Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aim

Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että useat ravinnon polyfenolit niillä voi olla chemopreventive vaikutuksen kautta epigeneettiset muutokset. Curcumin on yksi laajimmin tutkittu ruokavalion kemopreventiivisiä aineita paksusuolen syövän ehkäisyyn, mutta sen vaikutukset epigeneettiset vaihtoehtoja, erityisesti DNA: n metylaatio, jää epäselväksi. Käyttämällä systemaattista genomin lähestymistapoja, pyrimme selvittämään vaikutus kurkumiinista DNA: n metylaation muutoksiin peräsuolen syövän soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

vaikutuksen arvioimiseksi kurkumiinista DNA: n metylaatio, kolme CRC solulinjat, HCT116, HT29 ja RKO, hoidettiin curcumin. 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-CDR) ja trikostatiini Käsitelty soluja käytettiin positiivisina ja negatiivisina kontrolleina DNA metylaation muutoksiin, vastaavasti. Metylaatiostatuksen LINE-1 toista osia, DNA-promoottorin metylaation mikrosiruja ja geenien ilmentymisen taulukot arviointiin käytettiin maailmanlaajuisen metylaatio ja geenien ilmentyminen muuttuu. Validointi suoritettiin käyttäen riippumattomia mikrosiruja, kvantitatiivinen bisulfiitin pyrosekvensointi, ja qPCR.

Tulokset

Kuten odotettua, genominlaajuisten metylaatio mikrosirut esiin huomattavia DNA hypometylaatio 5-atsa-CdR käsiteltyjä soluja (keskiarvo p-arvot 0,12), mutta ei merkittäviä muutoksia keskimääräiset β-arvot havaittiin curcumin käsiteltyjä soluja. Verrattuna mock-käsiteltyjä soluja, kurkumiini aiheuttama DNA: n metylaation muutoksiin tapahtui ajan riippuvalla tavalla. Toisin kuin yleinen, ei-spesifinen globaalin hypometylaatio havaittu 5-atsa-CdR, kurkumiini hoito johti metylaatio muutokset valitaan, osittain metyloitu lokusten sijaan täysin metyloitu CpG-sivustoja. DNA: n metylaatio muutokset tukivat vastaavia muutoksia geenien ilmentyminen sekä ylä- ja alas geenien erilaisissa CRC solulinjoissa.

Johtopäätökset

Tuloksemme antaa aikaisemmin tunnistamattomia näyttöä curcumin-välitteisen DNA metylaatio muutokset mahdollisena mekanismi paksusuolensyöpä kemopreventiossa. Toisin kuin ei-spesifisten globaalin hypometylaatio aiheuttama 5-atsa-CdR, kurkumiini aiheuttama metylaatio muutoksia tapahtunut vain osajoukko osittain metyloitu geenejä, joka tarjoaa enemmän mekanistinen oivalluksia voimakas chemopreventive vaikutus tämän ruokavalion nutraceutical.

Citation: Link A, Balaguer F, Shen Y, Lozano JJ, Leung H-CE, Boland CR, et al. (2013) Curcumin moduloi DNA Metylointi sisään peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 8 (2): e57709. doi: 10,1371 /journal.pone.0057709

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 22 elokuu 2012; Hyväksytty: 25 tammikuu 2013; Julkaistu: 27 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Link et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tuettiin avustuksilla R01 CA72851 ja CA129286 National Cancer Institute, National Institutes of Health, ja varoja Baylor Research Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Ajay Goel toimii tällä hetkellä toimituskunta jäsenenä PLoS ONE, mutta tämä ei ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi johtavista kuolinsyistä maailmassa vastaten noin 10% kaikista syöpään liittyvää kuolleisuutta [1]. Noin 3-5% kaikista CRC johtuu perinyt geenivirheitä ja jopa 25%: lla potilaista voi olla jonkinasteista familiality tähän sairauteen, mutta suurin osa CRC esiintyy satunnaista tavalla ilman dokumentoidun suvussa. Lisääntyvä näyttö osoittaa, että sen lisäksi, geneettinen epävakaus fenotyypit kuten kromosomi- ja microsatellite epävakautta, epigeneettiset muutokset, jotka sisältävät DNA: n metylaatio muutoksia, histoni siihen muutoksia vuonna miRNA ilme, voi olla tärkeä rooli taudin alkamisen ja etenemisen CRC [2] – [ ,,,0],4].

toisin geenivirheitä, epigeneettiset muutokset ovat dynaamisia ja voivat vaikuttaa ikääntymiseen, ympäristöön ja elämäntapaan ja ruokavaliotekijät, joiden uskotaan olevan tärkeä rooli kehitettäessä yli kaksi kolmasosaa kaikkien ihmisen syövissä [5] – [7]. Poikkeava DNA: n metylaatio koostuu sekä polttovälin

hypermetylaation

promoottorin CpG-saarekkeiden, joka johtaa transkription hiljentämisen geenien, ja globaali

hypometylaatio

DNA, joka helpottaa kromosomi epävakautta ja aneuploidian, ja on yksi laajimmin tutkittu epigeneettiset tapahtumat syöpä [8] – [11]. Kun lisäksi otetaan huomioon, että DNA: n metylaatio muutokset ovat potentiaalisesti palautuvia, ja usein edeltävät geneettisiä tapahtumia monivaiheinen peräsuolen syövän synnyn, tarjoavat jännittävän ja lupaava mahdollisuus syövän ehkäisyyn ja hoitoon [12] – [17].

Perustuen tähän käsitteeseen , epigeneettiset hoito selvitellään parhaillaan, jonka tavoitteena on estää syöpäsolujen saamasta poikkeavien DNA metylaatio ja auttaa palauttamaan ”normaali” DNA: n metylaation ja geeniekspressiomalleja ratkaisevan syöpään liittyvien geenien. Näin ollen, nukleosidianalogeja, kuten 5-atsasytidiini ja 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-CDR) on tunnistettu voimakas DNA metyylitransferaasin (DNMT) estäjät. Niiden sisällyttäminen nukleosidianalogien suoraan DNA replikoinnin aikana sekä proteosomal hajoamista DNMT1 entsyymi, joka katalysoi

de novo

hypermetylaation muodostaa kaksi keskeistä mekanismeja, jotka ovat vastuussa niiden demetyloivan toimintaa [18] – [20]. On kasvava ymmärretty, että käänteinen poikkeava DNA metylaatiovyöhykkeiden syöpäsoluissa voi olla tehokas sen hoito ja ennaltaehkäisy [21]. Useat tällaiset nukleosidianalogeja parhaillaan tutkitaan hoitoon hematologisten maligniteettien ja ovat alkuvaiheen kliinisissä tutkimuksissa muiden kiinteiden maligniteetit; valitettavasti laaja käyttökelpoisuus näiden aineiden on haitannut myrkyllisyys ja haitallisia sivuvaikutuksia. Lisäksi tuki ei ole erityistä, joka sallii globaalin hypometylaatio jopa täysin metyloitu geenien ja johtaa kromosomi epävakaus rajoittaa näiden yhdisteiden käyttöä mahdollisina kemopreventiivisten aineina [8], [10]. Sen pyrkimys etsimään vaihtoehtoisia chemopreventive strategioita, useat fytokemikaalit ovat nousseet potentiaalisesti voimakas valintoja nojalla vähän merkittäviä toksisuusprofiilit [22]. Lisäksi tiedot viittaavat siihen, että häiriöt ruokavalion ravinteiden, kuten foolihapon ja seleeni voi vaikuttaa DNA: n metylaatio, sekä

in vitro

ja

in vivo

, seurauksena eston DNMT1 proteiinin ilmentymisen ja entsymaattisen aktiivisuus [23]. Ravinnon polyfenolit, kuten (-) – epigallokatekiini-3-gallaatti (EGCG) vihreän teen ja genisteiini soija-, on myös osoitettu estävän DNMT aktiivisuutta syöpäsolulinjoissa [24], [25]. DNMT estävä aktiivisuus liittyy demetylaation ja uudelleen useita metylaation-vaiennettu geenejä, kuten

p16, RARβ, MGMT, MLH1, BTG3

ja

GSTP1

ihmisen syöpäsoluja, mikä viittaa mahdolliseen chemopreventive vaikutus johtuen epigeneettiset muutos aiheuttamien nämä ruokavaliota kasvien [25], [26]. Kuitenkin vaihtelevan demetyloiva tehoa polyfenolien edelleen huonosti, koska useimmat julkaistut tutkimukset osoittivat tietoja vain kourallinen geenien, ja monet näistä epigeneettiset vaikutukset eivät ole olleet toistettavissa riippumattomissa tutkimuksissa [27], [28].

Curcumin (diferuloylmethane), luonnollinen yhdiste johdettu mauste kurkuma (

Curcuma longa

), on käytetty hoidettaessa erilaisia ​​tulehdussairauksia perinteisen Intian ja Kiinan järjestelmien lääkettä. Viime vuosikymmeninä, laaja ja syvällinen elin tieteellisiin julkaisuihin on paljastanut, että chemopreventive vaikutukset curcumin välittyvät eri molekyylitason mekanismeja, mukaan lukien sen suora tai epäsuora vuorovaikutus erilaisten transkriptiotekijöiden, entsyymejä ja säätelyproteiineilla että pelata keskeinen rooli keskeisten syöpään liittyvien prosessien kuten tulehduksen, lisääntymistä, eloonjääntiä, muuttoliike, angiogeneesi, invaasio ja etäpesäkkeiden [22]. Todisteet tehokkuudesta curcumin syöpävastaisena tai chemopreventive aine on peräisin satojen tutkimuksia varten soluviljelmässä järjestelmissä, eläinmalleissa ja ihmisillä [29]. Uudemmat tutkimukset ovat alkaneet tunnustaa curcumin n vaikutus moduloimaan epigeneettisiä prosesseja syöpäsoluissa, joissa kurkumiini on osoitettu olevan histoni-asetyylitransferaasi (HAT) estäjä [30], [31], samoin kuin mahdollinen DNMT1 estäjä, joka in hypometylaatio eri geenien myös RARβ2 kohdunkaulan syöpäsolut [32] – [34]. Kuitenkin rooli curcumin kuin DNA hypomethylating yhdiste ei ole tutkittu systemaattisesti kuin vielä, ja sen demetyloivan mahdollisuuksia ei ole onnistunut otettu kokonaisuudessaan muissa tutkimuksissa [32], [33].

Näin esillä olevassa tutkimuksessa, suoritimme kattavan ja systemaattisen analyysin tutkia vaikutusta curcumin DNA-metylaation koolonkarsinoomasoluissa. Genominlaajuisten DNA metylaatio analyysejä ja samanaikainen geeniekspressioprofilointi tutkimuksista tehtiin CRC solulinjoissa käsitelty lyhyen ja pitkän aikavälin curcumin hoidossa. Tässä osoitamme, että curcumin säätelee DNA: n metylaation muutoksia syöpäsolujen; Lisäksi tällaiset muutokset ovat usein Havaintoa vastaavat muutokset geenien ilmentyminen. Lopuksi on tarjota uusia todisteita, että toisin kuin globaali hypometylaatio aiheuttama 5-atsa-CdR, DNA: n metylaation muutoksiin liittyvät curcumin hoitoon esiintyy vain osajoukko ensisijaisesti osittain metyloitu geenejä, ja aika riippuvaisella tavalla.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

kolme ihmisen CRC solulinjoissa, HCT116 (mikrosatelliittien epävakaa tai MSI), RKO (CpG Island metylaatio fenotyyppiin tai CIMP) ja HT29 (mikrosatelliittimerkkien vakaa tai MSS ), saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Soluja kasvatettiin IMDM: ssä alustassa (Invitrogen, Rockville MD) vakio-olosuhteissa 10% naudan sikiön seerumia ja 5% CO

2 37 ° C: ssa. Solulinjaa autenttisuudessa usein vahvistettiin analysoimalla eri geneettiset ja epigeneettiset markkereita välein 6-8 kuukautta.

Curcumin hoito

Curcumin (Sigma-Aldrich, MO, USA) varastot valmistettiin liuottamalla se dimetyylisulfoksidissa (DMSO), 10 mM, ja pieniä alikvootteja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Määrittämään vaikutuksen kurkumiinista DNA: n metylaatio, kaikki kolme CRC solulinjoja altistettiin 7,5-10 uM curcumin lyhytaikaiseen (6 päivää, STC) tai pitkäaikaista (240 päivää, LTC) hoidon. Tuore curcumin sisältävä viljelyalusta vaihdettiin joka toinen päivä aikana hoidon. Ohjaus solulinjat ilman curcumin hoitoa kasvatettiin jokaisen sarjan hoitojen samaksi ajaksi.

5-atsa-CdR ja TSA hoito

5-atsa-CdR käsittely suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],35]. Lyhyesti, 5-atsa-CdR liuotettiin PBS: ään (pH 7,5), 5 mM ja pienissä erissä pidettiin jäädytettyinä -20 ° C: ssa. Kaksikymmentä neljä tuntia ymppäyksen jälkeen, CRC-soluja käsiteltiin 2,5 uM 5-atsa-CDR (Sigma-Aldrich, MO, USA) 24 tunnin ajan, ja solut kerättiin 48 tunnin jälkeen. Trikostatiini A (TSA) liuotettiin etanoliin 0,3 uM. Solut ympättiin samalla tavalla ja sen jälkeen, kun oli kasvatettu yön yli, käsiteltiin TSA 24 tuntia. Solut pelletoitiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti.

MTT elinkyvyn

vaikutukset kurkumiinista solujen elävyys määritettiin MTT-määritys, joka perustuu 3- (4 , 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia ottoa. -Soluja (2 x 10

3 /kuoppa) siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen curcumin hoitoa. 72 tunnin jälkeen kurkumiinin hoidon, MTT-liuosta lisättiin jokaiseen kuoppaan ja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Soluja inkuboitiin SDS-puskuria (10%) ja 0,01 M HCI: ssa yön yli, ja absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä käyttämällä spektrofotometriä. Riippumattomat kokeet suoritettiin kolme kertaa kolmena kappaleena.

bromideoksiuridiinia (BrdU) proliferaatiotestillä

Solulisääntyminen analyysit suoritettiin käyttäen kolorimetristä Cell Proliferation ELISA, BrdU kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) seuraavat valmistajan ohjeita. Lyhyesti, 2 x 10

3-soluja viljeltiin 96-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin curcumin 72 tuntia. Proliferaatio indeksi mitattiin BrdU valmistajan ohjeita noudattaen. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena 3 itsenäisestä kokeesta.

Plating Tehokkuus

testaamiseksi pinnoitus tehokkuutta, solut maljattiin alhaisella tiheydellä 6-kuoppalevyille ja käsitelty käyttäen hoito-protokollaa edellä kuvatulla tavalla 12-16 päivää, kunnes yksittäiset solut muodostivat selvästi näkemään pesäkkeitä. Tämän jälkeen solut kiinnitettiin 10% formaliinilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Pesun jälkeen levyjä kuivattiin ilmassa ja digitaalisia kuvia on otettu. Riippumattomat kokeet suoritettiin kolme kertaa kolmena kappaleena.

DNA Extraction, bisulfiittimodifikaatio ja metylointi profilointi (Infinium metylaatiomääritystä) B

DNA uutettiin DNeasy Veren Tissue (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Perimän DNA oli bisulfiitin muutettu (EZ DNA: n metylaatio Gold Kit, Zymo Research, lisätkää kaupunki /osavaltio) kuten aiemmin on kuvattu [35]. Analysoida vaikutus kurkumiinista DNA: n metylaatio, suoritimme DNA: n metylaatio profilointi käyttäen Infinium metylaatiomääritystä kanssa HumanMethylation27 BeadChip mikrosiruja (Illumina, San Diego, CA), jotka kykenevät samanaikaisesti analysoida metylaatiostatuksen 27578 yksittäisten CpG aluetta, jotka kattoivat yli 14000 geenejä [36]. Koko genomin vahvistus, merkintöjä, hybridisaatio ja skannaus suoritettiin mukaan valmistajan ohjeiden on genomiikan ydin laitokseen Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine, Houston, TX. Metylaatiostatuksen mitattiin suhde signaalin metyloidut koetin suhteessa sekä metyloidut ja metyloitumaton anturi signaaleja. Metylointi suhdelukuja eristettiin käyttäen metylaation moduulit Illumina Bead Studio seuraavat keskimääräiset normalisoituminen sekä määrällisiä β-arvo vaihteli 0 (0% metylaatio) 1 (100% metylaatio). P-arvo cut-off havaittavissa koetin signaaleja asetettiin 0,05. Sillä metylaatio selvityksistä Δβ-arvo ≥0.1 (10% metylaatio) määriteltiin merkittävä [37].

kvantitatiivinen metylaatio Analyysit

validoitu metylaatio microarray data riippumattomien yksittäinen geeni /promoottori kvantitatiivinen metylaatio määrityksissä. Riippuen metylaatiomääritystä rakenteellisia ominaisuuksia, käytimme joko bisulfiitin pyrosekvensointi (PSQ HS 96A pyrosekvensointi järjestelmä, Qiagen, Valencia, CA) tai reaaliaikainen pohjainen qMSP Määrällisille metylaation analyysejä kuten aiemmin on kuvattu [37], [38]. Alukesekvensseissä käytetään molempia menetelmiä annetaan Täydentävä taulukossa S1.

Gene Expression Microarray Analyysit

Samanaikaisesti metyloinnin profilointia, suoritimme microarray geenien ilmentymisen tehdään noudattaen valmistajan ohjeita ja aiemmin perustettu protokolla [39]. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy mini-kit (QIAGEN, Valencia, CA) ja monistettiin käyttäen Illumina n TotalPrep RNA Amplification Kit. RNA eheys arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer. Leimattu cRNA hybridisoitiin yön yli Human HT12 V3 sirut, pestään, ja skannattu koskevasta Illumina BeadStation-500. Illumina n BeadStudio versio 3.1 käytettiin tuottamaan signaalin voimakkuuden arvoja skannaukset, vähennä tausta, ja skaalata microarray keskiviivan keskimääräinen voimakkuus kaikille näytteille (per-chip normalisointi). Normalisointi tehtiin käyttäen quantiles kanssa Lumi R-paketti. Fold-muutokset laskettiin suhteessa niiden valvontaa kuten muualla on kuvattu [35]. Kekseliäisyyttä polku analyysi (IPA, kekseliäisyyttä Systems, Inc. CA, USA) suoritettiin arvioimiseksi und kategorioihin ilmentyvät eri geenejä erilaisten toiminnallisten polkuja.

TILASTOANALYYSI

Kaikki tiedot analysoitiin käyttäen Graph Pad Prism 4.0 (San Diego, CA, USA) tilasto-ohjelmalla. Erot kahden ryhmän välillä analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. Erot enemmän kuin kaksi ryhmää analysoitiin toistettujen mittausten ANOVA ja Bonferroni monivertai- kuin

post hoc

testi. Kaksipuolinen p-arvot 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Curcumin Estää elinkykyyn ja Proliferation CRC Solulinjat

Aiemmat tutkimukset ovat tuottaneet useita tasoja todisteiden anti-syöpä vaikutuksia curcumin vaikuttamalla solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliike ja hyökkäystä. Määrittämään tehokkaan ja myrkytön curcumin pitoisuudet meidän paneelissa CRC solulinjojen (kuvio 1A) ensin suoritettu lisääntymistä ja solujen elinkelpoisuuden määritykset CRC solulinjoissa altistuvat eri pitoisuuksia tämän ruokavalion polyphenol. Kolme ihmisen CRC solulinjoja, jotka edustavat erillisiä epigenotypes ihmisen paksusuolen syövistä käytettiin: HCT116 (mikrosatelliittimerkkien epävakaa – MSI – tasyöpäsolulinja johtuu ituradan mutaation

MLH1,

mismatch korjaus geeni), RKO (MSI syöpäsolun rivi liittyy

MLH1

promoottori hypermetylaation yhteydessä CpG saaren promoottori metylaatio fenotyyppiin tai CIMP) ja HT29 (mikrosatelliittimerkkien vakaa tai MSS, solulinjan mutantti

KRAS-

ja

p53

geenit) [40]. MTT: n ja BrdU-määritykset suoritettiin käsittelyn jälkeen joko kurkumiini (0-20 uM) tai DMSO: ta 72 tuntia (kuvio 1 B 1C, vastaavasti). Leviämisen CRC solulinjojen eksponentiaalisesti vaikuttaa annoksesta riippuvalla tavalla. Vaikka pitoisuudet ≥15 uM liittyivät myrkyllisyys, suunnilleen puolet maksimaalisesta eston pitoisuuksien (IC

50) 7,5 uM HCT116 ja 10