Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti ja jäännökset yleisin. Vuorovaikutus PI3K /AMPK /AKT ja MAPK polkuja on ratkaiseva efektori keuhkojen syövän kasvua ja etenemistä. Nämä signaalit transduktio proteiinikinaaseja hyvinä terapeuttisina kohteina ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka käsittää jopa 90% keuhkosyövässä. Täällä kuvataan onko 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), aktiivinen triterpenoidisaponiineja johdannainen

Poncirus trifoliate

, voi näyttää syövän vastaisia ​​ominaisuuksia säätelemällä nämä signaalit ja moduloivat esiintyminen monilääkeresistenttisyyden in NSCLC soluissa. Olemme havainneet, että 21α-MMD esti kasvun ja pesäkkeiden muodostuminen keuhkosyövän soluja vaikuttamatta normaalin keuhkokudoksen solun fenotyyppi. 21α-MMD myös kumosi metastaattisen aktiivisuuden keuhkosyöpään solujen kautta estämällä Solujen migraation ja invaasion ja indusoi G

0 /G

1 solukierron pysähtymisen lisääntynyt solunsisäinen ROS sukupolvi ja mitokondrion kalvon eheyden. 21α-MMD säännelty ilmaukset PI3K /AKT /AMPK ja MAPK signalointia, joka ajoi meidät edelleen arvioimaan toimintansa moniresistenssin (MDR) keuhkojen syöpäsoluja määrittämällä P-glykoproteiinin (P-gp) /MDR1-yhdistys. Käyttäen perustettu paklitakseli-resistenttejä A549 (A549-PacR), me edelleen havaittu, että 21α-MMD indusoi MDR kääntyminen toimintaa läpi estämällä P-gp /MDR1 ilmaisuja, funktio, ja transkriptio kanssa takaisin paklitakselin herkkyys joka saattaa riippuvaisesti korreloi sääntely PI3K /mTOR signalointireitille. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että ensimmäistä kertaa, mekanistinen arviointi

in vitro

of 21α-MMD näyttämällä kasvua estävää potentiaali vaikutus MDR kääntyminen ihmisen keuhkojen syöpäsoluja.

Citation : Aldonza MBD, Hong JY, Bae SY, Song J, Kim WK, Voi J, et al. (2015) Suppression MAPK Signaling ja peruutukset mTOR-Dependent MDR1-Associated monilääkeaineresistenssin by 21α-Methylmelianodiol in Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (6): e0127841. doi: 10,1371 /journal.pone.0127841

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 28 elokuu 2014; Hyväksytty: 21 huhtikuu 2015; Julkaistu: 22 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Aldonza et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat apurahan (2005 ja 12172MFDS989) alkaen ministeriön Food and Drug Safety ja National Research Foundation of Korea (NRF) se rahoitettiin Korean hallitus (MEST) (nro 2009-0083533).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä maailmanlaajuisesti vuosikymmeniä, ja sen osuus on noin 1,38 miljoonaa kuolemantapausta vuodessa sekä miesten ja naisten pelkästään Yhdysvalloissa. Ennuste liittyvä sairaus on erittäin huono viivyttää diagnoosin myöhään vaiheissa ja hoitovaihtoehdot ovat rajalliset, jolloin lähes 90% kuolleisuus johtuen hoidon aiheuttama havaitsematta etäpesäkkeiden eteneminen [1]. Luonnontuotteita on käytetty lääketieteen terapeuttisina vuosisatojen peräti 70% kaikista hyväksyttyjen lääkkeiden kliinisiä kemoterapia sekä keuhkosyövän hoidossa vuosina 1981 ja 2002, jotka ovat joko luonnontuotteita tai kemialliset ja synteettiset johdannaiset perustuvat luonnontuotteita. [2]. Kuitenkin mekanismi, jolla useimmat luonnolliset tuotteet osoittavat niiden terapeuttista potentiaalia ymmärretä hyvin. Triterpenoideja ovat ottaen yhä enemmän huomiota viime aikoina on keuhkosyöpä terapeuttisia koska niiden raportoitu chemopreventive ja terapeuttisia käyttömahdollisuuksia sekä

in vitro

ja

in vivo

[3,4]. 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD) on luonnollinen triterpenoidi ja isomeeri 21-methylmelianodiols eristetään ensin hedelmistä

Poncirus trifoliata

(Ruutakasvit), joka on pitkään käytetty itämaisen lääketieteen kuin korjata allerginen tulehdus. Viime raporteissa, 21α-MMD näytetään toiminnalliset anti-inflammatoristen [5]. Kuitenkin ei ole raportin edelleen arvioimalla sen syövän vastaista potentiaalia ja vaikutusmekanismi keuhkosyövässä.

Cancer säilymiseen liittyviä signalointireittejä, kuten fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) /AKT /nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR ) ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) ja syövän etäpesäkkeiden liittyvä AMPK väyliä pelata keskeisiä rooleja säätelyssä lääkkeen aiheuttamista funktionaalisia toimintoja, kuten DNA-vaurioita indusoiman apoptoosin, solukasvuneston, ja antimetastaattisia /etenemisen apuohjelmia [6 , 7], jossa lausutaan ratkaiseva toiminnallinen sääntely aktiivisuutta keuhkosyövän solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [8]. Tarkka molekyylitason mekanismeja vastuussa useimpien triterpenoid aiheuttaman syövän vastaista toimintaa, joissa nämä klassisen reittejä ei ole vielä selvitetty yksityiskohtaisesti edelleen sisällyttää hoitostrategioita parantaa tuloksia.

Toinen keskeinen syy hoidon epäonnistuminen keuhkosyöpä on esiintyminen monilääkeresistenssin (MDR), pääasiallinen mekanismi, jonka avulla monet syövät tullut vastustuskykyisiä laaja kemoterapeuttisten. PI3K /AKT ja MAPK signalointi ovat olleet laajasti mukana kehittämisessä MDR keuhkosyövässä. Stimulaatio näistä reiteistä tekee keuhko- kasvainsolujen resistenttejä kemoterapeuttisia lääkkeitä, kuten paklitakseli, edelleen vaikuttaa solujen toimintaa [9,10]. Herkkyys eri kemoterapeuttisia vaihtelee suuresti eri potilailla. Kuitenkin yksi molekyyli mekanismi voidaan todeta tehokkaasti suunnitella syyt kemoterapeuttiset yhdistelmä hoitoja, joka on kohdistamalla MDR1 (ABCB1) geenin koodaama P-glykoproteiinin (P-gp), joka vastaa pumppaamaan erilaisia ​​vierasaineiden ja endogeenisen aineita sisältä solunulkoiseen alueeseen soluihin [11]. Viimeaikaiset todisteet ovat korostaneet vuorovaikutusta mTOR signalointi ja P-gp /MDR1 välittämää MDR in maksasolukarsinoomat ja peräsuolen syövän [12,13]. Tällaiset yhdistykset ovat johtaneet toiminnallisesti luonnehtia potentiaali sääntelymekanismiin kohdentaa PI3K /AKT ja MAPK-reitin ja myöhemmät arvonalentumiset P-gp aktiivisuus [14,15]. Lisäksi useat tutkimukset ovat myös ehdottaneet kehittämään lääkkeitä perustuu peräisin flavonoideja ja triterpenoids jotka voivat kohdistaa nämä signaalit myöhemmin muodostavat luokan P-gp: n estäjien ja aktiivisuuden lisäämiseksi useat syöpälääkkeet, kuten paklitakseli ja doksorubisiini [16 -18].

tässä tutkimuksessa oli siis mekaanisesti tunnistaa vaikutustapa 21α-MMD ihmisen NSCLC-solujen ja edelleen liittyä sen sääntelymekanismiin solun kasvuun ja eloonjääminen liittyvien signaalien, kuten PI3K /AKT /AMPK ja MAPK P-gp /MDR1 liittyvien MDR esiintyminen on keuhkosyöpä fenotyyppi. Luonnehdinta toimintamekanismit 21α-MMD voi johtaa uusia oivalluksia terapeuttisen kehityksen torjumiseksi kasvua, metastaattisen aktiivisuuden sekä esiintyminen MDR ihmisen keuhkosyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

trikloorietikkahappo (TCA), (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), sulforodamiini B (SRB), propidiumjodidi (PI ), RNaasi A, paklitakseli, 5-fluorourasiili (5-FU), hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine, dikloori-dihydro-fluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA), rodamiini-123, kristallivioletti, N-asetyyli-L- kysteiini (NAC), ja muita reagensseja, ellei toisin mainita ostettiin Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA). RPMI 1640-väliaine, naudan sikiön seerumia (FBS), antibiootti-antimykoottiliuoksella, ja trypsiini-EDTA ostettiin Invitrogen (Grand Island, NY, USA). hiiren monoklonaalinen anti-fosfo-ERK (Tyr 204), anti-c-myc, ja kanin polyklonaalista anti-sykliini A, anti-sykliini B1, anti-sykliini E, anti -CDK2, anti-CDK4, anti-Rb ja anti-fosfo-Rb, anti-ERK 1/2, anti-p38 MAPK, anti-fosfo Akt, anti-Akt, anti-fosfo-mTOR, anti-mTOR ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Hiiren monoklonaalinen anti-fosfo-JNK /SAPK (Thr 183 /Tyr 185), anti-JNK /SAPK, anti-fosfo-p38 (Thr 180 /Tyr 182), anti-AMPK, anti-fosfo-AMPKα (Thr 172), anti-PI3K, ja anti-fosfo-PI3K p85 (Tyr 458) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Alexa Fluor 488-leimattua kanan anti-kani-IgG hankittiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Hiiren monoklonaalinen anti-P-gp: n ja fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -leimattua monoklonaalinen anti-P-gp hankittiin Abcam (Cambridge, MA, USA). Kationinen lipofiilinen väriaine tetra- etyyliesteri (TMRE) hankittiin Molecular Probes (OR, USA). ON-TARGETplusTM (SMARTpool) mTOR ja ryntäily siRNA ostettiin Thermo Scientific-Dharmacon RNAi Technologies (Suwanee, GA, USA). Koeyhdistettä, 21α-MMD, eristettiin hedelmistä

Poncirus trifoliata

kuten aikaisemmin on kuvattu [19] ja toimitti tri S.H. Lee, mukana kirjoittamassa, College of Pharmacy, Yeungnam University, Korea.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen keuhkosyöpä (A549, H460, H1299 H358 ja H292) ihmisen normaali keuhkojen solut (L132 ja MRC-5), ihmisen rinta- syöpäsolujen (MDA-MB-231), ihmisen tiehyen rintojen epiteelikasvainsolut (T47D), ihmisen maksan syöpäsoluja (SK-HEP-1), ja ihmisen mahalaukun syöpäsolut (SNU-638) toimittivat Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Paklitakseli-resistenttejä A549 (A549-PacR) kehitettiin ryhmämme vanhempien A549 läpi jatkuva altistuminen asteittain kasvavia pitoisuuksia paklitakselin ylläpitää jatkuvan kasvun ja hieno vanhempien kaltainen morfologia [20]. Soluja viljeltiin DMEM: ssä (MRC-5, MDA-MB-231, ja SK-HEP-1-solujen) ja RPMI-1640 (A549, A549-PacR, H358, H1299, H460, H292, T47D, ja SNU -638 solua), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää ja antibiootteja-antimykootteja (PSF, 100 yksikköä /ml G-penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja 250 ng /ml amfoterisiini B: tä). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa kosteutetussa ilmakehässä.

soluproliferaatiomääritykset

soluproliferaatiota arvioitiin käyttäen MTT-kolorimetristä määritystä lukuun ottamatta alustavan seulonnan anti-proliferatiivista aktiivisuutta

P

.

trifoliata

aktiivisia yhdisteitä, jotka suoritettiin SRB-määrityksellä. Solut ympättiin tiheydellä 3-5 x 10

4 solua per kuoppa 96-kuoppaisille levyille, joissa on yhteensä 200 ul /kuoppa ja annettiin kiinnitä yön yli. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla 21α-MMD, H

2O

2, huumeet, yksittäisinä tai yhdistelmänä, tai DMSO-kontrollin jatkuvasti ilmoitettuina ajankohtina kursseja. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin 10% TCA-liuosta ja tehtiin varten SRB tai MTT määrityksissä. MTT-määritys, soluja inkuboitiin MTT: tä (0,5 mg /ml), joka sisälsi viljelyalustaa 37 ° C: ssa 4 tuntia. Supernatantti elatusaine poistettiin ja DMSO (200 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sekoitettiin täysin liueta MTT. Sillä SRB-määritys, soluja inkuboitiin 0,4% SRB liuosta 30 min. Sitoutumattoman SRB poistettiin nopeasti pesemällä kuopat viisi kertaa 1% etikkahapolla, ja sitten kuivattiin ilmassa. 100 ui Tris-puskuria (0,01 M, pH 10,4) lisättiin ja ravisteltiin varovasti 5 minuuttia mekaanisella ravistelijalla. Absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä MTT-määritys, kun 515 nm: SRB-määritystä yhteinen tausta vähennyslasku 650 nm (nolla päivä tai jäljitellä ohjaus) mukaan Versamax mikrolevynlukijalla (Molecular Devices Inc., Toronto, Kanada). Absorbanssiarvot ilmaistiin prosenttiosuutena, että käsittelemättömän tai DMSO-kontrollin soluissa, ja konsentraatio testattiin lääkkeitä, jotka on laskettu kaavalla% elinkelpoisuuden = ((Ave. Abs.Drug-Ave.Abs.Zero päivä) /(Ave. Abs.Control-Ave. Abs.Zero Day)) x 100. IC

50-arvot laskettiin lääke, joka estää soluproliferaatiota 50% verrattuna kontrolleihin käyttämällä ei-lineaarista regressioanalyysiä (eloonjäämisprosentteina vs. pitoisuus) . Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen neljää rinnakkaisnäytettä ja toistettiin vähintään kolme kertaa rinnan, joka lääke /yhdisteen pitoisuus.

Colony muodostumisen määritys

Yksisolukerroksiset-soluja käsiteltiin 20 h 21α- MMD eri pitoisuuksina, ja sitten korjataan, laskettiin ja ympättiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 1500 solua per kuoppa. Sen jälkeen, kun yksi yhteen ja puoli viikkoa, kiinnittyneet makroskooppisia pesäkkeet pestiin PBS: llä, kiinteä käyttäen 2% paraformaldehydillä ja värjättiin kristallivioletilla (0,5% w /v), ja sitten lasketaan visuaalisesti tai käyttämällä Image J ohjelmisto.

Drug Yhdistelmä Analyysi

solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille kasvavien pitoisuuksien kanssa 21α-MMD, paklitakseli, ja 5-FU joko yksinään tai yhdistelmä niiden ekvipotentissa moolisuhteessa samanaikaisesti. Kasvua estävä aktiivisuus yhdistelmien mitattiin MTT-määrityksellä. Yhdistetyt vaikutukset analysoitiin mediaanivaikutusyhtälöstä analyysimenetelmä ja laskemalla yhdistelmän indeksi (CI) kaavalla: CI = D

1 /(D

x)

1 + D

2 /(D

x)

2, jossa D

1 ja D

2 ovat pitoisuuksia yhdistetyn yhdisteen ja huume, joka saavutti odotettua vaikutusta, ja (D

x)

1 ja (D

x)

2 ovat pitoisuuksia, jotka saavuttaa samanlaisia ​​vaikutuksia, kun yhdisteitä käytetään yksin. 50%: n esto on valittu indikaattori tehoa. Lasketusta CI verrattiin sitten raportoitu viitearvoja [21].

Cell Cycle Analysis ja BrdU

analyysi vaikutuksista 21α-MMD solusyklin jakelu suoritettiin menetelmällä aikaisemmin kuvatulla tavalla [22]. Soluja käsiteltiin tai ei 21α-MMD 24 h 10% FBS: ää täydennetyssä väliaineessa. Solut kerättiin, pestiin kahdesti, ja kiinnitettiin 70% kylmällä etanolilla yön yli -20 ° C. Etanoli-kiinteä-solut pelletoitiin, pestiin jääkylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen värjäystä, joka sisälsi 50 ug /ml PI, 0,1% Triton-X-100, 0,1% natriumsitraattia, ja 100 ug /ml RNaasi. Kun oli kulunut 1 h inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa pimeässä, fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajiteltiin ja solun DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen FACSCalibur-virtaussytometriä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), joka on varustettu argon laser ja tiedot arvioitiin käyttäen CellQuest- 3.0.1 ohjelmistoa (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Ainakin 20000 soluja käytettiin jokaista analyysia. Muutokset solujen prosentuaalinen määrä jakauma kunkin vaiheen solusyklin määritettiin ja tulokset näytetään histogrammit. Solujen osuus eri vaiheissa solusyklin sitten tallennettu ainakin kolmena kappaleena, ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Lisäksi, joka on colometric BrdU (Abcam) suoritettiin mitata DNA-synteesin nopeus. Lyhyesti, soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 21α-MMD 24 tuntia samassa väliaineessa kuin edellä. BrdU lisätään viljeltyjen solujen mikrotiitterilevyillä, mitä seurasi 4 tunnin inkuboinnin sisällyttää BrdU DNA: han lisääntyvien solujen. Culture Supernatantti poistettiin seurasi kiinnitys. Sitten soluja inkuboitiin anti-BrdU-vasta-ainetta konjugoituna peroksidaasiin. Sitoutunut BrdU havaitaan substraatin reaktiolla ja kvantifioidaan absorbanssilla mittaus 350 nm: ssä.

mittaus Solunsisäinen ROS

Solunsisäinen ROS mitattiin virtaussytometrialla (Becton Dickinson, FACSCalibur) kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],23]. Lyhyesti, solut siirrostettiin tiheyteen 1 x 10

4 solua /ml steriilissä 60 mm malja 24 tuntia ja käsiteltiin kanssa tai ilman 21α-MMD 24 tuntia havaita ROS muuttuu. Solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa ja värjättiin 1 ml DCFH-DA 10 uM, jota käytettiin koettimena arvioida ROS. Sitten soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 40 minuuttia ja huippu virityksen aallonpituus hapetetaan DCFH-DA: 488 nm, emissio 525 nm: ssä analysoitiin virtaussytometrialla. ROS tuotanto ilmaistiin fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) lasketaan läpi Cell Quest ohjelmisto. Detection of ROS tutkittiin myös fluoresenssimikroskopialla. Lyhyesti, soluja ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /ml peitinlaseja ruokia ja inkuboitiin yön yli kiinnitys. Sitten soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla 21α-MMD tai NAC, yksittäin tai yhdistelmänä, 24 tuntia 37 ° C. Pääliliuskat poistettiin astioista ja solut värjättiin 40 uM DCFH-DA 40 min. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ylimääräisen väriaineen poistamiseksi. Pääliliuskat asetettiin lasilevyille ja kuvat otettiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia klo 200X suurennuksella.

mittaus mitokondrio Transmembraaniaktivaattori Potential (Δѱm) B

Muutokset mitokondrioiden potentiaalia arvioitiin käyttäen fluoresoivaa potentiometrisillä väriaine TMRE. Kationinen lipofiilinen väriaine TMRE toimii syöttämällä solun esterin muodossa, joka on sen jälkeen hydrolysoidaan ja muutetaan tetrametyylirodamiini, joka on palautuvasti kertynyt negatiivisesti varautuneita mitokondrioiden matriisi riippuen mitokondrion transmembraanisen potentiaalin jolla mahdolliset riippuvainen kertyminen mitokondrioissa. Analysoida Δѱm jälkeen 21α-MMD hoidon soluja kasvu tiheydellä 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti 24 tuntia 24-kuoppaisille steriili kulttuuri levylle käsitelty tai ilman 25 uM 21α-MMD 24 h. Kaksikymmentä minuuttia ennen loppua inkubaation jälkeen solut pestiin PBS: llä ja TMRE väriaineen 100 nM ladattiin 10 min 37 ° C. Solut trypsinoitiin ja kerättiin kylmällä PBS: llä, minkä jälkeen mittaus fluoresenssin intensiteetti virtaussytometrialla (Becton Dickinson, FACSCalibur) ja analysoitiin käyttäen CellQuest-3.0.1-ohjelmisto.

Cell Migration and Invasion Analyysit

muutokset solujen vaeltamiseen määritettiin ja siirtokuoppaan määrityksiä ilman sisällyttäminen Matrigel. Muuttoliikettä siirtokuoppaan määritystä, solut ympättiin yläkammiot 24 transwell levyt 200 ui väliaineessa ilman seerumia (ilman FBS). Hoidon jälkeen erilaisilla aineilla, solut vasemmalle ylitöitä siirtyä alakammioissa sisälsi 800 ui elatusainetta 10% FBS aiheuttavan kemotaksista. Siirtyneet solut visualisoitiin värjäämällä kristallivioletilla (0,5% w /v) pesun jälkeen PBS: llä, ja kiinnitys metanolilla. Kuvat otettiin ja analysoitiin Juli FL mikroskooppia tuetun Image J ohjelmisto. Soluinvaasiota analyysi suoritettiin 24 kuopan transwell levyt polykarbonaattia (PVDF) suodattimet (8 um huokoskoko, Corning, USA). Matrigel laimennettiin 1 mg /ml seerumittomalla viljelyalusta ja levitetään insertin ylemmässä kammioihin monisyvennyslevyjen varten invaasiomääritys levy. Soluja tiheydellä 2 x 10

4 solua kuoppaa kohti ympättiin ylempään kammioon transwell yksikön 200 ui seerumittomassa elatusaineessa. Alempaan kammioon yksikön lisättiin 800 ui elatusaineeseen, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja kemotaksista induktion. Inkuboinnin jälkeen tai ilman 21α-MMD (5 uM; IC

50) 24 tunnin ajan 37 ° C, väliaine ylemmässä kammiossa oli imetty, ja pumpulipuikolla käytettiin solujen poistamiseksi yläpuolen kalvon. Solut, jotka tunkeutuivat alapuolelle kalvon värjättiin kristallivioletilla (0,5% w /v) ja visualisoitiin ja teki alle Juli FL mikroskoopilla. Kaikki tulokset ilmaistaan ​​prosentin siirtynyt tai tunkeutuu soluihin verrattuna kontrolliin (käsittelemättömät solut).

rodamiini-123 (Rho-123) kertyminen Pitoisuus

Muutokset ulosvirtausta funktiona P-gp: A549-PacR solut määritettiin rinnakkain muutoksia kertyminen Rho-123 väriaine. Solut ympättiin 30 mm: n maljoille tiheydellä 1 x 10

5 solua per malja. Solut esikäsiteltiin eri pitoisuuksien 21α-MMD 24 ja 48 tuntia. 0,5% DMSO: ta käytettiin kontrollina. Esikäsittelyn jälkeen, soluja inkuboitiin 1 ug /ml Rho-123 väriaine kasvatusväliaineeseen 37 ° C ja 5% CO

2 pimeässä 90 min. Jälkeen Rho-123 kertymistä, solut trypsinoitiin päässä subkonfluenteista yksisolukerroksen solujen viljelymaljoihin, ja solupelletti pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Sitten solut analysoitiin välittömästi käyttämällä FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), joka oli varustettu 488 nm: n argonlaserilla. Pitoisuus Rho-123 kussakin näytteessä määritettiin fluoresenssin mittaukset rakentaminen Rho-123 standardikäyrää. Pitoisuus solunsisäisen Rho-123 normalisoitiin proteiinin määrä ja ilmaistaan ​​nmol /g proteiinia. Vihreä fluoresenssi Rho-123 mitattiin käyttäen 530 nm: n kaistanpäästösuodattimen [24]. Ulosvirtausta toiminta P-gp seurattiin kannalta väheneminen viennin Rho-123 kanssa sisällyttämällä vanhempien A549-solut käytettiin negatiivisena kontrollina.

Immunosytokemia

P-gp lokalisointi, immunofluoresenssimenetelmällä, ja DNA loisteputki havainto A549 /A549-PacR soluja havaittiin käyttäen Zeiss LSM 780 ApoTome mikroskooppi (Carl Zeiss, Jena, Saksa). A549 /A549-PacR solut maljattiin 30 mm ruokia dioja ja inkuboitiin yön yli. Solut esikäsitellään eri pitoisuuksilla 21α-MMD tai huumeiden väliaineessa 48 tuntia. Kaikki pesut tehtiin PBS: llä ja kaikki inkuboinnit valmistui huoneenlämmössä ellei toisin mainita. Solut pestiin kaksi kertaa. Käsittelyn jälkeen inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PBS: ssä) 15 minuutin ajan ja salvattiin sitten 1% BSA: ta (PBS: ssä) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, solut inkuboitiin P-glykoproteiinin primaarinen vasta-aine 4 ° C yön yli, pestään sitten vielä kaksi kertaa. Läpäiseväksi, jossa Triton X-100 ei sisällytetty, koska kohdeproteiiniin, P-gp, on transmembraaniproteiini. Sen jälkeen kun oli inkuboitu yli yön, soluja inkuboitiin FITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 2 tuntia huoneenlämpötilassa. DAPI (0,5 ug /ml) käytettiin vastavärjäämiseksi ytimet ja säilytettiin 4 ° C: ssa ennen mikroskopialla.

Protein lysaatit, Western blotting ja immunosaostus

Solut ympättiin steriileihin 100 mm astiat 24 tai 48 h ja altistettiin eri pitoisuuksia 21α-MMD. Voit selvittää tasot kohdeproteiinin ilmauksia, koko solun uutteet valmistettiin. Käsitelty tai ei-käsitelty solut hajotettiin ja proteiinin kvantitatiivinen määritettiin käyttämällä Bradford-määritystä [25]. Proteiinit eristettiin lyysipuskuria (Beyotime, Kiina) [20 mmol /l Tris (pH 7,4), 250 nmol /l NaCl, 2 mmol /l EDTA: a (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, 0,01 ug /ml aprotiniinia , 0,005 ug /ml leupeptiiniä, 0,4 mol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, ja 4 mmol /l NAvó

4] seuraa kehruu lysaatit 14000 rpm: ssä 10 min käyttäen Thermo Sorvali Legend Micro 21R Jäähdytetty Sentrifugoidaan (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) liukenemattoman materiaalin poistamiseksi ja mitata käyttämällä Nanodrop 1000 Spektrofotometri (Thermo, USA). Solut hajotettiin sonikoimalla ja uutetaan 4 ° C: ssa 30 minuuttia. Homogenaatteja sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 30 min poistamiseksi mitokondrioita ja muut liukenemattomat fragmentit ja Sitten supernatantit sentrifugoitiin uudelleen kuten edellä, jolloin varmistetaan täydellinen poistaminen mitokondrioita. Supernatantit kokosolulysaateista kerättiin ja pidettiin -80ºC. Proteiinin kokonaismäärän (100 ug), kussakin solussa lysaattia ratkaistu eri prosenttiosuudet geelien sovitettu molekyylipainot proteiinin tavoitteet natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja sen elektro-siirrettiin PVDF nitroselluloosakalvoille. Membraanit inkuboitiin estopuskurilla (5% rasvatonta kuivamaitoa fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa 0,1% Tween 20, PBST, pH 8,0) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin edelleen spesifisiä vasta-aineita laimennettiin TBST yön yli 4 ° C . Kun oli pesty TBST: llä kolme kertaa, kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarisia vasta-aineita 1 tunti huoneen lämpötilassa. Visualisointi immunokompleksien suoritettiin käyttäen PowerOpti-ECL-kit (Animal Genetics Inc., Korea) ja LAS 4000 Imager (Fuji Film Corp., Tokio, Japani).

RNA ja Real-Time Käänteinen transkriptio-PCR

RT-PCR ja reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin arvioimaan MDR1 mRNA, sykliini E ja CDK2: n mRNA: n geeniekspressioiden hoidon jälkeen tai ilman 21α-MMD tai siRNA kuten on osoitettu. Solut tiheydellä 1 x 10

5 solua /malja 100 mm ruokia hoidettiin 21α-MMD eri ajanjaksoista. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja sitten ne lyysattiin TRI-reagenssia alkuperäisessä RNA eristettiin vaiheessa. RNA uutettiin lisäämällä kloroformia, ja eristettyjä RNA saostettiin isopropyylialkoholilla. RNA-pelletit pestiin 70% etanolilla, ilmakuivattiin ja liuotettiin sitten nukleaasitonta vettä. Absorbanssi mitattiin 260 ja 280 nm: ssä määrittämiseksi pitoisuuden ja puhtauden RNA. Kokonais-RNA (1-2 ug), käänteiskopioitiin käyttäen AMV-käänteistranskriptaasia ja oligo (dT) 15-aluketta. Polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin reaktioseoksessa, joka sisältää cDNA: ta, 0,2 mM dNTP: tä seokseen, 10 pmol kohde-spesifisiä alukkeita, joiden sekvenssit on lueteltu seuraavasti: MDR1 (eteenpäin: 5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′, käänteinen: 5′ -GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′), mTOR (eteenpäin: 5′-ACTCGCTTCTATGACCAACTGA-3′; käänteinen: 5′-TTGAAGGTCTCAAACATGAT-3′), sykliini E (eteenpäin: 5′-CGGGTCCACAGGATGCGAAGGA-3′; käänteinen: 5′-CAGGTGTGGGGATCAGGGAGCA- 3′), CDK2 (eteenpäin: 5′-CATTCCTCTTCCCCTCATCA-3′, käänteinen: 5′-CAGGGACTCCAAAAGCTCTG-3′), ja 0,25 U Taq-DNA-polymeraasia käyttäen GeneAmp PCR -järjestelmää 2400 (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) vahvistavat cDNA. Kynnys (Ct) arvot määritettiin. Suhteellinen mRNA ekspressiotasot normalisoituivat joko β-aktiini (eteenpäin: 5′-AGGCACCAGGGCGTGAT-3′; käänteinen: 5′-GCCCACATAGGAATCCTTCTGAC-3′) tai GAPDH (eteenpäin: 5′-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3′; käänteinen: 5′ -CCATCACGCCACAGTTTCC-3 ’), kuten, jakamalla se keskimääräinen Ct-arvoja sisäisen valvonnan että näyte (Δ-Ct). Normalisoitu transkriptitasot ilmaistiin suhteessa näytteen saatu DMSO-kontrollin (ΔΔ – Ct), ja suhteellinen RNA-ilmentymisen taso on esitetty 2-Δ-Ct [26]. PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeelielektroforeesilla. Geeli värjättiin 10000-kertaisesti laimennettu SYBR turvallinen Värjäysliuos ja näkyviksi UV transilluminaattoria (Alpha ImagerYM, Alpha Innotech Corp., USA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen MiniOpticon järjestelmä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), käyttäen 5 ui käänteisen transkription tuotteiden, 10 ui iQTMsupermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 0,5 ui aluketta ja koettimien kokonaistilavuudessa 20 ui. Standard lämpösyklilaite olosuhteita käytettiin seuraavasti: 95 ° C: ssa 5 minuuttia ennen ensimmäisen jakson, 95 ° C 10 sekuntia, 56 ° C 30 sekuntia, toistetaan 40 kertaa.

Ohimenevä transfektio Sirna (siRNA) B

vaiennettu mTOR siRNA (25 nM) saavutettiin käyttämällä DharmaFECT transfektioreagensseja jälkeen opastavia käsikirjan ohimenevän transfektion A549-PacR soluissa. Scramble siRNA (25 nM), jota käytettiin verrokkina, oli myös. Seos reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan per astia, joka sisältää 200 ui seerumitonta ja antibiootti-väliaineessa kokonaistilavuudessa 300 ui, ja soluja inkuboitiin 4 tuntia 37 ° C: ssa. Yhtä suuri määrä väliainetta lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan. Transfektion jälkeen 24 tuntia sen jälkeen, kun pinnoitus, solut on rikastettu 10% FBS: ää, inkuboitiin vielä 24 tuntia 25 uM 21α-MMD ja solut kerättiin ja alistettiin analyysiin. Pudotus mTOR ilmentymistä tutkittiin immunoblottauksella, kuten edellä on kuvattu käyttäen anti-mTOR-vasta-ainetta. MTOR siRNA-sekvenssi oli 5′-AAGAAUCAAAGAGCAGAGUGC-3′.

Tilastollinen analysointi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD, että ilmoitettu määrä suoritetaan itsenäisesti kokeita ja analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä ei-parametristen Mann-Whitneyn U-testi arvoja, joita ei ole normaalisti jakautunut, yksisuuntainen ANOVA, ja Spearmanin korrelaatio testit tarvittaessa GraphPad Prism v5.01 ohjelmisto (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Arvot

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

antiproliferatiivisia vaikutuksia yhdisteiden

P

.

trifoliata

ihmisen syöpäsolujen linjat

Kumariinit ja triterpenoids hedelmistä on

P

.

trifoliata

on aiemmin kuvattu osoittavan voimakasta syöpää ehkäisevistä vaikutuksista vastaan ​​erilaisia ​​syöpäsolun mallit [27-29]. Näiden tietojen perusteella,

in vitro

sytotoksisia 13. yhdisteiden eristetyn hedelmistä

P

.

trifoliata

MDA-MB-231, T47D, SNU-638, SK-HEP-1, ja A549 ihmisen syöpäsolulinjoissa arvioitiin käyttämällä SRB-määritystä. Kuten on esitetty taulukossa 1, triterpenoids osoitti lupauksia estämällä paneeli syöpäsolujen IC

50-arvot vähemmän kuin 50 mikro-molaarisia alueita. Niistä koeyhdisteet, triterpenoids 25-methoxyhispidol A, 21α-methylmelianodiol (21α-MMD, kuvio 1A), ja 21α, 25-dimethylmelianodiol esillä aktiivisin anti-proliferatiivista aktiivisuutta. Tiedot ehdotti, että antiproliferatiivista aktiivisuutta 21α-MMD on voimakas testattaessa A549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja, joka ohjasi meidät lisätutkimuksia sen vaikutusmekanismi suuremmassa paneelissa NSCLC solumalleja.

( A) kemiallinen rakenne 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), luonnollinen triterpenoidi eristetty hedelmistä

Poncirus trifoliata

. (B) MRC-5 ja L132 ihmisen normaalin keuhkokudoksen solulinjojen ja A549, H460, H358, H1299, ja H292 ihmisen keuhkosyövän solulinjat maljattiin 96-kuoppalevylle ja niitä käsiteltiin eri pitoisuuksilla 21α-MMD: ssa 24 tuntia ja solujen kasvua analysoitiin MTT-määrityksellä ja piirrettiin elinkelpoisten solujen prosentuaalinen. Arvoja verrataan vastaavaan vertailuarvo. (C) Clonal muodostumisen kasvu osoitti keuhkosyöpäsoluissa suoritettiin jälkeen 7 päivän kasvukausi kerta-annoksen jälkeen eri konsentraatioiden 21α-MMD. Kuvien vasemmalla näkyy ovat kristalliviolettia värjätään pesäkkeitä, kun taas oikealla ovat kuvaajia, jotka edustavat määrä mittauksia siirtomaita. (D ja E) faasikontrastimikroskopiaan suoritettiin soluilla altistuksen jälkeen 25 uM 21α-MMD muutosten tunnistamiseksi morfologian ja DNA havaittiin DAPI (alhaalla vasemmalla) ja PI (oikealla) värjäämällä noudattavat -konfokaalimikroskoopilla. (F) H1299 ja A549-soluja inkuboitiin 5 uM 21α-MMD 24 h, mitä seurasi solujen invaasiota analyysi.