Krooninen sairaus

tiivistelmä

Resistance sisplatiiniin perustuvaan hoitoon on suurin syy hoidon epäonnistumisesta ihmisen munasarjasyöpä. Parempi mekanismien ymmärtämistä sisplatiinin vastus tarjoaa uusia näkökulmia uusia terapeuttisia strategioita tätä tappavaa tautia. Akt ja p53 ovat tekijöitä sisplatiinin herkkyys. Rictor on osa mTOR proteiinikinaasikompleksi 2, joka vaaditaan Akt-fosforylaation (Ser473) ja täydellinen aktivointi. Kuitenkin tarkka rooli rictor ja suhde rictor ja p53 sisplatiinin vastuksen edelleen huonosti. Tässä, käyttäen herkkiä villityypin p53 (OV2008 ja A2780s), kestävät villityyppisen p53 (C13 * ja OVCAR433), ja p53 vaarantunut (A2780cp, OCC1 ja SKOV-3) munasarjasyöpäsoluja, olemme osoittaneet, että (i) rictor on määräävä sisplatiinin resistenssin chemosensitive ihmisen munasarjasyöpäsoluja; (Ii) sisplatiini down-regulation rictor pitoisuus kaspaasi-3 pilkkominen ja proteasomaalisten hajoaminen; (Iii) rictor alassäätö herkistää kemiallis-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja sisplatiiniin aiheuttamaa apoptoosia p53-riippuvainen tavalla; (Iv) rictor vaimentaa sisplatiinin indusoiman apoptoosin ja antaa resistenssin aktivoimalla ja vakauttaa Akt. Nämä havainnot ulottuvat nykyisen tietämyksen molekyyli- ja solutason perusteella sisplatiinin vastuksen ja antaa perustelut perustan rictor mahdollisena terapeuttisena kohteena solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä.

Citation: Im-aram A, Farrand L, Bae SM, Song G, Song YS, Han JY, et al. (2013) mTORC2 Component Rictor Auttaa Sisplatiini Resistance Human munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 8 (9): e75455. doi: 10,1371 /journal.pone.0075455

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 24, 2013; Hyväksytty: 15 elokuu 2013; Julkaistu 23 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Im-aram et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat World Class University (WCU) ohjelma kautta opetus-, tiede- ja teknologia ja rahoittaa National Research Foundation of Korea (R31-10056) ja Kanadan Institutes of Health Research (M0P-126144). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti naisilla maailmanlaajuisesti [1]. Huolimatta edistysaskeleet ymmärrystämme tuumoribiologiassa, yleistä kuolleisuutta munasarjasyöpä (OVCA) on edelleen korkea. Tällä hetkellä kemoterapiaa yhdessä kirurgisen debulking on ensisijainen hoitovaihtoehto ja johdannaiset sisplatiinin (CDDP: cis-diamminedichloroplatinum) ovat ensilinjan kemoterapeuttisen terapeuttisia. CDDP indusoi sytotoksinen solukuolemaa muodostamalla DNA-platinaa additiotuotteet, jolloin DNA-vaurioita ja aktivointi apoptoottisten reittien [2].

tehokas hoito OVCA haittaavat usein myöhäinen diagnosointi ja syntyminen vastustuskykyä kemoterapian jälkeen peräkkäiset hoidon. Kestävyys kemoterapeuttisia liittyy monimutkaisia ​​mekanismeja, jotka voivat johtua säädeltyyn signalointi, parannettu DNA korjaus, muuttunut syöpä solujen aineenvaihduntaa [3,4], huumeiden kuljetuksen ja aineenvaihdunta [5], sekä dysregulaatio eloonjäämistekijöitä, kuten FLIP, XIAP ja Akt [6 -9]. Nämä molekyyli- ja solutason tapahtumia muuttaa yleistä vastetta solun genotoksisten tekijöiden, kuten CDDP ja vaikuttavat solun kohti pro-eloonjäämisen päätöksiä.

nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) reitin on tullut kriittinen säätelijänä cellular aineenvaihdunta, kasvu, leviämisen ja selviytymistä. Sen poikkeama, joka on läsnä jopa 50% [10] OVCA potilailla, on osoitettu resistenssin CDDP-perustuvaa hoitoa ja siihen liittyy haitallisia ennusteeseen [11-14]. MTOR reittiin kuuluu kaksi signalointi komplekseja: mTORC1 ja mTORC2. mTORC1 on herkkä rapamysiinin ja valvontaa proteiinisynteesiä ja solun aineenvaihdunnan, kun mTORC2 on välttämätön solujen elinkelpoisuus [15]. mTORC2 tunnetaan myös sen rooli fosforylaation Akt at Ser473 mahdollistaa täyden aktivointi ja proteasomaalisten hajoaminen [16-18]. Akt aktivointi ja /tai yli-ilmentyminen on määräävä CDDP herkkyys ihmisen OVCA. Akt aktivointi johtaa vakauttamiseen useita kaspaasi-inhibiittorit [19,20] estää mitokondrioiden p53 kertymistä ja vapautumista kuoleman proteiinien [21,22], ja vaimentaa p53 fosforylaatiota ja ydin- toiminto [8]. Sen sijaan, Akt esto lisää p53 fosforylaatiota (Ser

15) ja CDDP herkkyys [8,23].

rapamysiini erottelua kumppani mTOR (Rictor) on olennainen osa monimutkaista mTORC2, ja vaaditaan sen kaiken toiminnan [24]. Yli-ilmentyminen rictor lisää mTORC2 aktiivisuutta ja edistää solujen kasvua ja liikkuvuus [25]. Toisaalta rictor alassäätöä tukahduttaa solujen lisääntymistä ja kasvaimen muodostumista tietyissä syövissä [26-28]. Rictor myös vuorovaikutuksessa integriini-sitoutuvan kinaasin (ILK) edistää syöpäsolujen selviytymisen kautta Akt Ser473 fosforylaation, ja PKCζ varten syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden [29,30]. Rictor tarvitaan eturauhasen syövän kehittymisen aiheuttamaa PTEN menetys [31]. Kohdistaminen rictor indusoi solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa ja vähentää sykliini D1 ilmentyminen rinta-, paksusuolen ja eturauhasen syöpäsolujen [27,32]. Lisäksi alas-säätely mTORC2 helpottaa kemoterapeuttisen lääkkeen aiheuttama apoptoosin rintasyövän soluissa [33]. Kuitenkin rooli rictor in CDDP resistenssin OVCA on tuntematon.

p53 on kasvaimia estävä proteiini, joka vaikuttaa alavirran efektorit apoptoosin kautta sekä transkriptiosta riippuvan riippumattomien mekanismien kautta [8,21]. Se on yleensä aktivoituu CDDP kautta fosforylaation Ser15 ja Ser20, jotka ovat välttämättömiä sen pro-apoptoottisia ominaisuuksia, ja tukahduttaminen hiiren kaksinkertainen minuutti 2 (MDM2) ja sen ubikitinaatio ja proteasomaalisten hajoaminen [34-36]. Olemme äskettäin osoittaneet, että menetys p53 toimintoa inaktivaatio tai mutaatio vaikuttaa negatiivisesti apoptoosia ja kemosensitiivisyys [7,37]. Soluja, joista puuttuu funktionaalinen p53 eivät estävän mTORC1 vasteena DNA-vauriolle [38]. Kuitenkin yhteensovittaminen ja viestintä p53 aseman ja rictor säätelyssä chemoresistance tunnetaan huonosti.

Tässä tutkimuksessa oletamme, että rictor tärkeä rooli säätelyssä kemosensitiivisyys of OVCA soluja ja että sen alaspäin sääntely herkistää solunsalpaajaresistentti OVCA solujen CDDP hoitoon helpottamalla Akt-riippuvaisen proteasomaalisten hajoamista, tavalla riippuvainen p53 tila. Tuloksia Tämän tutkimuksen esiin mahdollisuuden, että rictor voi olla terapeuttinen kohde OVCA, vaikka tehokkuus tällaisesta sovelluksesta on todennäköisesti riippuvainen p53 status.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

RPMI 1640 ja DMEM /F12-elatusaineissa, naudan sikiön seerumia (FBS), ei-välttämättömiä aminohappoja, penisilliiniä, streptomysiiniä ja amfoterisiini B: tä oli Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). CDDP, dimetyylisulfoksidi (DMSO), Hoechst 33248, aprotiniini, natriumortovanadaattia (Na

3Vo

4), fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), olivat Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kanin polyklonaalisia vasta-aineita: anti-fosfo-Ser

473-Akt, anti-fosfo-Ser

450-Akt, anti-Akt, anti-fosfo-Ser

15-p53, anti-PARP ja kani monoklonaalinen anti-rictor-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Hiiren monoklonaalinen anti-p53 ja anti-GAPDH vasta-aineet olivat Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) ja Abcam (Cambridge, MA, USA), tässä järjestyksessä. Vuohen anti-hiiri, ja anti-kaniini-vasta-aineet olivat Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). Rictor ja p53 siRNA ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Ohjaus siRNA oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Lipofectamine 2000, RNaasi A, N, N, N ’, N’-tetrametyyli-1,2-diamiini (TEMED), TRIzol ja ROX väriaine oli Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNeasy Mini Kit oli Qiagen (Valencia, CA, USA). Adenovirus-konstrukteja, jotka sisältävät wt-p53 ja eGFP transkriptit olivat Vector Biolabs (Philadelphia, PA, USA). Epoxomycin ja laktakystiini olivat EMD Chemical (Gibbstown, NJ, USA). Z-DEVD-FMK ja Z-VAD-FMK olivat Tocris Bioscience (Ellisville, MO, USA). Rictor ja GAPDH RNA pohjamaali olivat Bioneer (Daejeon, Korea) ja ihmisen yhdistelmä-aktiivinen kaspaasi 3 oli peräisin BioVision (Mountain View, CA, USA). PIPES, DL-ditiotreitoli (DDT), etyleenidiamiini-tetraetikkahappoa (EDTA) ja 3 [(3-cholamido-propyyli) dimethyallonio] -1-propaanisulfonaatti hydraatti (Chaps) ostettiin Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA) .

solulinjat ja kulttuurin

CDDP herkkiä (OV2008 ja A2780s) ja resistenttejä (C13 *, OVCAR-433, A2780cp, OCC-1, ja SKOV3) ihmisen OVCA solulinjoja avokätisesti Drs. Rakesh Goel ja Barbara Vanderhyden (Ottawa Hospital Cancer Center, Ottawa, ON, Kanada). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640 ja DMEM /F-12, kuten aiemmin on raportoitu [20,21,36]. OV2008 solulinjaa ja sen kestävä vastine C13 * olivat peräisin munasarjojen endomet- adenokarsinooma kanssa levyepiteelikarsinooma erilaistumista. OCC-1, A2780s ja A2780cp solut peräisin erilaistumaton munasarjasyövän kasvaimia. SKOV3- solut olivat selvästi solukarsinooman alkuperästä [39] ja OVCAR433 solut olivat vakavasta cystadenocarcinomas munasarja [23]. Seuraavat asianomaiset hoidot, solut kerättiin analyysiä varten.

Proteiinin uutto ja Western blotting -analyysi

menettelyt proteiini uuttamalla ja Western blotting -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [40]. Membraanit inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli anti-rictor (1: 100), fosfori-Ser

473-Akt (1: 1000) fosfo-Ser

450-Akt (1: 1000), p53 ( 1: 5000) fosfo-Ser

15-p53 (1: 1000) ja PARP (1: 2000) vasta-aineet ja 1 h huoneenlämmössä anti-GAPDH (1: 10000) ja HRP-konjugoitua kanin tai hiiren toissijainen vasta-aineet (1: 5000-1: 10000). GAPDH valittiin latauskontrollina koska sen solu- pitoisuus OVCA soluissa tutkittiin nykyisessä tutkimuksissa ei vaikuta CDDP hoitoa. Band tiheydet analysoitiin kvantifiointiin käyttäen ChemiDOC

TM XRS + (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) B

Arvio Apoptosis

Apoptoosi arvioitiin perustuen solun morfologian avulla tumaväriä Hoechst 33258. Menetelmä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20,36]. Vähintään 400 solua hoitoryhmää ja laskurin sokaisi välttämiseksi kokeellisen bias.

siRNA transfektion

OVCA solut transfektoitiin rictor siRNA (0-100 nM; 48 h) p53 siRNA (100 nM; 48 h), tai kontrollina siRNA (0-100 nM, 48 h) ja käsiteltiin sen jälkeen kanssa CDDP (0-10 uM, 24 h), kuten aiemmin on kuvattu [20], ja otettiin talteen tarkempaa analysointia .

adenovirusinfektio

A2780cp ja SKOV3-solut infektoitiin adenovirus-wt-p53 (MOI = 10, 24 h, GFP: n) kanssa kuten on aikaisemmin kuvattu [9,20].

in vitro kaspaasi-3: n aktiivisuuden

in vitro kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys suoritettiin kokosolulysaateista OV2008 kuten aikaisemmin on kuvattu [23].

tilastollinen analyysi

tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Tilastollinen analyysi suoritettiin pariksi t-testi, ja yksisuuntainen tai kaksisuuntainen ANOVA tarvittaessa käyttäen SigmaPlot® 12 (Systat Software Suite, IL, USA). Erot useiden koeryhmään määritettiin Bonferronin post-hoc-testi. Tilastollinen merkittävyys päätellä P 0.05.

Tulokset

CDDP down-regulation Rictor sisältöä ja indusoi apoptoosia chemosensitive mutta eivät kestä OVCA solujen

Voit selvittää rictor sisältö on muuttunut aikana CDDP hoidon OVCA, chemosensitive OVCA (OV2008 ja A2780s) ja solunsalpaajaresistentti (C13 *, A2780cp *, OVCAR433, OCC1 ja Skov-3) OVCA solulinjoja käsiteltiin CDDP (0-10 uM; 24 h) ja rictor pitoisuus arvioitiin immunoblottauksella [Kuva 1 ]. CDDP merkittävästi alassäädetty ehjä rictor sisältöä (200 kDa) ja indusoi apoptoosia chemosensitive (OV2008, *** P 0,001 ja A2780s, ** P 0,01), mutta ei solunsalpaajaresistentti OVCA riippumatta CDDP pitoisuus (C13 *, A2780cp, OVCAR433, OCC1 ja Skov-3; p 0,05). Nämä tulokset osoittavat, että rictor ei altistu alas-sääntelyn CDDP vuonna solunsalpaajaresistentti OVCA soluissa, ilmiö, joka saattaa edistää vastustuskykyisten fenotyypin.

Rictor proteiinin ilmentymistä säädellä vähentävästi chemosensitive (OV2008 ja A2780s), mutta ei solunsalpaajaresistentti OVCA (C13 * ja A2780cp *) aikana CDDP hoidon (0-10 uM CDDP; 24 h). Vähentynyt rictor sisältöä OV2008 ja A2780s seuraava CDDP hoitoon liittyi lisääntynyt apoptoosin. Rictor proteiinipitoisuus solunsalpaajaresistentti OVCA (OVCAR433, OCC1 ja SKOV3) ei vaikuttanut CDDP. Rictor pitoisuus normalisoitui vastaan ​​GAPDH (kuormituksen valvonta). Edustava Western blot kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, # p 0,05 (vs CTL herkkien solujen). Hoechst 33258 värjäys arviointiin käytetään apoptoosin mainittu koetoimenpiteet.

CDDP indusoi rictor käsittelyä ja kemosensitiivisyys on kaspaasi-3- ja proteasomin riippuvaisella tavalla

Voit selvittää, CDDP: n aiheuttamaa rictor alassäätöä voisi johtua translaation jälkeistä prosessointia, ensin tutkitaan mahdollisuus kaspaasiriippuvaisen lohkaisu rictor vuonna OV2008 ja A2780s kun käsitelty yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä Z-VAD FMK (10 uM) ennen ( 30 min) ja sen aikana CDDP haaste (0-10 uM; 24 h). OV2008 solut käsiteltiin CDDP yksinään osoitti ehjä rictor (200 kDa) ja kaksi immunoreaktiivisia pilkkoa tuotteita, jotka kulkeutuivat 160 kDa ja 130 kDa [Kuva 2]. CDDP laski ehjä rictor sisältö ja 160 kDa proteiinia, mutta selvästi nostivat 130 kDa. Vaikka hoito A2780s kanssa CDDP johti myös alas-säätely ehjä rictor (200 kDa), taso 160 kDa proteiini oli merkittävästi koholla, kun taas 130 kDa ei ollut merkittävä vaikutti. Esikäsittely solujen kanssa kaspaasiestäjä vaimensi merkittävästi CDDP: n aiheuttamaa muutoksia ehjä ja lohkaistaan ​​rictor sisältö sekä herkkien solujen (P 0,05 ja P 0,01 OV2008 ja A2780s, vastaavasti, kuvio 2), mikä viittaa siihen, että CDDP alas -regulates rictor osittain lisääntynyt kaspaasiaktiivisuus ja että pilkkominen eri kaspaasi konsensus sivustot voivat olla mukana. Lisäksi esikäsittely OVCA solujen erityisten kaspaasi-3-estäjällä Z-DEVD-FMK tuottivat samankaltaisia ​​tuloksia, mikä osoittaa, että kaspaasi-3 on osallisena CDDP: n aiheuttamaa rictor käsittely. Mielenkiintoista on, että kun CDDP: n indusoimaa apoptoosia sekä chemosensitive solulinjoissa, esikäsittely solut joko pan-kaspaasi tai erityisiä kaspaasi-3-estäjällä heikennetty tämän vastauksen, mikä viittaa siihen, että CDDP indusoi rictor käsittely kaspaasi-3 ja säätelyhäiriö tämän prosessin annetaan chemoresistance vuonna OVCA soluja.

OV2008 ja A2780s esikäsiteltiin Z-VAD FMK (10 uM) ja Z-DEVD FMK (50 uM) 30 minuutin aikana ja sitä ennen CDDP haaste (0-10 uM, 24 h) ja rictor sisältö ja apoptoosin arvioitiin. OV2008 solut käsiteltiin CDDP yksinään osoitti ehjä rictor (200 kDa) ja kaksi katkaistun tuotteet (160 kDa ja 130 kDa). CDDP laski ehjä rictor sisällön ja 160 kDa proteiinia, mutta selvästi kohonneeseen 130 kDa. Hoito A2780s kanssa CDDP johti alas-säätely ennallaan rictor mutta nousi tasolle 160 kDa proteiinin ja ei ollut vaikutusta 130 kDa proteiinia. Esikäsittely solujen kanssa pan-kaspaasi-inhibiittori (Z-VAD) tai erityiset kaspaasi-3-estäjällä (Z-DEVD) vaimensi merkittävästi CDDP: n aiheuttamaa muutoksia ehjä ja lohkaistaan ​​rictor sisältö sekä herkkien solujen, ja CDDP- indusoiman apoptoosin merkittävästi, mutta ei täysin vaimennettu läsnäolo inhibiittorit sekä chemosensitive solulinjoissa. Rictor pitoisuus normalisoitui vastaan ​​GAPDH (kuormituksen valvonta). Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM (n = 3 ja n = 5 OV2008 ja A2780s, vastaavasti). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs vastaavat kontrollit). Hoechst 33258 värjäys arviointiin käytetään apoptoosin mainittu koetoimenpiteet.

Voit selvittää proteasomaalisten huonontuminen on rooli CDDP: n aiheuttamaa rictor alassäätöä, OV2008 soluja viljeltiin [30 min ennen käsittely; 24 h hoidon aikana CDDP (0-10 uM)] kanssa proteasomiestäjät epoxomycin (10 nM) ja laktakystiini (4 uM). Kun taas CDDP yksin merkittävästi alassäädetty ehjä rictor ja indusoi apoptoosin, odotetusti, läsnäolo estäjien täysin tukossa CDDP: n aiheuttamaa rictor alassäätöä ja merkittävästi, mutta ei täysin heikennettyjä apoptoosin, mistä on osoituksena PARP pilkkominen ja ydin- morfologia (P 0,001; Kuva 3: A).

. OV2008-soluja esikäsiteltiin (30 min) kanssa proteasomaalisten estäjien [epoxomycin (10 nM) ja lacytasystin (4 uM)] ja saatettiin CDDP haasteeseen (0-10 uM, 24 h). Rictor sisältö ja apoptoosin analysoitiin Western blottauksella ja ydinvoiman morfologia arviointi. Sekä epoxomicin ja laktakystiiniä esti tehokkaasti CDDP: n aiheuttamaa rictor hajoamista (P 0,001), mutta vain osittain, heikennettyjä apoptoosin. B. OV2008 soluja viljeltiin samoissa olosuhteissa kuin A, mutta esikäsitelty proteasomin estäjä ja /tai Z-DEVD (50 uM). Ei synergistinen vaikutus näiden kahden estäjien havaittiin. C. inkubointi OV2008 kokosolulysaatissa (30 min, 30 ° C), jossa yhdistelmä-DNA-aktiivinen kaspaasi-3 (5-20 ug /ml) johti Rictor pilkkominen osoituksena laski ehjä rictor sisältöä (200 kDa), ja kasvoi lohkaistaan lomakkeet (130 kDa ja 160 kDa). Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs vastaavat kontrollit). Hoechst 33258 värjäys arviointiin käytetään apoptoosin mainittu koetoimenpiteet.

sitten tutkitaan edelleen, jos rictor käsittely kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja proteasomaalisten huononeminen tapahtuu erillistä reittiä. OV2008-soluja viljeltiin [30 min esikäsittely; 24 h hoidon aikana CDDP (0-10 uM)] kanssa proteasomiestäjät ja /tai erityisten kaspaasi-3-estäjällä. Samat tulokset havaittiin, kun joko inhibiittori oli läsnä. Kuitenkin mitään ylimääräisiä vaikutusta ei havaittu, kun molemmat estäjiä käytettiin yhdessä [Kuva 3: B].

Lisäksi lisänäyttöä että rictor käsittely aiheuttama CDDP hoito on kaspaasi-3-riippuvaisten, kokosolulysaateista alkaen OV2008-soluja käytettiin suorittamaan

in vitro

kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys.

in vitro

data oli sopimus, joka saatiin solulinjasta koe [Kuva 3: C]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CDDP alas-säätelee ehjä rictor proteiinitasolla kautta kaspaasi-3-pilkkoutumisen ja proteasomaalisten hajoamista.

Rictor pudotus herkistää kemiallis-resistenttejä OVCA ja CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia

perustaa roolin rictor vuonna OVCA chemoresistance, rictor ilmentymistä paino-p53 solunsalpaajaresistentti OVCA solulinja (C13 *) hiljennettiin siRNA (0, 50 ja 100 nM, 48 h) ennen käsittelyä CDDP (10 uM; 24 h), ja apoptoosi arvioitiin. Ehjä rictor ja sen katkaistun muotojen laskivat tuntuvasti-säädellään siRNA pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Merkittävä lasku ehjä rictor ja pilkotaan rictor havaittiin 50 nM (p 0,05) ja noin 30%: n vähennys 100 nM, riippumatta siitä, CDDP. Nämä havainnot paitsi vahvisti, että 160kDa ja 130 kDa immunoreaktiivisia vyöhykkeitä todellakin katkaistiin tuotteita rictor, vaan myös osoittanut, että rictor taintumisen aiheuttaman apoptoosin (p 0,05) sekä tehostettua CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia pitoisuudesta riippuvalla tavalla (p 0,001) [Kuva 4]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että rictor on tärkeä tekijä CDDP resistenssin OVCA.

C13 * solut transfektoitiin rictor siRNA (0-100 nM, 48 h), ja viljeltiin tai ilman CDDP: n (10 uM; 24 h ). Rictor Knockdown merkittävästi parannettu CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia C13 * solujen pitoisuudesta riippuvasti. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, *** p 0,001 (vs vastaaviin CTL siRNA). Hoechst 33258 värjäys arviointiin käytetään apoptoosin mainittu koetoimenpiteet.

Apoptotic vastauksena CDDP seuraavat rictor alassäätöä riippuu p53 asemasta

Kasvain p53 on tärkeä välittäjäaine CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia [9,22]. Koska noin 50% OVCA potilaista tehdä

TP53

geenin mutaatio (t) [41], on kiinnostavaa määrittää, jos CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia solunsalpaajaresistentti soluissa rictor pudotus on riippuvainen läsnä toimiva p53 . Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, rictor ilmentyminen solunsalpaajaresistentti OVCA solulinjoissa vaihtelevalla p53 status (wt-p53, C13 * ja OVCAR433, p53-mutantti, OCC1 ja A2780cp, p53-null, SKOV3) hiljennettiin kanssa rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 h) ennen käsittelyä CDDP (0-10 uM, 24 h). Rictor knock-down merkittävästi herkistyneet solunsalpaajaresistentti paino–p53-soluja (C13 * ja OVCAR433, Kuvio 5: A; P 0,001), mutta ei p53-vajaiden solujen (OCC1, Kuvio 6: A; A2780cp ja SKOV3, Kuva 5: B) CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia, mikä viittaa siihen, että toimiva p53, voidaan tarvita CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia solunsalpaajaresistentti OVCA solut rictor pudotus. Tutkia tätä hypoteesia, CDDP-resistenttejä OVCA solulinjojen kätkeminen p53-mutaatio (A2780cp) ja p53-null line (SKOV-3) käsiteltiin rictor siRNA (0-100 nM, 48 h), minkä jälkeen laimentamalla wt -p53 kautta adenovirusinfektio (0-10 MOI; 24 h) ja CDDP hoito (0-10 uM CDDP; 24 h). Kuten kuviossa 5 on esitetty: B, kun taas rictor pudotus yksinään ei lisännyt merkittävästi CDDP herkkyyttä ilman wt-p53, wt-p53 saattamisen merkittävästi parannettu vaikutuksia rictor-pudotus on CDDP: n aiheuttamaa fosfo-p53 Ser15 sisältöä ja apoptoosin molemmat p53-puutosta solulinjoista (P 0,001).

solunsalpaajaresistentti OVCA solulinjoja vaihtelevalla p53 status (wt-p53, C13 * ja OVCAR433, p53-mutantti, OCC1 ja A2780cp, p53-null, SKOV3) transfektoitiin rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 h) tai ilman adenoviruksen wt-p53-infektion (0-10 MOI, 24 h, p53-vajaiden solujen) ja CDDP hoito (0-10 uM CDDP; 24 h). Rictor, p-p53 ser15, p53, PARP ja GAPDH sisältöä, sekä apoptoosin arvioitiin. Rictor knock-down merkittävästi herkistyneet solunsalpaajaresistentti wt-p53-solujen (A, C13 * ja OVCAR433; P 0,001), mutta ei p53-difficient soluja (A, OCC1, B, A2780cp ja SKOV3) ja CDDP (10 uM) aiheuttama apoptoosin. Liuottaminen in A2780cp ja Skov-3 wt-p53 merkittävästi parannettu CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia (P 0,001). Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs vastaaviin CTL siRNA), # # # p 0,05 (vs ohjaa adenovirusinfektio). Hoechst 33258 värjäys arviointiin käytetään apoptoosin mainittu koetoimenpiteet.

solunsalpaajaresistentti OVCA soluja (C13 *) transfektoitiin rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 h) ja esikäsitelty epoxomycin (0 -12,5 nM) 30 minuuttia ennen CDDP-hoidon (0-10 uM CDDP; 24 h). Rictor, Akt, fosforia Akt (Thr450 ja Ser473), ja GAPDH sisältöä sekä apoptoosin arvioitiin. Rictor knock-down merkittävästi parannettu CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia solunsalpaajaresistentti OVCA soluissa (P 0,01 ja P 0,001, vastaavasti) ja tämän vaikutuksen pelastettiin epoxomycin (P 0,05 ja p 0,001, vastaavasti) Total-Akt pieneni merkitsevästi aikana rictor hiljentämiselle CDDP hoitoa (P 0,05) ja massiivinen kasvu suhde fosfo-Akt (Ser473) ja koko-Akt havaittiin myös, mikä laski merkittävästi, kun epoxomycin lisättiin (P 0,001 ja P 0,05, vastaavasti) tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 (vs vastaaviin CTL siRNA), # # p 0,01, # # # p 0,05 (vs ilman epoxomycin). Hoechst 33258 värjäys arviointiin käytetään apoptoosin mainittu koetoimenpiteet.

Rictor alassäätöä herkistää solunsalpaajaresistentti solujen CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia helpottamalla Akt proteasomaalisten hajoamista

Rictor on tiedossa jotka vaaditaan mTORC2 fosfory- Akt at Ser473. Sen tutkimiseksi, jos ja kuinka Akt on merkitystä tämän ilmiön solunsalpaajaresistentti OVCA soluja (C13 *) rictor ilmentyminen vaiennetaan siRNA (100 nM; 48 h) ennen esikäsittelyä epoxomycin (12,5 nM; 30 min) ja hoito CDDP (10 uM; 24 h), ja apoptoosi arvioitiin. Rictor Knockdown yksin lisääntynyt fosfo-Akt (Ser473) sisältöä, mutta laski tasot fosfo-Akt Ser450 [Kuva 6], joka on fosforylaatiokohdan tiedetään säänneltävä Akt vakaus [18]. Kasvu Akt fosforylaation Ser473 seuraavat rictor hiljentäminen ilman proteasomaalisten estäjää mukana oli Akt alassäätöä (P 0,05 vuonna hoitoryhmässä) ja pelastettiin proteasomaalisten estäjän (p 0,05). Apoptoosin riippumatta siitä, CDDP: n, kaksi ratkaisua vaimennettu läsnäolo proteasomin inhibiittoria epoxomycin (kuvio 6; P 0,05 ja P 0,001 valvonta- ja CDDP ryhmissä vastaavasti). Lisäksi suhde fosfo-Akt at Ser473 ja yhteensä Akt myös merkittävästi lisääntynyt rictor Knockdown kanssa CDDP-hoitoa ja laski merkittävästi, kun epoxomicin lisättiin (P 0,001 ja p 0,05, kanssa ja ilman epoxomycin, vastaavasti). Nämä tulokset viittaavat siihen, että rictor on rooli Akt vakauttamiseen ja CDDP resistenssin ihmisen OVCA ja sen knockdown edistää Akt proteasomaalisten hajoamista ja parantaa CDDP herkkyyttä.

Keskustelu

Chemoresistance on suuri terapeuttinen este munasarjan syöpä ja sen solujen mekanismi on monimutkainen ja huonosti. Vaikka mTOR signalointireitin tiedetään edistävät solujen proliferaatiota ja eloonjäämistä, onko rictor osallistuu valvontaan kemosensitiivisyys ei tunneta. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet roolia rictor in CDDP vastus käyttäen CDDP-herkkiä ja resistenttejä OVCA solulinjoissa erilaisilla, p53 status. Olemme osoittaneet ensimmäisen kerran, että rictor on määräävä CDDP resistenssin OVCA. CDDP down-regulation rictor sisällön chemosensitive soluissa kaspaasi-3 ja proteasomin riippuvaa hajoamista, mutta ei samanlainen vaikutus havaittiin resistentit solut. Lisäksi olemme osoittaneet, että rictor estää CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia ja antaa resistenssin aktivoimalla ja vakauttaa Akt. Hiljentäminen rictor herkistää solunsalpaajaresistentti OVCA solujen CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia -solut villityypin p53: n, mutta ei p53-vaarantunut soluissa, ellei käyttövalmiiksi toimiva p53. Yhdessä nämä tiedot tukevat hypoteesia, että rictor alassäätöä herkistää solunsalpaajaresistentti OVCA solujen CDDP hoitoon helpottamalla Akt-riippuvaisen proteasomaalisten hajoamista, tavalla riippuvainen p53 tila.

Tämä tutkimus osoittaa, että rictor on alhaalla -regulated on proteiini, mutta ei mRNA: n taso (tuloksia ei ole esitetty), ja tämä prosessi liittyy CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia herkissä OVCA soluille ja että rictor on rooli solun kohtalon määrittämiseen. Tämä havainto on edelleen tuettu tuloksia käyttäen erilaisia ​​solunsalpaajaresistentti OVCA solulinjoissa erilaisilla p53 asema, että epäonnistuminen CDDP alas-säädellä rictor sisältö mahdollistaa solujen hengissä CDDP hoitoon. Rooli rictor solun eloonjääminen on aiemmin osoittanut, ja yhdessä tutkimuksessa on osoitettu käsitystä, että rictor ja proteiinien mTOR polku ovat alassäädetty kautta proteasomireitillä-ubikitiinipromoottori väylän keuhkosyöpäsoluissa jälkeen kemoterapeuttisten haaste, mahdollinen osallistuminen rictor käsittely valvonnassa kemosensitiivisyys ei käsitelty [26]. Tuloksemme osoittavat, että CDDP indusoi rictor alassäätöä kautta proteasomin ovat yhtä mieltä tätä päätelmää. Lisäksi meidän hetkellä tutkimukset ovat laajentaneet edellä havainnot osoittavat, että kaspaasi-3 tarvitaan CDDP aiheuttama rictor käsittely chemosensitive ihmisen OVCA soluja. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että rictor antaa CDDP resistenssin ihmisen OVCA ja CDDP: n aiheuttamaa rictor alassäätöä riippuu sekä kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja proteasomaalisten hajoamista chemosensitive, mutta ei solunsalpaajaresistentti OVCA solulinjoissa.

tuumorisuppressori

TP53

on myös yksi useimmin mutatoitunut geenien ihmisen OVCA, ja se voi olla niinkin korkea kuin 50% OVCA potilaista [41]. Menetys tai mutaatio p53 voi olla valtava vaikutus kasvaimen aggressiivisuus, ennustetta ja menestyksekäs toteuduttava hoidon [42]. Koska mekanismi CDDP-vastus on monitekijäinen ja p53 tila on yksi tärkeimmistä huolenaiheista ihmisen OVCA, olemme tutkineet suhdetta rictor ja tuumorisuppressori p53, että näkökohta chemoresistance. Tutkintamme siis edelleen osoitteet roolia rictor vuonna CDDP vastuksen ja osoittaa, että rictor Knockdown edistää paitsi apoptoosin, mutta myös parantaa CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia ihmisen OVCA soluissa. Tämä tulos korreloi tuoreessa tutkimuksessa osoittaa, että kohdentaminen rictor ehkäisee solujen vaeltamiseen ja edistää apoptoosin rintasyövän [23]. Tulokset nykyisessä tutkimuksessa osoittavat myös, että herkistävä solunsalpaajaresistentti OVCA solujen hiljentämällä rictor näyttää riippuvan p53 tila. Tätä ajatusta tukee lisäksi se havainto, että yhdistelmä rictor knockdown ja käyttökuntoon wt-p53 tehostaa apoptoosia p53-vaarantua soluja aiheuttama CDDP hoito, lopputulos, joka ei eventuate ilman wt-p53. Jälkimmäinen vaste on samanaikaisesti kasvun kanssa p53 aktivaation kautta fosforylaation on ser15 jäännös, joka muuttuu p53 rakenne ja estää p53-MDM2, mikä vakauttaa p53 [35]. Tämä voi olla syynä p53 vakauttamiseen havaittiin A2780cp ja SKOV-3: n läsnä ollessa fosfo- p53 (ser15). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että rictor Knockdown indusoi apoptoosia ja parantaa CDDP: n aiheuttamaa apoptoosia p53-riippuvainen tavalla.

Akt signalointireitin on määräävä chemoresistance ja sen aktivointi edistää solunsalpaajaresistentti fenotyyppi, usein havaittu jopa 87% tapauksista ihmisen OVCA [10].