Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) liittyy menetys solun adheesiomolekyyli E-kadheriinin ja häiriöitä solun soluliitos sekä migraatio ominaisuuksia kuten uudelleenjärjestely aktiinisytoskeletonin ja aktivointi RhoA GTPaasi. Tässä osoitamme, että depolymerointi aktiinisytoskeletonin eri metastaattisen syövän solulinjojen Sytokalasiini D (Cyt D) pienentää solun kokoa ja F-aktiini tasoja ja indusoi E-kadheriinin ilmentymisen sekä proteiini- ja mRNA-tasolla. Induktio E-kadheriinin oli annoksesta riippuva ja samansuuntainen menetys mesenkymaalisten merkkiaineiden N-kadheriinin ja vimentiinin. E-kadheriinin nousivat 2 tuntia lisäämisen jälkeen Cyt D soluissa, joka esittää E-kadheriinin mRNA vasteen mutta ainoastaan ​​sen jälkeen, kun 10-12 tuntia HT-1080 fibrosarkooma ja MDA-MB-231-soluja, joissa E-kadheriinin mRNA-tasolla olivat vain minimaalisesti vaikuttaa Cyt D. Cyt D indusoi ydinvoima-sytoplasmista translokaatio EMT liittyvien Snai 1 ja SMAD1 /2/3 transkriptiotekijöitä. Ei-metastasoituneen MCF-7 rintasyöpäsolujen, jotka ilmentävät E-kadheriinin ja edustavat syöpäsolun mallin EMT, aktiini depolymerization kanssa Cyt D aiheuttama kohonnut E-kadheriinin kun aktiini stabilointi jasplakinolidin vähensi E-kadheriinin tasolle. Kohonnut E-kadheriinin taso johtuu Cyt D olivat yhteydessä alentuneeseen aktivoituminen Rho A. Expression of dominanttinegatiivivaikutus Rho Mutantti kasvoi ja hallitseva-aktiivisen Rho Mutantti väheni E-kadheriinin tasoilla ja esti myös Cyt D induktion E-kadheriinin. Alennettu Rho aktivointi alavirtaan aktiini remontin vuoksi indusoi E-kadheriinin ja kääntää EMT syöpäsoluissa. Cyt D-käsittely esti muuttoliikkeen ja suurempina pitoisuuksina, aiheuttama sytotoksisuuden sekä HT-1080 fibrosarkoomasoluissa ja normaali HS27 fibroblasteissa, mutta vain indusoi mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen HT-1080 syöpäsoluja. Tutkimuksemme osoittavat, että aktiini remodeling on ylävirran säätelijä EMT metastaattisessa syöpäsoluja.

Citation: Shankar J, Nabi IR (2015) Aktiinisytoskeletonin asetuksen epiteelin mesenkymaalitransitioon metastaattisessa syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (3): e0119954. doi: 10,1371 /journal.pone.0119954

Academic Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 18 heinäkuu 2014; Hyväksytty 26. tammikuuta 2015 Julkaistu: 10 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Shankar, Nabi. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Cancer Research Society avustus (IRN), kanadalainen Breast Cancer Foundation Postdoctoral Fellowship (JS) ja kanadalainen Cancer Society Research Institute Innovation Grant (MR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Ivan Nabi on PLoS One toimitusneuvosto jäsen ja tämä ei muuta kirjoittajien noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) on solun ohjelma vaaditaan normaalissa kehitysprosesseja kuten embryogeneesiin ja kudoksen uudelleen ja myös etenemistä sairauksien, kuten syövän [1]. Tämän prosessin aikana, häiriöiden solu-solu-ja soluväliaineen (ECM) kiinnikkeistä päästöt epiteelisolujen ympäröivästä kudoksesta. Vapautunut solut muuntua mesenkymaaliset, muuttavien solujen parannettu kyky liikkua meshwork kolmiulotteinen ECM. Lokalisoitu kasvutekijöiden ekspression, kuten TGF-β ja EGF indusoi EMT aktivaation kautta Wnt ja Notch signalointireitteihin ja loppupään transkriptiotekijöiden, kuten Smad, Snail, ZEB ja Twist. Expression epiteelisolujen solu-solu-adheesio proteiinit, kuten E-kadheriinin on säädeltiin samalla mesenkymaalisten solu-solu-adheesio proteiinit, kuten N-kadheriinin, vimentiinistä ja soluväliaineen proteiinien fibronektiinin ja kollageenin, on upregulated [1,2,3].

aivokuoren järjestäminen aktiinisäikeiden on tunnusmerkki epiteelisolujen taas aktiini stressi kuidut löytyy mesenkyymisolujen. Aktiinisytoskeletonin remodeling välittyy Rho-GTPaasit, ja se edustaa perustason mekanismi kriittinen solujen vaeltamiseen aikana prosessien, kuten syövän etäpesäkkeiden. Osalta EMT, aktivointi RhoA johtaa ROCK riippuvaisen aktiinisytoskeletonin remontin ja häiriöitä E-kadheriinin pohjainen solu kiinnikkeistä [4,5,6,7,8,9]. Useat aktiinisytoskeletonin liittyviä proteiineja, kuten α-aktiini, myosiinin kevytketju, integriinit, tropomyosins ja moesiini on osoitettu voimistuvan aikana EMT [3,7,10,11,12,13,14]. Aktiinisytoskeletonin sääntelyviranomaiset todettiin myös kriittinen tekijöitä lymfooman etenemisen menetykseen-of-function RNAi näyttö hiiren kasvainmuotoja [15]. Expression of aktiini säätelevien proteiinien kuten Arp2 /3 ja WAVE2 korreloi huonon ennusteen rinta- ja maksakarsinoomien tukeva rooli aktiinisytoskeletonin dynamiikkaa ja organisaation kriittinen säätelijöinä syövän etenemisen [16]. Tuoreessa tutkimuksessa on myös sekaantunut lisääntynyt myosin IIB ilmaisun ja myosiinin IIA raskaan ketjun fosforylaatio parantamisessa rintaepiteelisolulinja solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen TGF-β-aiheuttama EMT [17].

Osoitimme aikaisemmin, että alennettu ilmentyminen pseudopod- rikastettu proteiineja vähensivät aktiinisytoskeletonin dynamiikkaa ja solun kokoa, jotka liittyvät käänteinen EMT kuudessa metastaattinen solulinjoissa [18]. Nyt osoittavat, että depolymerointi aktiinisytoskeletonin syöpäsolujen kanssa sytokalasiini D (Cyt D) indusoi ydin-sytoplasmista translokaatio EMT liittyvien transkriptiotekijöiden, lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen, vähentää solujen muoto ja koko ja vähentää aktivointi RhoA. MCF-7-rintasyöpäsolut, induktio E-kadheriinin by aktiini depolymeroimalla vaatii RhoA inaktivointi kun taas hallitsevalla aktiivinen RhoA indusoi E-kadheriinin. Tämä viittaa siihen, että aktiinisytoskeletonin remontin ylävirtaan RhoA signalointi on rooli EMT.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

Hiiren E-kadheriinin (# 610182) ja N -cadherin (# 610920) vasta-aineet olivat peräisin BD Transduction Laboratories; anti-β-aktiini oli Sigma, anti-vimentiinistä (ab11256) oli peräisin Abcam. SMAD1 /2/3 (Sc-7960), Snai 1 (Sc-28199), RhoA (Sc-418), c-Myc (Sc-789) vasta-aineet olivat Santa Cruz. Alexa488-, Alexa568-, ja Alexa647-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita ja rhodamine- ja Alexa568-konjugoidun phalloidin olivat Molecular Probes. Reagenssit reaaliaikainen PCR olivat Applied Biosystems; RNA eristyspakkausta oli Qiagen. Sytokalasiini D ja jasplakinolidin olivat yhtiöstä Calbiochem (Millipore). RhoA plasmidit olivat ystävällinen lahja Nathalie Lamarche (McGill University). RhoA helmiä, MLB lyysipuskuria ja Rac1 mAb olivat Millipore (Upstate).

Soluviljely, western blot ja immunofluoresenssimikroskoopilla

Ihmisen MDA-231, MDA-435, DU145, HT1080, U251 , U87F-7, MCF-7 ja HS27 solulinjat olivat American Type Culture Collection. MDA-231, MDA-435, ja DU145 pidettiin täydellisessä RPMI 1640 ja HT-1080, U251, U87, MCF-7 ja HS27-solut DMEM täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 2 mmol /L L-glutamiinia, 25 mmol /l HEPES-puskuria ja RPM1 ja natriumpyruvaattia varten DMEM, vastaavasti 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Länsi-blotit, solulysaatteja valmistettiin, proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen Bradford-reagenssia ja yhtä suuret määrät solu-proteiinia ladattiin. Immunofluoresenssi-, soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille fiksoitiin 3% paraformaldehydillä ja vasta-leimattu, kuten aikaisemmin on kuvattu [18]. Kuvat kerättiin × 60 tai × 100 planapochromat tavoitteisiin (numeerinen aukko, 1,35) olevan FV1000 Olympus -konfokaalimikroskoopilla.

Rho GTPaasi aktiivisuusanalyysiä

RhoA avattavasta suoritettiin valmistajan protokolla (Millipore) ja tasot RhoA GTP ja koko RhoA havaittiin western-blottauksella käyttämällä RhoA (Santa Cruz Biotechnology) vasta-aine. Ennen hoidon Cyt D-solut transfektoitiin ohimenevästi RhoA Plasmidit käyttämällä Effectene (Qiagen) valmistajan menettelytapaa.

Solun maahanmuutto- ja -sytotoksisuusmäärityksiä

Noin 3 x 10

4 HT1080 ja HS27 solut siirrettiin päällystämättömän (siirtymä) 8 um soluviljelmässä insertit (BD Falcon) kasvatusliuoksessa, joka sisälsi 2% seerumia. Kokoonpano pantiin 24-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät täydellistä kasvualustaa. Solujen annettiin kiinnittyä suodattimeen 4-6 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla Cyt D ja, kuten ajoneuvon hallintaan, 1% DMSO: ta, 12 tunnin ajan. Jälkeen 12 tuntia ei-vaeltavat solut poistettiin ylhäältä suodattimen pumpulipuikolla ja vaeltavat solut pohjalle suodattimen kiinnitettiin ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla, Sytotoksisuusanalyysejä, noin 7500 soluja sekä HT-1080 ja HS27 maljattiin 96-kuoppalevyille yön yli ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Cyt D tai 1% DMSO: ssa 10 tuntia ja sitten vesiliukoisen tetratsolium (WST-1-reagenssia), lisättiin yksittäisiin kaivoihin. 2 tuntia sen jälkeen, kun reagenssin lisäyksen, absorbanssi luettiin 450 nm: ssä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Reaaliaikainen PCR

RNA eristettiin kustakin solulinjasta käyttäen RNeasy Plus mini -kittiä (Qiagen) ja käänteiskopiointiin käyttäen High kapasiteetti cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Geenien ilmentyminen kvantifioitiin käyttäen reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) ABI 7500 Fast järjestelmä mukautettuja Taqman kullekin geenille käyttämällä Taqman Gene Expression Analyysit (Applied Biosystems). Suhteellinen ilmentyminen määritettiin käyttäen standardikäyrää ja geenien ilmentymisen normalisoidaan 18S rRNA runsaus.

Tilastollinen

Tilastolliset testit tehtiin määrittämiseksi merkitsevyystaso välillä kontrolli- ja testiryhmään. Kaikki tulokset esitetään keskiarvona ± SEM vähintään kolmen kokeen. Kaksi ryhmää vertailuja (vertailuryhmä vs. käsitelty tai ajankohtina suhteessa aikaan 0) suoritettiin käyttäen paritonta Studentin t-testi (kuviot. 1, 2, 3, 4 ja 5). Useiden ryhmä vertailuja (Fig. 6), yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn moninkertainen vertailutesti suoritettiin tuottaa tilastotietoja.

(A) DU145, MDA-231, MDA-435, HT1080, U251 ja U87-soluja maljattiin 24 tuntia, jätettiin käsittelemättä (kontrolli) tai käsiteltiin 100 uM Cyt D (Cyt D käsitelty) 12 tuntia, kiinteä ja immunofluorescently merkitty E-kadheriinin (vihreä) ja F-aktiini (punainen). Mittakaava: 10 um. (B) DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 ja U87-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 uM) ja keskimääräinen koko ja F aktiini sisältö solut määritettiin käyttäen Morphology Explorer Bioapplication Software on Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader. **

p

0,01 ja *

p

0,05; suhteessa kontrolliin (käsittelemätön) soluja.

(A) DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 ja U87-soluja käsiteltiin yli yön eri pitoisuus Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 uM) ja solulysaateista blotattiin E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinistä ja β-aktiini. (B) Reaaliaikainen PCR E-kadheriinin mRNA suoritettiin kokonais-RNA eristettiin DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 ja U87-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Cyt D. cyt D hoito lisäsi E-kadheriinin mRNA: n ekspressio kaikissa soluissa paitsi HT1080 ja MDA-231, jossa ei ollut mitään tai vähän ilmaisua. **,

p

0,01, *

p

0,05; suhteessa kontrolliin (käsittelemätön) soluja.

(A) DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 ja U87-soluja käsiteltiin Cyt D osoitetulle ajat ja solulysaateista blotattiin E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinistä ja β-aktiini. (B) Reaaliaikainen PCR E-kadheriinin mRNA suoritettiin kokonais-RNA eristettiin DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 ja U87-solujen käsiteltävä eri ajanjaksolla Cyt D . Cyt D hoito lisäsi E-kadheriinin mRNA ilmentymistaso kaikissa soluissa paitsi HT1080 ja MDA-231, jossa ei ollut mitään tai vähän ilmaisua. **,

p

0,01, *

p

0,05; suhteessa aikaan 0.

(A) DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 ja U87-soluja käsittelemättömiä (Control) tai käsiteltiin 100 uM Cyt D (Cyt D käsitelty) 12 tuntia ja immunofluorescently merkitty Smad1 /2/3 ja Snai 1 sekä Hoechst 33342 varten tumavärjäystä. Edustavia kuvia MDA-MB-231-solut näkyvät. (B) Soluja teki ydin- jakeluun Smad1 /2/3 ja Snai 1 valvonta ja Cyt D käsiteltyjen solujen. Tulokset esitetään prosentteina koko solun osoittaa ydin- jakautuminen näiden kahden proteiinin. Mittakaava: 10 um; **,

p

0,01, *

p

0,05; verrattuna käsittelemättömään kontrolliin kunkin solulinjan.

MCF-7-soluja käsiteltiin 100 uM Cyt D 12 h (A) tai 0-400 nM jasplakinolidi (JP) 12 tuntia. (B) ja lysaatit blotattiin E-kadheriinin ja β-aktiini. (C) RhoA GTP ja yhteensä RhoA taso määritettiin MCF-7-solut, joita käsiteltiin 100 uM Cyt D 12 tuntia. ***

p

0,001; suhteessa kontrolliin. (D) MCF-7-solut transfektoitiin määräävän-negatiivinen (DN), villityypin (WT) ja määräävän-aktiivinen (DA) RhoA 48 tuntia, minkä jälkeen solulysaatit tutkittiin c-Myc, E-kadheriinin ja β- aktiini. (E) Transfektoitumattomat MCF-7-soluja tai MCF-7-soluissa, jotka on transfektoitu määräävän-aktiivisen RhoA aktiivinen hoidettiin 100 uM Cyt D: ssa 12 h ja solulysaateista tutkittiin c-Myc, E-kadheriinin ja β-aktiini.

(A) HT-1080 ja HS27-soluja käsiteltiin yli yön eri pitoisuuksilla Cyt D (0, 50, 100, 200 uM) ja 1% DMSO: ta, kuten ajoneuvon ohjaus ja solulysaateista blotattiin E-kadheriinin , N-kadheriinin, vimentiinistä ja β-aktiini. (B) siirtolaisjärjestön määrityksiä, solut maljattiin 8 pM solujen insertit 4-6 tunnin hoidettiin konsentraatiot Cyt D 12 tunnin ja määrää solun vaeltavat suodattimen läpi laskettiin. (C) arvioimiseksi sytotoksisuuden ja Cyt D, solut maljattiin yön yli ja sitten sitä käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla Cyt D 10 tunnin ajan. WST-1-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja kahden tunnin kuluttua absorbanssi luettiin 450 nm: ssä. *

p

0,05, **

p

0,01 ja ***

p

0,001; DMSO käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin; Cyt D käsiteltyjen solujen suhteen DMSO käsiteltyihin soluihin.

Tulokset

Aktiini depolymerisaatiota aine Cyt D indusoi solujen kutistuu ja MET

Aiemmin raportoitu, että vähennetään aktiinisytoskeletonin dynamiikka kun ehtyminen pseudopod rikastettua AHNAK, septin 9, EIF4E ja S100A11 metastaattisessa syöpäsoluissa lisännyt ilmentyminen epiteelin merkki E-kadheriinin ja menetys mesenkymaalisten merkkiaineiden N-kadheriinin ja vimentiinista oleellisesti käännetään epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [ ,,,0],18]. Sen määrittämiseksi, onko muuttamalla aktiinisytoskeletonin dynamiikka voi suoraan vaikuttaa EMT käsittelimme kuusi metastaattinen ihmisen syövän solulinjoissa (eturauhasen DU145, rinta MDA-MB-231 ja MBA-MB-435, gliooma U251 ja U87 ja fibrosarkoomaa HT-1080) kanssa aktiini depolymerisoidaan agentti Cyt D. altistuneet solut Cyt D (100 uM) 12 tunnin osoitti pienennettynä ja värjättiin positiivisesti E-kadheriinin (Fig. 1A). DU145, MDA-MB-435, HT-1080 ja U87-solut osoittivat liitoskohtien lokalisaatio E-kadheriinin, kun U251 ja MDA-231-soluja esitetään enemmän solunsisäistä E-kadheriinin lokalisointi (Fig. 1A). Lisääntyvä Cyt D pitoisuudet 10-200 uM johti asteittaisen kutistuminen solujen ja vähentää F-aktiini sisältöä, havaitaan fluoresenssileimayhdistei- Alexa-568 phalloidin ja kvantitatiivisen analyysin kanssa Cellomics ArrayScan VTI automatisoitu fluoresenssikuvaajalla (Fig. 1 B).

Korkeammat pitoisuudet Cyt D lisääntyneen ekspression E-kadheriinin ja johti menetykseen mesenkymaalisten markkereita vimentiinista ja N-kadheriinin kaikkien kuuden solulinjoissa (Fig. 2A). Voimakkain vaikutus havaittiin 100 ja 200 uM Cyt D ja rinnastettiin lisääntynyt E-kadheriinin mRNA, määräytyy qPCR useimmissa solulinjoissa joskin vähemmässä määrin HT-1080-solujen eikä MDA-MB-231-solujen (Fig. 2B). Ajan myötä E-kadheriinin proteiini ja mRNA induktio vasteena 100 uM Cyt D vaihteli solulinjoista. Sillä DU145, U251, MDA-MB-435 ja, vähemmässä määrin U87, E-kadheriinin-proteiinin ilmentyminen indusoitiin 2 h ja liittyy lisääntynyt E-kadheriinin mRNA: ta (Fig. 3). MDA-MB-231 ja HT-1080-solut osoittivat vähän tai ei lainkaan ekspressiota E-kadheriinin mRNA-tasolla ja proteiinin ilmentyminen oli vain indusoitiin 8-10 h (Fig. 3). Aktiini depolymerointi by Cyt D vuoksi johtaa lisääntyneeseen E-kadheriinin ilmentymisen sekä mRNA-proteiinin tasot induktion E-kadheriinin liittyvä mRNA nopeamman induktion E-kadheriinin proteiinia.

Smad1 /2/3 ja SNAI1 ovat transkriptiotekijät jonka ydin- ilmentyminen liittyy EMT [19] ja paikantuvat tumaan metastasoituneessa tutkituissa soluissa [18]. Hoito MDA-MB-231-solujen kanssa 10 uM Cyt D johti dramaattiseen uudelleenjako Snai 1 ja SMAD1 /2/3 sytoplasmaan (Fig. 4). Vastaavia Cyt D-riippuvainen uudelleenjako näiden kahden EMT-liittyvä transkriptiotekijöiden tumasta sytoplasmaan havaittiin kaikkien kuuden metastaattisen solulinjoissa tutkittu (Fig. 4 B).

Actin depolymeroitumista säätelee RhoA aktivointi

Häiriöt aktiinisytoskeletonin siksi indusoi epiteelin siirtyminen metastaattisessa syöpäsoluja. Sitten testattiin roolia aktiinitukirangan dynamiikkaa EMT epiteelin, ei-metastasoituneen MCF-7 rintasyövän solut, jotka ilmentävät E-kadheriinin ja on hyvin tunnettu mallina EMT rintasyöpäsoluissa [20]. Kuten havaitaan metastaattinen solulinjojen hoidossa MCF-7-solujen Cyt D indusoi kohonneet E-kadheriinin tasoilla (Fig. 5 A). Sen sijaan, stabilointi aktiinisytoskeletonin nanomolaarisella pitoisuuksien jasplakinolidin, vähensi E-kadheriinin tasoilla (Fig. 5 B). Actin dynamics siksi vaikutukset E-kadheriinin ilmentymisen MCF-7-soluissa. Aktivoidut RhoA laukaisee EMT [4,5,9] ja induktio E-kadheriinin by Cyt D vähensi tasoja aktiivista RhoA MCF-7-solut (Fig. 5C). Tasaisen, transfektio MCF-7-solujen määräävää-aktiivisen RhoA aktiivinen alennetussa E-kadheriinin ilmentymisen, kun taas transfektio dominanttinegatiivivaikutus RhoA lisääntynyt E-kadheriinin ilmentyminen (kuvio. 5D). Lisäksi solut, jotka ilmentävät määräävässä aktiivinen RhoA, Cyt D ei enää vaikuttanut E-kadheriinin tasoilla (Fig. 5 E). RhoA aktivoinnin tila alavirtaan aktiinisytoskeletonin dynamiikka on keskeinen säätelijä E-kadheriinin ilmentymisen näissä syöpäsoluissa.

Cyt D ei indusoi MET normaaleissa fibroblasteissa

testaamiseksi syöpäsolujen spesifisyys cyt D induktio E-kadheriinin, käsittelimme HT-1080 fibrosarkooma soluja ja normaaleja ihmisen HS27 fibroblastisolulinjaa eri pitoisuuksilla cyt D (50, 100 ja 200 uM) sekä 1% DMSO: ta, kuten ajoneuvon ohjaus, 12 tunnin ajan. Ne olivat ennen, hoidon Cyt D johtaa induktioon E-kadheriinin HT-1080 kanssa menetystä N-kadheriinin ja vimentiinista 50 uM Cyt D. Mielenkiintoista, hoidon Cyt D HS27 ei vaikuttanut E-kadheriinin, N-kadheriinin tai vimentiinista ilmaisu viittaa siihen, että Cyt D induktio MET on nimenomaan syöpäsoluja (Fig. 6A). Hoito 10pM Cyt D vähensi merkitsevästi sekä migraation HT1080 ja HS27 solujen suhteessa 1% DMSO käyttää välineenä kontrolli (Fig. 6B) viittaa siihen, että solumigraation on herkempi aktiinitukirankaan häiriöitä. Sytotoksisuusmäärityksissä osoitti, että Cyt D oli toksinen solujen 100 ja 200 uM, mutta ei 10 ja 50 uM verrattuna 1% DMSO: ta (Fig. 6C).

Keskustelu

Actin organisaatio kriittinen solujen eri prosesseihin, kuten solun liikkuvuus, solunjakautumisen, organelle liike, solu signalointi sekä perustamista ja ylläpitoa soluliitos ja solujen muoto [21,22]. Aikana EMT, muutokset aktiini organisaatiossa noudatetaan ja ilmentymistä monista aktiini sääntelyn geenien ilmentymistä lisätään [3,7,10,11,12,13,14]. Olemme aiemmin raportoitu, että menetys proteiinin osien aktiini-rikas valejalka metastasoituneen syöpäsolujen muuttaa aktiinisytoskeletonin dynamiikka, vähentää solukoko ja indusoi E-kadheriinin ilmentymisen ja MET [18]. Täällä näytämme, että aktiini depolymerisoidaan aine, Cyt D, vähentää solujen koko ja muoto, inaktivoi RhoA ja indusoi E-kadheriinin, jossa määritellään aktiinisytoskeletonin kuin ylävirran säätelijänä EMT metastaattisessa syöpäsoluja. Yhdenmukaisesti näiden tietojen, olemme aiemmin raportoitu, että induktio MET menetyksen kautta pseudopod rikastettu proteiineja AHNAK, septin-9, EIF4E, ja S100A11, liittyi menetys F-aktiini ja lisää vakautta jäljellä F-aktiini kuidut [18] . Tärkeää on, Cyt D ei aiheuttanut MET normaaleissa fibroblasteissa viittaa siihen, että nämä vaikutukset ovat spesifisiä syöpäsoluja. Onko induktio täyttää aktiini depolymerointia liittyy nimenomaan häiriöitä kasvainsolun valejalka on vielä määrittämättä.

sytoplasmadomeenissa vuorovaikutusta E-kadheriinin kanssa α ja β-kateniinin muodostava solu-solu kiinnitysalueisiin ankkuroitu aktiinisytoskeletonin on kriittinen perustamista homotyyppisessä solu-soluliitos [23]. On raportoitu, että käsittelemällä soluja suurempina pitoisuuksina Cyt D pienenee solun läpäisevyyttä ja stabiloi tiiviiden liitosten [24]. Lisäksi osoitettiin, että kokoonpano tiiviin liitoksen johtaa E-kadheriinin induktio viittaa siihen, että vakauttaminen ja muodostuminen näiden liittymien säädellä E-kadheriinin ilmentymisen tasot [25]. Aiemmin se oli myös osoittanut, että aktiini depolymerisaatiota kanssa Cyt B ja latrunculin indusoi pinta E-kadheriinin ilmentymisen ja väheni N-kadheriinin ja vimentiinista ilmentymistä rotan βcells [26]. Hoidon Cyt D on myös osoitettu vähentävän vimentiinista ilmentymisen haiman syöpäsoluissa [27]. Tutkimuksessamme solujen käsittely Cyt D indusoi E-kadheriinin ilmentymisen kaikissa kuudessa metastaattisen solulinjojen ja myös vähentää dramaattisesti solujen koko ja muoto (kuviot. 1, 2). Hoito Cyt D merkittävästi lisääntynyt E-kadheriinin transkriptin tasolla kaikissa mutta MDA-231- viittaa siihen, että aktiinisytoskeletonin sääntely E-kadheriinin tasoja esiintyy mRNA ja proteiini tasoilla. Tärkeää on, nopeampi induktio E-kadheriinin havaittiin soluissa, jotka myös osoittivat kohonneet E-kadheriinin mRNA määriteltäessä ratkaiseva rooli de novo E-kadheriinin biosynteesiä MET. Todellakin, kohonnut Zeb2, transkriptionaalisen repressori E-kadheriinin, down-regulation E-kadheriinin sekä mRNA ja proteiini tasolla ja indusoi EMT [28].

Vaikka vahvin induktio MET havaittiin suuremmilla pitoisuuksilla Cyt D (100 ja 200 uM), jotka liittyivät 10-20% solun myrkyllisyyttä, me jatkuvasti havaittu induktion MET 50 uM Cyt D, joka ei liittynyt merkittäviä solujen myrkyllisyyteen ja MDA-231- , 10 uM Cyt D. Cell muuttoliikettä estyi 10 uM Cyt D ja korkeamman Cyt D pitoisuuksia, jotka indusoi MET myös liittyy lisääntynyt inhibitioon muuttoliikkeen ja vähensi F-aktiini tasot (Fig. 1 B). Emme havainneet induktio MET normaalissa HS27 fibroblasteissa missään Cyt D pitoisuudet osoittaa, että induktio epiteelin merkkiaineiden aktiini depolymeroimalla on syöpäsolu erityinen. Solujen migraation vuoksi on erityisen herkkä aktiinin depolymeroitumista kuin kääntyminen EMT viittaa siihen, että nämä kaksi aktiini-pohjainen soluvasteita differentiaalisesti säätelee aktiinisytoskeletonin.

RhoA aktivointi voidaan aloittaa EMT edistämällä E-kadheriinin hajoaminen [4 , 5,6,9,29]. Johdonmukaisesti, havaitsimme, että RhoA aktivointi liittyy vähentynyt E-kadheriinin tasolle. Kuitenkin raporttien mukaan vähennetään RhoA aktiivisuutta tarvitaan EMT paksusuolen syöpä etenemistä [30]. Toisin kuin aiemmassa tutkimuksessa, joka ilmoitetaan aktivoituminen RhoA mukaan Cyt D käsittely Swiss 3T3 fibroblasteissa [31] havaitsimme vähennetään RhoA aktiivisuutta kuin metastasoituneen MCF-7-solujen jälkeen Cyt D-käsittely, joka liittyy lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen (Fig . 5). Vastakkaiset havainnot saattavat johtua eri solulinjoja käytetään, fibroblastit vs epiteelin MCF-7-soluja, tai korkeampia pitoisuuksia ja pidemmän inkubointiaikojen käytettiin tutkimuksessamme. Itse asiassa niiden tutkimuksessa hoito kesti 6 h 0,5 ng /ml (1 uM), toisin kuin meidän yön yli tapahtuneen käsittelyn 100gM Cyt D, ja lisääntynyt aktivoitu RhoA havaittiin ensimmäisen 3 h vasta joka oli laskua aktivoitu RhoA tasoilla. Vähentynyt aktiivisuus RhoA tuotantoketjussa aktiini depolymerization siis indusoi E-kadheriinin ilmentymisen ja MET. Se seikka, että Cyt D ei lisätä E-kadheriinin ilmentymisen tasoa soluissa, jotka on transfektoitu määräävän aktiivisen RhoA osoittaa, että RhoA toimii alavirtaan aktiini remodeling säädellä E-kadheriinin ilmentyminen (kuvio. 5) ja EMT prosessi. Hoito MCF-7-solujen jasplakinolidin vähentynyt E-kadheriinin ilmentymisen viittaa siihen, että aktiini polymeroinnissa ja depolymeroimiseksi tapahtumat ovat vastakkaisia ​​vaikutuksia EMT. Mielenkiintoista, Cyt D vaikutus näytti spesifinen syöpäsoluja viittaa siihen, että pienimolekyylisiä säätelijöitä aktiinisytoskeletonin voitaisiin mahdollisesti kehitetään mahdollisimman terapeuttisia aineita.

asetus aktiini dynamiikan farmakologiset aineet voivat siis vaikuttaa ilmaus EMT markkereita, jossa määritellään kriittinen rooli aktiinin dynamiikan EMT ja viittaa siihen, että farmakologinen modulaatio aktiini dynamiikka on kelvollinen lähestymistapa kohdistaa EMT syövän. In vivo käytön aktiini modulaattorit, kuten sytokalasiinit, latrunculins, jasplakinolidin ja muut syövän hoitoon on rajoittanut niiden osoitti sivuvaikutuksia ja ei ole asianmukaisia ​​jakelujärjestelmä kohdennettua antoa varten kasvainsoluihin [32,33]. Kuitenkin viime aikoina on osoitettu, että Cyt D PEG-liposomeissa paransi liukoisuutta ja hyötyosuutta Cyt D ja indusoi voimakkaan syöpää ehkäisevistä vaikutuksista hiiren malleissa [34]. Tunnistaminen muita yhdisteitä, jotka voivat aiheuttaa MET tarkemmin voi edustaa vaihtoehtoista lähestymistapoja kohdistaa aktiinitukirankaan syövän.