittauslaitoksen solut eivät kerry merkityn CyclinB1 sytoplasmassa, ja jatkui solusyklin enemmän tai vähemmän normaalisti. (C) HeLa-soluja käsiteltiin ilmoitettu siRNA: t 48 tunnin ajan. DNA sisällöt analysoitiin FACS (10000 solua kullekin) ja fraktiot sub-G1 väestö laskettiin ja esitettiin. Co-ehtyminen CyclinB1 vähensi indusoimaa solukuolemaa Cdc7-D siRNA HeLa-soluissa. (D) ilmentävien HeLa-solujen mKO2-CyclinB1 (WT) käsiteltiin Cdc7-D tai Cdc7-D + CyclinB1 siRNA ja aika (h) ensimmäisen ulkonäkö sytosolin mKO2-CyclinB1 signaalin ja sen translokaation tumaan mitattiin aika raukeaa kuvaa kunkin solupopulaation. Down-regulation CyclinB1 ilmaisun lyhensi G2 pidätyksen aiheuttama Cdc7 ehtyminen. (B) ja (D), P-arvot kahden tailed paritonta t-testiä laskettiin Prism-ohjelmisto.

G2 venymä aiheuttaa ehtyminen Cdc7 p53-negatiivisissa soluissa kautta MK2 aktivointi

aiemmin raportoitu, että p38-MK2 -systeemi aktivoituu HeLa-soluissa ehtyminen Cdc7 [17]. Siksi tutkimme onko tämän reitin osallistuu sytoplasmisen kerääntymisen CyclinB1 in Cdc7-köyhdytettyä HeLa-soluissa. Ensinnäkin vahvisti, että MK2 on hyperfosforyloi- mukaan Cdc7 ehtyminen HeLa-soluissa, mutta ei U2OS tai NHDF-solut (Fig. 5A). Tämä aktivaatio MK2 in Cdc7-köyhdytettyä HeLa-soluissa voisi johtua suoran aktivoinnin MK2 by Cdc7 aiheuttama replikointi stressiä. Vaihtoehtoisesti lisäys G2 vaiheen solujen Cdc7 ehtyminen voi edistää aktivoitumista MK2, koska MK2 tiedetään olevan aktiivisempia G2 ja M vaiheissa. Co-ehtyminen Cdc7 ja MK2 vähensi sykliini B1 ja AuroraA proteiinin tasot ja Cdc25C Ser216 fosforylaation, mikä viittaa siihen, että mitoosia palautuu osittain (Fig. 5B). Se vähensi myös sitoutumista 14-3-3σ ja CyclinB1 /Cdc2 (Fig. 5C). Kuitenkin, co-ehtyminen Cdc7 ja MK2 ei estä HeLa solukuolemaa, oletettavasti koska MK2 ehtyminen yksinään indusoi merkittävän solukuoleman (tietoja ei esitetty).

(A) HeLa (kaistat 1, 2, 7 ja 8 ), U2OS (kaistat 3 ja 4) ja NHDF (kaistat 5 ja 6), soluja käsiteltiin valvontaa tai Cdc7 siRNA ja koko solu-uutteet ajetaan phosgel ja analysoitiin western-blottauksella. Kaistat 7 ja 8, otteita Cdc7 siRNA-käsiteltyjen HeLa-soluja ei-käsitelty (-) tai käsiteltiin λ-fosfataasin (+). Arrowheads osoittavat fosforyloidun MK2 bändi. (B) HeLa-soluja käsiteltiin ohjaus siRNA (kaistat 1 ja 5), ​​Cdc7 siRNA (kaistat 2 ja 6), Cdc7 ja MK2 siRNA (kaistat 3 ja 7) ja MK2 siRNA (kaistat 4 ja 8), 48 tuntia, ja CSK-liukoinen (kaistat 1-4, Sup) ja -insoluble (kaistat 5-8; ppt) proteiinit analysoitiin western-blottauksella. Tubuliinia ja LaminB esitetään lastaus valvontaa. (C) glutationin Sepharose 4B kuljettaa GST-14-3-3σ proteiinia inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa CSK-liukoisen uutteet HeLa-solujen käsitelty siRNA, kuten on esitetty. Sitoutuneet proteiinit tutkittiin Western-blottauksella. ”Input” edustaa vain uutteita ilman lisättyä GST-14-3-3σ proteiinia. Cdc7 ja MK2 yhteistyössä ehtyminen vähensi sitoutumisen välillä 14-3-3σ ja Cdc2 /CyclinB1. (D) HeLa-soluja, jotka ilmentävät mKO2-CyclinB1 käsiteltiin osoitetulla siRNA: t. Aika (h) ensimmäisen ulkonäkö sytosolin mKO2-CyclinB1 signaalin ja sen translokaation tumaan mitattiin Viivästys kuvia. Co-ehtyminen MK2, p38 (ylävirtaan kinaasin MK2) tai ATR vähensi soluliman säilyttäminen CyclinB1 (G2 venyminen) havaittiin Cdc7-köyhdytettyä HeLa-soluissa. P-arvot kaksisuuntainen paritonta t-testiä laskettiin Prism-ohjelmisto. Cdc7-D siRNA käytettiin kaikissa kokeissa.

tarvittava aika tumaansiirtymiseen jälkeen yhteistyössä ehtyminen Cdc7 ja MK2 lyhennettiin lähelle valvonnan tasolle. Lisäksi G2 venymä jälkeen havaittu Cdc7 ehtyminen peruutti myös yhteistyössä ehtyminen ATR tai p38 kanssa Cdc7 (Fig. 5D). Nämä tulokset osoittavat, että tämä G2 tarkistuspisteen riippuu ATR-säännelty MK2 aktivointi.

Sytoplasmiset kerääntyminen CyclinB1 ei esiinny p53-positiivisia U2OS tai HCT116 jälkeen Cdc7 ehtyminen

Vaikka Cdc7 ehtyminen U2OS soluissa (ihmisen osteosarkooma), indusoi vahvat solukuoleman tasot mitoosi kinaasien ei kasvanut (Fig. 1). Siksi perustettu U2OS jotka ilmentävät pysyvästi mKO2-CyclinB1, ja tutkittiin, mikä vaikutus Cdc7 siRNA on CyclinB1 dynamiikkaa. Tässä solulinjassa, emme noudata mitään kertymistä CyclinB1 sytoplasmassa jälkeen Cdc7 ehtyminen. Tarvittava aika tumaansiirtymiseen in Cdc7-köyhdytettyä U2OS soluissa oli samanlainen kuin kontrolli solut (Fig. 6A). Kävi kuitenkin pitempi, kun p53 yhteistyössä köyhdytettyä (Fig. 6A). CyclinB1 proteiini taso lisääntyi hieman jälkeen yhteistyössä ehtyminen Cdc7 ja p53 U2OS (Fig. 6B). Tutkimme seuraavaksi paksusuolen syövän solulinja HCT116. P53-positiivisia HCT116 syöpäsoluja, tasot mitoosi proteiineja, kuten CyclinB1 ja PLK1 jälkeen vähentynyt Cdc7 väheneminen johtuu oletettavasti G1 pidätys (Fig. 7A). Samanaikaisesti Cdc2 /CyclinB1 alennettiin myös toiminta vuonna Cdc7-köyhdytettyä p53-positiivisten HCT116-solut (Fig. 7B). Tarvittava aika tumaansiirtymiseen in Cdc7-köyhdytettyä p53-positiivisten HCT116-soluissa oli samanlainen kuin kontrolli-soluissa (kuvio. 7C, vasen paneeli). Sen sijaan, Cdc2 /CyclinB1 aktiivisuutta p53-negatiivinen HCT116 jälkeen Cdc7 ehtyminen oli lähes sama kuin ohjaus (Fig. 7B). Lisäksi, kuten nähdään HeLa-soluissa, tarvittava aika tumaansiirtymiseen in Cdc7-köyhdytettyä p53-negatiivinen HCT116-soluissa oli pidempi kuin kontrolli (Fig. 7C, oikea paneeli). Tämä G2 pidentymisen peruutti yhteistyössä ehtyminen Cdc7 ja MK2 p53-negatiivinen HCT116-soluissa (kuvio. 7C, oikea paneeli). Nämä tulokset osoittavat, että G2-vaiheen venymän jälkeen Cdc7 ehtyminen riippuu puuttuessa p53-proteiini [15], [30] – [32].

(A) U2OS soluja, jotka ilmentävät mKO2-CycinB1 käsiteltiin siRNA: t ja aika lapse kuvat saatiin tallennettua LCV100. Aika (h) ensimmäisen ulkonäkö sytosolin mKO2-CyclinB1 signaalin ja sen translokaation tumaan mitattiin Viivästys kuvaa kunkin solupopulaation. In Cdc7 vaje U2OS, CyclinB1 ei kerry sytoplasmassa. Kuitenkin co-ehtyminen Cdc7 ja p53 aiheutti CyclinB1 kerääntymistä solulimassa pidempään. P-arvot kaksisuuntainen paritonta t-testiä laskettiin Prism-ohjelmisto. (B) Western-analyysi koko solu-uutteista U2OS soluja käsiteltiin osoitetulla siRNA: t 48 tunnin ajan. Phosgel käytettiin havaitsemiseen MK2. Muut proteiinit havaitaan 4-12% gradienttigeeliä.

(A) p53-positiivisia tai -negatiivinen HCT116-soluja käsiteltiin ohjaus- tai Cdc7-D siRNA 48 tuntia, ja kokosoluekstraktien analysoitiin western-blottauksella. (B) CSK-liukoinen uutteet valmistettiin samoissa soluissa kuin (A) ja immunosaostus suoritettiin anti-CylinB1 vasta-aine. Cdc2-CyclinB1 kinaasiaktiivisuuden mitattiin histoni H1 ollessa substraattina (ylempi paneeli), kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. Seuraavassa kaaviossa määrällisesti tason fosforylaation. Alempi paneeli, Western blotting-analyysit CyclinB1 proteiinien Immunosaostumien käytetty kinaasimäärityksiä. (C) p53-positiivisia (vasemmalla) tai -negatiivinen (oikealla) HCT116-solut ilmentävät mKO2-CyclinB1 hoidettiin ilmoitettu siRNA ja Viivästys kuvia tallennettiin. Aika (h) ensimmäisen ulkonäkö sytosolin mKO2-CyclinB1 signaalin ja sen translokaation tumaan mitattiin Viivästys kuvia. P-arvot kaksisuuntainen paritonta t-testiä laskettiin Prism-ohjelmisto.

Äskettäin raportoitiin, että FoxO3 transkriptiotekijä on mukana G1 pidätys, aiheuttamia ehtyminen Cdc7 vuonna normaaleihin soluihin [16]. FOXM1, toinen Fox perheenjäsen, tiedetään säätelevän mitoosi sääntelyviranomaisten kuten PLK, CyclinB1 ja CyclinA jälkeen DNA-vaurioita [33] – [36]. Expression of FOXM1 säätelee negatiivisesti p53 [37], [38]. HeLa, osoitamme, että mRNA tasot FOXM1 lisääntyi jälkeen Cdc7 ehtymisen (Fig. 8A), joka voi myös olla osittain vastuussa kasvua FOXM1 proteiinin tasot samoissa olosuhteissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että nämä Fox perheen transkriptio tekijät voivat olla mukana solusyklin pysähtymiseen ja induktion solukuoleman Cdc7 ehtyminen p53-negatiivisissa soluissa. Double knockdovvn Cdc7 ja FOXM1 HeLa-soluissa dramaattisesti vähentänyt CyclinB1 mRNA-tasolla verrattuna Cdc7 ehtyminen yksin. CyclinB1 proteiini taso laski myös yhteistyössä ehtyminen Cdc7 ja FOXM1, mutta ei siinä määrin, että mRNA-tasolla (Fig. 8B). FOXM1 ehtyminen, ei kuitenkaan kumota G2 pidätyksen tai vähentää solukuolemaa (kuvio. 8D, tuloksia ei ole esitetty).