Krooninen sairaus

tiivistelmä

CHIP, yhteistyössä kaperoniproteiinina joka on vuorovaikutuksessa HSC /Hsp70, on osoitettu olevan alle ilmaistaan ​​haiman syöpäsoluissa ja on osoittanut potentiaalia tuumorisuppressoriproteiinia omaisuutta. Kuitenkin taustalla olevien mekanismien CHIP sääntelyn haimasyöpäsoluissa ole tiedossa. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-1178 vähensi käännös CHIP proteiinin kohdistamalla 3′-UTR alue. Havaitsimme, että yli-ilmentyminen miR-1178 helpotti leviämisen, G1 /S siirtymä, muuttoliike ja invaasion haiman syöpäsoluja. Toisaalta, inhibitio miR-1178 ilmentyminen merkitsevästi esti näiden fenotyyppejä. Lisäksi CHIP yli-ilmentyminen kumottu miR-1178 aiheuttaman soluproliferaation ja invaasiota. Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-1178 toimii oncomiR haiman syöpäsoluissa estämällä Chip ilmentymistä.

Citation: Cao Z, Xu J, Huang H, Shen P, You L, Zhou L, et ai. (2015) MiR-1178 Edistää leviämisen, G1 /S Transition, Migration ja invaasiota haimasyöpäsoluissa mukaan Targeting siru. PLoS ONE 10 (1): e0116934. doi: 10,1371 /journal.pone.0116934

Academic Editor: Jose G. Trevino, University of Florida, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 31 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 16 joulukuu 2014; Julkaistu: 30 tammikuu 2015

Copyright: © 2015 Cao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 81272484), Beijing Natural Science Foundation (nro 7132179), Major State Basic Research Development Program of China (973 Program, No. 2014CB542300), Research Special Fund for Public Welfare Industry of Health (nro 201202007) ja National Science Teknologia Pilari Program kahdennentoista viisivuotissuunnitelman Period (nro 2014BAI09B11). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa [1]. Olemassa hoitoja on vain vähän vaikutusta parantavan eloonjäämistä potilailla, joilla haimasyöpä [2-4]. Exploring mekanismeja kasvaimen kehittymisen, etenemisen ja etäpesäkkeiden haimasyövän sekä uusia terapeuttisia tavoitteita tarvitaan kiireesti.

CHIP, yhteistyössä kaperoniproteiinina joka on vuorovaikutuksessa HSC /Hsp70 [5], edistää ubikitinaation ja hajoaminen lukuisia ratkaisevan syöpään liittyvien proteiinien, kuten NF-KB: n [6, 7], Met [8] ja p53 [9-11]. Aiemmin olemme huomanneet, että Chip tukahdutti haimasyöpä solujen lisääntymistä, ankkurointi riippumattoman kasvun, siirtolaisuuden ja invaasio välittämällä hajoamista EGFR. Matala ilmentymistaso CHIP korreloi kanssa heikentyneet ennusteeseen potilailla, joilla haimasyöpä [12]. Kuitenkin mekanismit sääntelyn CHIP ilmentymisen haimasyöpäsoluissa ole tiedossa.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, endogeeninen, ei-koodaavaa RNA-molekyylien kanssa on merkittävä rooli transkription jälkeisen geenin ilmentymisen säätelyyn [13 -16]. Guo J

et al

. [17] mukaan miR-764-5p estää proteiini käännös CHIP hiirillä. Kuitenkin myös miRNA säädellä CHIP ilmentymistä ihmisen syöpäsoluja ei ole osoitettu aikaisemmin.

Nykyisessä tutkimuksessa, teimme

in silico

näytön miRNA tunnistaa mahdollisia säätelijöinä CHIP ilmaisun. Huomasimme, että miR-1178 tavoitteet 3′-UTR CHIP mRNA ja säätelee negatiivisesti käännös siru. Lisäksi miR-1178 ilmaus vaikuttaa haimasyövän solujen lisääntymistä, G1 /S siirtymä, muuttoliike ja hyökkäystä. Huomasimme myös, että vaikutukset miR-1178 ovat palautuvia, jonka yli-ilmentyminen siru. Tulosten perusteella näyttää, että miR-1178 ilmaisu kiihdyttää haiman kasvaimien synnyn suoralla estämällä CHIP ilmaisun.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa BxPC-3, PANC-1, SW1990 ja MiaPaca-2 olivat lahja tri Freiss H (University of Heidelberg, Heidelberg, Saksa) [18, 19]. Nämä solulinjat siirrostettiin alle 6 kuukauden ajan elvytys. Ei reauthorization suoritettiin. Soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä tai Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (molempien väliaineen olivat HyClone, Utah, USA), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Cell transfektio

PANC-1 ja BxPC-3-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, viljeltiin yön yli, ja sitten transfektoitiin miR-1178 jäljittelee, joka on miR-1178 estäjä, tai niiden yhteensovitettujen negatiivisia kontrolleja (kaikki GenePharma, Shanghai, Kiina). Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) käytettiin transfektion mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut kerättiin edelleen analyysien jälkeen vielä 48 tunnin inkubaation jälkeen.

RNA: n eristys ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin transfektoiduista soluista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, USA ) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteinen transkriptio suoritettiin käyttämällä käänteisen transkription kit (Promega, Madison, USA). Chip-mRNA-tasot mitattiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) kanssa SYBR Green PCR Kit (Takara, Japani). Ilmentymisen tasot kypsän miR-1178 kvantitoitiin miR-qRT PCR: llä käyttäen Hiuspinni-se miRNA qPCR: n kvantitointi Kit (GenePharma, Shanghai, Kiina), joka sisälsi varsi-silmukka-, kuten RT-alukkeen ja PCR-alukkeita, spesifisiä eri miRNA tai U6-RNA sisäisen valvonnan. Analyysit tehtiin Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System (Life Technologies, South San Francisco, USA). Kertamuutoksia laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmällä. Päinvastainen alukkeet GAPDH ja CHIP syntetisoitiin Invitrogen (USA). Alukesekvenssit on esitetty S1 taulukossa. Ilmaisu Mir-1178 pidettiin korkeana, kun ilmentymisen taso oli yhtä suuri tai suurempi kuin mediaani kohortin ja alhainen taso oli alle mediaani kohortin. QRT-PCR-analyysit toistettiin vähintään 3 kertaa.

Western blot -analyysit

48 tunnin kuluttua transfektion 6-kuoppalevyillä, solut lyysattiin RIPA-puskurilla (Applygen, Peking, Kiina ). Lysaatit denaturoitiin natriumdodekyylisulfaattia (SDS)-näytepuskurissa 100 ° C: ssa 5 minuuttia ja erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE), minkä jälkeen siirtämällä polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Millipore, MA, USA). Kun oli salvattu 5% rasvatonta kuivamaitoa huoneenlämpötilassa 1 h: n membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden. Vasta-aineet on esitetty S2 taulukossa. Pesun jälkeen TBST: llä, kalvoja inkuboitiin toissijaisen vasta-aineita (Applygen, Beijing) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin kanssa elektrokemiluminesenssiin (ECL) havaitsemisjärjestelmä, ja ekspressiotasot proteiinien arvioitiin käyttäen Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmisto (Media Cybernetics, USA). Western blot-analyysit toistettiin vähintään 3 kertaa.

Soluproliferaatiomääritys

Soluproliferaatio analysoitiin käyttäen solujen määrä kit (CCK-8) (Dojindo, Japan). PANC-1 (4 x 10

5 solua /kuoppa) ja BxPC-3 (5 x 10

5 solua /kuoppa) solut transfektoitiin 6-kuoppalevyillä. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin ja ympättiin 96-kuoppaisille levyille (1000 solua /kuoppa). Solujen proliferaatio mitattiin joka päivä 4 päivää. Kullakin ajanhetkellä, 10 ui /kuoppa CCK-8-reagenssia lisättiin, ja soluja inkuboitiin 2,5 tuntia 37 ° C: ssa. Optinen tiheys (OD) mitattiin 450 nm: ssä ja 630 nm mikrolevylukijalla (Wellscan MK3, Thermo Labsystems, Suomi). CCK-8 määritys toistettiin 3 kertaa kuusi rinnakkaisnäytettä.

Solun maahanmuutto- ja invaasiomääritys

Solun maahanmuutto- ja invaasion arvioitiin käyttämällä TranswellTM muuttoliikkeen kammiot (8 um huokoskoko, Corning, USA) . Kalvot varten invaasiomääritys päällystettiin laimennettua ECM ratkaisu (Sigma-Aldrich, Shanghai, Kiina). PANC-1 (2 x 10

4 solua /kuoppa) tai BxPC-3 (4 x 10

4 solua /kuoppa) soluja siirrostettiin yläosaan kammioon seerumia transfektion jälkeen. Joka sisälsi 10% FBS: ää toimi kemoattraktantti alemmassa kammiossa. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia 37 ° C: ssa, ei-hyökkäsi solujen päälle kalvon kaavittiin ja poistettiin vanupuikkoja, ja tunkeutuu solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 90% etyylialkoholi, värjättiin hematoksyliinillä ja laskettiin sitten valomikroskoopilla. Siirtyminen ja invaasiomääritys toistettiin 3 kertaa Rinnakkaiskuoppien.

Solusyklianalyysiä

solusyklin määrityksessä, solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja kiinnitettiin 70% etanolia 4 ° C yön yli. Kun oli pesty kahdesti PBS: llä, soluja inkuboitiin 30 ug /ml propidiumjodidia (PI), 0,2 mg /ml RNaasi A: n ja 0,2% Triton X-100 (kaikki yhtiöltä Sigma-Aldrich, USA) 37 ° C: ssa 30 minuutit. Sitten solut analysoitiin virtaussytometrillä (BD Biosciences, USA).

Dual-lusiferaasianalyysissä

Sen arvioimiseksi, onko siru on suora kohteena miR-1178, The pMIR-REPORT määrityksessä oli käyttää. Siru 3′-UTR vektoreihin, jotka sisältävät villin tyypin tai mutantit siemenet sekvenssi rakennettiin ja ostettiin GenePharma (Shanghai, Kiina). PANC-1-solut ympättiin 12-kuoppalevyille (1 x 10

5 solua /kuoppa) ja ko-transfektoitiin villityypin tai mutantti-vektorin ja 50 nM miR-1178 jäljittelee tai NC matkii käyttäen Lipofectamine 2000. 24 h transfektion jälkeen, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) valmistajan protokollan.

tilastollinen analyysi

SPSS v. 13,0-ohjelmisto (SPSS, Inc., Chicago, IL) käytettiin tilastollisiin analyyseihin. Jatkuva tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD) ja verrattiin Studentin t-testillä tai Fisherin tarkkaa testiä.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

CHIP on välittömänä kohteena miR-1178

Tunnistaa sääntelyviranomaiset CHIP ilmaisun, avoin pääsy ohjelmistoa TargetScan käytettiin. Mukaan ennustamiseen TargetScan, miR-1178 tunnistettiin mahdollisen säätelijänä CHIP ilmaisua. Olemme havainneet, että miR-1178 ilmentyminen vaihteli 4 ihmisen haimasyövän solulinjoissa, mukaan lukien SW1990, BxPC-3, MiaPaca-2, ja PANC-1, jossa suhteellinen ilmentymistaso miR-1178 oli 0,568 ± 0,12, 1,04 ± 0,05, 1,51 ± 0,07, ja 0,87 ± 0,09, vastaavasti (kuvio. 1A;

P

0,01). PANC-1 ja BxPC-3-soluja, jotka oli kohtalainen ilmentyminen miR-1178, käytettiin kaikkialla muualla tutkimuksen.

(A) MiR-1178 ilmentyminen vaihteli 4 ihmisen haimasyövän solulinjoissa. (B) miR-1178 sito 3′-UTR CHIP ennustettiin TargetScan. (C) In PANC-1-solut, miR-1178 jäljittelee tukahdutettu lusiferaasiaktiivisuus reportteri, joka sisältää villityypin Chip 3′-UTR, mutta ei, joka sisältää mutantti-3′-UTR. (D) ilmentyminen tasot Chip havaittiin Western blot jälkeen PANC-1 ja BxPC-3-solut transfektoitiin miR-1178 jäljittelee tai estäjä. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (E) Transfektio MIR-1178 matkii ei tukahduttaa mRNA ilmaus siru. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. *

P

P

onko siru on suora kohteena miR-1178, 3′-UTR CHIP villin tyypin tai mutantti siemen sekvenssi tunnustamista sivustoja kloonattiin dual-lusiferaasireport- (Fig. 1 B). Huomasimme, että lusiferaasiaktiivisuudeksi jälkeen vähentynyt kotransfektoimalla MIR-1178 jäljittelee kanssa villityypin vektori, verrattuna kotransfektoimalla MIR-1178 jäljittelee mutantti vektorin (

P

0,05 ) (Fig. 1 C). Arvioimme lisäksi mRNA: ta ja proteiinia tasot Chip jälkeen muuttaa miR-1178 ilmentymistä. Tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-1178 merkittävästi vähentynyt Chip proteiinin ilmentymistä vaikuttamatta CHIP mRNA ilmaisun kontrolliin verrattuna. Sen sijaan, alas-säätely miR-1178 kasvanut chip proteiinin ilmentymisen (Fig. 1 D, E). Nämä tulokset osoittavat, että miR-1178 voidaan suoraan kohdistaa ennustettu CHIP siemenen alueelle.

MiR-1178 edisti kasvua ja G1 /S siirtymistä PANC1 ja BxPC-3-solujen

tarkastella funktiota Mir-1178 haimasyövän, miR-1178 matkii ja miR-1178 estäjä käytettiin. Transfektion jälkeen MIR-1178 jäljittelee tai estäjä, ilmaus miR-1178 oli merkitsevästi säädelty tai alassäädetty, vastaavasti (kuvio. 2A). CCK-8 testi osoitti, että leviämisen määriä PANC-1 ja BxPC-3 solut kasvoivat jälkeen miR-1178 yli-ilmentyminen. Sen sijaan miR-1178 alassäätöä inhiboivat haimasyöpäsoluissa (Fig. 2B). Lisäksi säätely ylöspäin miR-1178 edisti G1 /S tarkastuspiste siirtyminen sekä PANC-1 (S vaihe 30.17 ± 1,31% vs. 39,31 ± 1,51%,

P

0,01) ja BxPC- 3 (S vaihe 29.89 ± 1,56% vs. 42.57 ± 3,74%,

P

0,05) soluja, kun taas alas-säätely miR-1178 johti venymään G1 vaiheeseen (Fig. 2C) .

(A) qRT-PCR osoitti, että kun solujen transfektoimiseksi MIR-1178 jäljittelee tai estäjä, ilmaus miR-1178 oli merkitsevästi säädelty tai alassäädetty, vastaavasti. (B) CCK-8 testi osoitti, että miR-1178 over-ilmentyminen edisti leviämisen PANC-1 ja BxPC-3-soluissa, kun taas alas-säätely miR-1178 tukahdutetaan solujen lisääntymistä. (C) Ylös-säätely miR-1178 helpotti G1 /S transition in PANC-1 ja BxPC-3-soluissa. Sitä vastoin G1 /S solukierron pysähtymisen jälkeen havaittiin miR-1178 eston. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. *

P

P

0. 01.

MiR-1178 kiihtyi haimasyövän solumigraatioon ja invaasiota

siirtokuoppaan määritys suoritettiin määrittämään roolia miR-1178 haimasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Yli-ilmentyminen miR-1178 lisäsi PANC-1-soluissa, jotka tunkeutuivat ECM-päällystetty kalvo. Sen sijaan, invasiivisuus ja PANC-1-soluissa oli merkittävästi vähentynyt, kun miR-1178 ekspressio estyy. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin BxPC-3-solut (Fig. 3A). Suostumuksella Tämän toteamuksen muuttavien kykyjä näiden kahden solulinjoja myös parannettu jälkeen soluja käsiteltiin MIR-1178 jäljittelee, kun taas vastakkainen tuloksia havaittiin, kun soluja käsiteltiin MIR-1178 estäjä (Fig. 3B ).

Solun maahanmuutto- ja invaasion analysoitiin kalvo sisältävien siirtoaltaat ilman tai Matrigel. Solut, jotka olivat vaeltaneet tai tunkeutuneet alapintaan kalvon värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja laskettiin mikroskoopilla 100-kertaisella suurennuksella. (EN) säätely ylöspäin miR-1178 transfektoimalla jäljittelee tehostetun soluinvaasiota, kun taas miR-1178 alassäätöä pelottaa soluinvaasiota. (B) yli-ilmentyminen miR-1178 edistää solujen vaeltamiseen, kun taas alas-säätely miR-1178 inhiboi solujen vaeltamiseen. *

P

P

0.01.

alajuoksulla signalointireiteissä Mir-1178

Meidän Edellisessä tutkimuksessa osoitimme, että siru on uusi kasvain vaimennin haimasyövän kautta hajoamista EGFR. Koska havaintomme että miR-1178 alassäädetty ilmaisua siru, me arveltu, että miR-1178 voi myös säätelevät EGFR ja sen loppupään signalointiryöpyn. Huomasimme, että yli-ilmentyminen miR-1178 lisäsi EGFR-proteiinin tason ja aktivoitu alavirran AKT /p21-reitin ja Src /E-kadheriinin reitin (Fig. 4A). Sen sijaan, inhibition miR-1178 oli päinvastainen vaikutus (Fig. 4B). Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että EGFR /AKT /p21 ja EGFR /SRC /E-kadheriinin reittejä avainrooleja leviämisen, solusyklikontrollin, muuttoliike ja invaasion haimasyöpäsoluissa [20-23]. Niinpä arveltu, että kohdunulkoinen aktivointi EGFR /AKT /p21 ja EGFR /SRC /E-kadheriinin väyliä saattaa osittain selittää vaikutusten miR-1178 haiman syöpäsoluja.

(A, B) ilmentymistasojen EGFR, p-AKT, AKT, p21, p-SRC, SRC ja E-kadheriinin havaittiin western blot jälkeen PANC-1 ja BxPC-3-solut transfektoitiin miR-1178 jäljittelee tai estäjä. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

Yli-ilmentyminen CHIP kumosi miR-1178-indusoitua proliferaatiota, G1 /S siirtymä, muuttoliike ja invaasion haimasyöpäsoluissa

edelleen ovatko miR-1178 edistää pahanlaatuinen fenotyyppi tukahduta CHIP haiman syöpäsoluissa, hyväksyimme ”pelastus” strategia tutkimaan toiminnallinen merkitys miR-1178 /CHIP vuorovaikutusta. PcDNA-siru tai pcDNA tyhjä vektori transfektoitiin PANC-1-soluista-ilmentävät miR-1178. Kuten on esitetty kuviossa. 5A taso CHIP lisääntyi kun pcDNA-Chip transfektoitiin. Lisäksi yli-ilmentyminen Chip esti miR-1178-indusoidun ilmentymisen EGFR, p-AKT ja p-SRC. Suostumuksella inaktivoinnin EGFR ja sen loppupään kulkuväylillä soluinvaasiota, muuttoliike (kuvio. 5B), lisääntymistä (kuvio. 5C) ja G1 /S siirtymä (kuvio. 5D) olivat kaikki tukahdutetaan. Nämä tulokset osoittavat, että miR-1178 edistää solujen lisääntymistä, G1 /S siirtymä, siirtymän ja hyökkäyksen kautta alas-säätely CHIP.

(A) Western blot-analyysi CHIP, EGR, AKT, p21, SRC ja E-kadheriinin ilmentymisen PANC-1-soluissa, jotka transfektoitiin joko pcDNA-siru tai pcDNA tyhjän vektorin ja miR-1178 jäljittelee. β-aktiini havaittiin myös sisäisenä kontrollina. (B) TranswellTM analyysi PANC-1-soluissa, kun molemmat Kotransfektioita. (C) kasvukäyrät PANC-1-solujen kotransfektion jälkeen. (D) solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin on laskettu fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS). *

P

0. 05, **

P

0. 01.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-1178 kohdistettu 3′-UTR siru mRNA, jolloin eston CHIP proteiinin translaation. MiR-1178 helpotti haimasyöpä solujen lisääntymistä, G1 /S siirtymä, siirtymän ja invaasio tukahduttaa CHIP ilme. Voimme päätellä, että miR-1178 on sisäsyntyinen vaimennin CHIP ilmaisun, joka edistää pahanlaatuinen fenotyyppi haiman syöpäsoluja.

Karboksyylipään Hsp70-vuorovaikutuksessa proteiini (chip) on jäsenenä E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla, toimii välisen yhteyden kaperonin (lämpösokkiproteiini 70/90) ja proteasomin järjestelmät. Chip on osoitettu olevan osallisena kasvainten synnyssä, leviämisen ja invaasion useissa maligniteettien [24] säännellään useita onkogeenisten proteiinien lukien hypoksia-indusoituva tekijä 1α (HIF-1α) [25], estrogeenireseptori-α (ERa) [ ,,,0],26], ja ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin [27]. Olemme aikaisemmin havainneet, että Chip toimi uutena tuumorisuppressoriproteiinia by alaspäin säätäminen EGFR-polun haiman syöpäsoluja. Ilmentyminen CHIP väheni haimasyövän kudoksissa [13]. Kuitenkin mekanismi CHIP alhaisen ilmentymisen vielä lisää tutkimuksia.

Vaikka yhä enemmän todisteita on ilmoittanut, että Chip on tärkeä rooli syöpien [6, 28-30], mekanismit CHIP sääntelyn pysyi huonosti. Tähän asti oli vain kaksi julkaistut tutkimukset keskittyivät mekanismeja ylävirtaan sääntelyn siru. Shimamoto S

et al

. [31] kertoi, että Ca (2 +) /S100 sitoutuvat TPR verkkotunnus ja toimivat ylävirran säätelijöinä siru. Guo J

et al

. [17] osoittivat, että miR-764-5p tukahdutettu Chip proteiinin translaation hiirillä sitoutumisen kautta 3′-UTR siru mRNA. Kuitenkin myös miRNA voisi säädellä CHIP ilmentymistä ihmisen syöpäsoluja ei ollut aiemmin määritetty. Meidän miRNA -näytöstä TargetScan ohjelmistoa ennusti, että Chip voisi olla yksi alavirran tavoitteista miR-1178. Vahvista tämä ennustus, suoritimme lusiferaasireport- määritys. Olemme havainneet, että lusiferaasiaktiivisuus dramaattisesti vähentynyt kotransfektion jälkeen on miR-1178 jäljittelee vektorin ekspressoidessa villityypin Chip 3′-UTR: n, verrattuna kotransfektion ja jäljittelee vektorin kanssa, joka ilmentää mutatoidun Chip 3′-UTR . Western blot-analyysi osoitti lisäksi, että yli-ilmentyminen miR-1178 tukahdutetaan Chip proteiinin ilmentymisen. Sen sijaan alas-säätely miR-1178 lisäsi CHIP proteiinin taso. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-1178 suoraan kohdistuu 3′-UTR Chip mRNA estää Chip proteiinin translaation. Sikäli kuin tiedämme, tämä oli ensimmäinen kerta, kun miRNA joka voi estää ilmentymisen CHIP proteiinia löydettiin ihmisen solulinjoissa.

Lisääntyvä näyttö on osoittanut, että miRNA voi olla sekä tuumoria tukahduttavan [32-34 ] ja onkogeeniset [35, 36] ominaisuudet haiman syöpäsoluja. Kuitenkin tutkimukset keskittyy toimintoja miR-1178 ei raportoitu. Edellisessä tutkimuksessa [12], huomasimme, että Chip tukahdutti haimasyöpä solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Siksi arveltu, että miR-1178 saattaa aiheuttaa haimasyövän solujen kasvua, muuttoliikkeen ja hyökkäystä. Tämä hypoteesi tukivat havaintojemme. Tuloksemme osoittivat, että miR-1178 yliekspressio helpotti haimasyöpä solujen lisääntymistä, G1 /S siirtymä, muuttoliike ja hyökkäystä. Sen sijaan, inhibition miR-1178 tukahdutetaan nämä prosessit. Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-1178 toimii oncomiR aikana haimasyöpä tumorigenesis ensimmäistä kertaa.

haimasyöpä näyttää erilaisia ​​molekyyli- muutoksia, jotka johtavat syöpäsolujen paitsi hengissä, mutta myös hyökätä ympäröivien kudosten ja metastaaseja etäisiin paikkoihin. Yleisin muutos liittyy epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) geeni. Li Y

et al

. [37] osoitti, että miR-146a esti invasiivisen kapasiteettia PDAC solujen välittömänä päämääränä EGFR. Croce CM [38] kertoi, että miR-21 stimuloi EGFR polku ja lisäsi kasvua PDAC solujen riippumaton PTEN hajoamista. Koska edellisessä tutkimuksessa osoitettiin, että siru on uusi posttranslationaalinen säädin EGFR [12], päättelimme, että miR-1178 voi myös säätelevät EGFR ja sen loppupään signalointiryöpyn. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-1178 yliekspressio lisäsi EGFR-proteiinin tason ja aktivoitu alavirran AKT /p21-reitin ja Src /E-kadheriinin reitin. Sen sijaan, inhibition miR-1178 oli päinvastainen vaikutus. Aktivointi AKT /p21 ja Src /E-kadheriinin signalointi on raportoitu olevan mukana proliferaatioon, solusyklikontrollin, muuttoliike ja invaasion haimasyöpäsoluissa [20-22, 28]. Nämä tulokset osoittavat, että kohdunulkoinen aktivointi EGFR /AKT /p21 ja EGFR /SRC /E-kadheriinin väyliä saattaa osittain selittää vaikutusten miR-1178 haiman syöpäsoluja.

Voit tarkistaa, onko miR-1178 toiminnot kuin oncomiR mukaan tukahduta CHIP, joka on ”pelastus” strategia hyväksyttiin tutkimaan toiminnallinen merkitys miR-1178 /CHIP vuorovaikutusta. Tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen Chip esti miR-1178-indusoidun ilmentymisen EGFR, p-AKT ja p-SRC. Mukaisesti inaktivoinnin EGFR ja sen loppupään polkuja, solujen lisääntymistä, G1 /S siirtymä, siirtymän ja invaasio oli myös vähentynyt. Niinpä pääteltiin, että säädelty EGFR reitin ja helpottamista tumorigeneesin by miR-1178 voi johtua vähentyneestä CHIP ilmentymistä haiman syöpäsoluja.

yleensä

in vitro

tietoa ei riitä tekemään kliinisesti merkittäviä päätelmiä haimasyövän [39], erityisesti väliset korrelaatiot miR-1178 ilmaisun ja kliinis. Meidän lisätutkimuksia, tutkimme biologisten toimintojen miR-1178 in PDX (potilaasta johdettujen ksenografteissa) haimasyövän. Lisäksi olemme arvioi ilmentymistä miR-1178 kudoksissa haimasyövän tutkia korrelaatio miR-1178 ilmaisun ja kliinisiä tekijöitä potilaiden haimasyöpä.

Johtopäätös

Yhteenvetona nykyinen tutkimus osoitti, että miR-1178 edistänyt haimasyöpä solujen lisääntymistä, G1 /S siirtymä, siirtymän ja hyökkäyksen kautta alas-säätely siru. Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-1178 on sisäsyntyinen vaimennin on siru, joka helpottaa haiman kasvainten synnyssä. Tietääksemme tämä tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa sääntelyn CHIP ilmentymisen miRNA ihmisen syöpäsoluja ja selkeyttää toimintaa miR-1178 haimasyövän. Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-1178 voisi toimia uutena terapeuttisena kohteena miRNA-pohjainen terapia haimasyövän.

tukeminen Information

S1 Taulukko. Alukesekvenssejä GAPDH ja siru.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0116934.s001

(XLS)

S2 Taulukko. Ensisijainen vasta-aineita Western blot analyysiä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0116934.s002

(XLS) B