Krooninen sairaus

tiivistelmä

ilmentyminen proteiinifosfataasi 32 (PP32, ANP32A) on alhainen huonosti eriytetty haiman syöpien ja liittyy tasot Hur (ELAV1), ennakoiva markkeri gemsitabiini vastausta. Haiman syöpäsoluja, eksogeeninen yliekspressio pp32 inhiboi solun kasvua, mikä tukee sen pitkän tunnustettu rooli tuumorisuppressori haimasyöpä. Kemoterapeuttisessa herkkyys seulontamäärityksissä, solut yli-ilmentävät pp32 oli selektiivisesti resistenttejä nukleosidianalogeja gemsitabiinin ja sytarabiinin (ARA-C), mutta oli herkistetty 5-fluoriurasiili; kääntäen, hiljentäminen pp32 haiman syöpäsoluissa parannettu gemsitabiini herkkyys. Sytoplasmisen tasot pp32 kasvoi syövän jälkeen soluja käsitellään tiettyjä stressitekijät, kuten gemsitabiini. pp32 yli-ilmentyminen vähensi yhdistys Hur kanssa koodaavan mRNA gemsitabiinia metaboloivaan entsyymi deoksisytidiinikinaasiin (dCK) aiheuttaen vähentää merkittävästi dCK proteiinin tasot. Vastaavasti, ektooppinen pp32 ekspressio vähensi Hur sitoutumiseen mRNA: iden, jotka koodaavat kasvaimeen edistää proteiinien (esim., VEGF: n ja Hur), kun taas hiljentäminen pp32 paranee dramaattisesti sitoutumisen näiden mRNA tavoitteet. Alhainen pp32 ydinvoiman ilmaisu korreloi korkealaatuisesta kasvaimia ja läsnäolo imusolmuke etäpesäke, verrattuna potilaiden kasvainten ydinvoiman pp32 ilme. Vaikka pp32 ekspressiotasot ei tehostanut ennusteita sytoplasmisen HUR tila, ydin- pp32 tasoa ja sytoplasman Hur tasot liittyvät merkittävästi potilaiden näytteistä. Siten tarjoamme uusia todisteita siitä, että tuumorisuppressorigeenin toiminta pp32 voidaan katsoa johtuvan sen kyvystä häiritä Hur sitoutumaan kohde koodaavien mRNA avain proteiineja syövän solujen eloonjäämistä ja lääkeaineiden tehoon.

Citation: Williams TK, Costantino CL , Bildzukewicz NA, Richards NG, Rittenhouse DW, Einstein L, et al. (2010) pp32 (ANP32A) Expression Estää Haimasyöpä Cell Growth ja indusoi Gemsitabiini Resistance häiritsemällä Hur Sitoutuminen mRNA: iden. PLoS ONE 5 (11): e15455. doi: 10,1371 /journal.pone.0015455

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 26 syyskuu 2010; Julkaistu: 29 marraskuu 2010

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: JRB tukivat Urakehitys palkinnon PanCAN, American Association of Cancer Research; varoja American Cancer Society (# IRG-08-060-01), ja rahasto Cure, Newtown, PA. MG tukivat National Institute on Aging-Intramural tutkimusohjelma, National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDA) on aggressiivinen maligniteetti, joilla on huono ennuste, jopa seuraavat kirurginen resektio [1], [2]. Vaikka 5-fluorourasiilin (5-FU) ja gemsitabiini (GEM) kanssa tai ilman sädehoitoa muodostavat tavallisen hoidon liitännäishoitona, ne tarjoavat vain vähän parannusta pysyvyyttä [3], [4], [5]. Siksi ymmärtää paremmin hankitun ja

de novo

kemoterapeuttinen resistenssimekanismeja on meille välttämätöntä parantaa nykyisiä hoitostrategioita. Vaikka paljon on opittu molekyylitason muutosten mukana prosessissa haiman tumorigeneesin, ei ole juurikaan menestystä käsityksemme miksi haimasyövän soluja ovat resistenttejä kemoterapiaa [6], [7].

pp32 ( ANP32A) on ainutlaatuinen malli ilmaistaan ​​useissa ihmisen syövissä [8], [9], [10], [11]. pp32 toimii tuumorisuppressoriproteiinia [12], mikä ilmenee sen kyky estää

k-ras

välitteinen pahanlaatuisiksi [13], [14]. Olemme aiemmin osoittaneet, että pp32 ilmaisu korreloi erilaistumista aseman PDA, normaali ekspressiotasot havaittiin hyvin eriytetty kasvaimia mutta alensi-to-poissa ekspressiotasot huonosti eriytetty kasvaimissa [14]. Nämä havainnot ovat merkittäviä, koska huonosti eriytetty muodot PDA ovat molemmat yhteiset ja aggressiivinen, mutta pieni ymmärretään noin erityisiä molekyylitason ominaisuudet tämänkaltaisen PDA [15]. Aikaisemmassa tutkimuksessa, käyttöönotto pp32 tulee huonosti eriytetty haiman solulinja aiheuttaman solusyklin pysähtymisen ja estivät solujen kasvua [14].

pp32 on osoitettu olevan sitoutumiskumppanin useiden tärkeiden proteiinien [14], [16], [17], [18], [19]. Aikaisempi työ osoitti, että pp32 on mukana: 1) stabilointi tiettyjen mRNA: iden, joissa AU-rikas elementtejä (ARE) 5 ’ja 3’ transloimattomia alueita (UTR: t) kautta vuorovaikutus pp32 RNA: n kanssa sitovan proteiinin Hur (ELAVL1) [18]; 2) muutos histonien asetylointi kautta rooli estäjä fenikoliasetyylitransferaasi monimutkaisia ​​(kutsutaan INHAT) [17]; ja 3) modulointi solusyklin läpi sen vuorovaikutus fosforyloidun muodon Rb [18], [19], [20], [21].

Viime aikoina olemme myös havainneet, että sitomispartnerin pp32, Hur [18], [22], on keskeinen GEM tehoa vastaan ​​haimasyöpäsoluissa [23]. Olemme osoittaneet, että Hur voi liittyä deoksisytidiinikinaasiin (dCK) mRNA ja näin säädellä dCK proteiinin ilmentymisen [23]. Tämä yhdistys paranee, kun haiman syöpäsoluja altistetaan GEM. Kun GEM altistuminen, dCK taso kasvaa aineenvaihdunta GEM (nukleosidianalogi) peräisin aihiolääke osaksi aktiivisia metaboliitteja. Niinpä hoidetuilla potilailla GEM jonka resektoitiin kasvaimet ilmaisivat kohonnut soluliman Hur tasoilla oli 7-kertainen eloonjäämisen verrattuna potilaisiin, joiden resektoidun ilmentävien kasvainten alhainen sytoplasmisen Hur [23]. Tämä edellinen työ tarjoaa puitteet tutkia HUR ja siihen liittyvät proteiinit (pp32) yhteydessä kemoterapeuttisen tehosta [24].

tarkka rooli pp32 kuin tuumorisuppressorigeeniä ja sen rooli HUR: n transkription jälkeisen sääntely kohde-mRNA: iden ei juuri tunneta. Aiemmin pp32 yhteistyössä immunosaostettiin Hur soluviljelymalleissa ja osoitettiin, että pp32: n RNA tunnustamista motiivit olivat kriittisiä tämän vuorovaikutuksen [18]. Edelleen, eri tutkijat ovat väittäneet, että pp32 on ehdottomasti ydin- tai sytoplasmista. Brennan

et al.

Ensimmäinen kuvattu pp32 kuin proteiini, joka voi shuttle välillä tumaan ja sytoplasmaan yhdessä Hur [18]. Tämän työn perusteella olemme pyrkineet tutkimaan toiminnallisia yhteyksiä pp32 ja Hur osalta haimasyövän solujen eloonjäämistä (eli syöpäsolujen kasvua ja GEM teho).

Methods

perustaminen isogeenisistä pp32 -overexpressing ja ohjaus solulinjat

MiaPaCa2-solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Täyspitkä pp32 cDNA subkloonattiin plasmidiin pc3.1 Zeo (Invitrogen), joka on hallussaan Zeocin ™ resistenssigeenin valintaa, kuten aiemmin on kuvattu [14], [23].

Kunkin näytteen, 5 ui of VERIFY antigeenin Standard Origene yliekspressio lysaattia (1 ug /1UL) laitettiin 5 ui 2x SDS Sample Buffer (Origene Rockville, Maryland). Yliekspressio pp32, Hur, tai tyhjä vektori ajettiin jonka pCMV6-Entry Vector plasmidi, joka lisäsi C-terminaali Myc /DDK tunnisteen kunkin geenin (Origene). Näytteet valmistettiin ja sitten ladattiin NuPage 10% Bis-Tris Gel ja erotettiin 200 volttia 60 minuutin ajan. Proteiinit siirrettiin sitten PDVF kalvon 30 voltilla 90 minuutin ajan. Membraani blokattiin 1 tunnin ajan. Kalvot tutkittiin ensisijaisen vasta-aineita (tymidylaattisyntaasin, dCK, pp32, Hur ja alfa-tubuliinin; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) yön yli. Pitoisuudet perus-vasta olivat seuraavat: Hur 1:1000, dCK 1:500, TS ja alfa tubuliinin 1:200. Testattiin vasta-aineet pestiin sitten TBST-liuokseen, ja toisen vasta-ainetta Santa Cruz vuohen anti-hiiri-IgG-HRP-vasta-ainetta pitoisuutena 1:10,000. Sitten membraanit pestiin ja kehitettiin käyttäen Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate tunnistusjärjestelmä (Millipore, Billerica, MA).

Ohimenevä transfektio pp32 ekspressiovektoriin ja siRNA varten ribonukleoproteiini immunosaostuksella sitoutumisen (RNP-IP) määritykset.

Ohimenevä transfektio suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. siRNA pudotus suoritettiin käyttäen pp32 suunniteltu pieni häiritsevä siRNA (Dharmacon, Thermoscientific) käyttämällä Oligofectamine (Invitrogen), kuten aiemmin on kuvattu [9], [23]. Lyhyesti, haimasyövän solulinjoissa PL5 ja MiaPaca2 solut maljattiin 60% konfluenssiin ja transfektoitiin Oligofectamine ja Optimem (Invitrogen) käyttäen pp32 siRNA ja negatiivinen kontrolli hajotus- sekvenssin (Dharmacon). Solut kerättiin 48 tunnin kuluttua immunoblot, herkkyys määrityksiä, ja RNP-IP määrityksissä.

eristäminen RNA: n ja genomisen DNA: n havaitseminen plasmidien

Vahvista yliekspressio ja vähentäminen pp32-mRNA solun linjat, semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin. MiaPaCa2 pp32-transfektoitujen (Mia.pp32) ja tyhjän vektorin (Mia.EV) solut trypsinoitiin ja kerättiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [25] ja myös luotu tehdä novo käyttäen aikaisemmin tuotettu ja ostettu vanhempien haimasyöpä solulinja (ATCC, Manassas, VA ). Genominen DNA eristettiin Mia.pp32 ja Mia.EV solulinjojen ja plasmidin integraatio varmistettiin suorittamalla PCR: llä eteenpäin spesifinen aluke T7-plasmidin sekvenssi ja reverse-aluketta, joka on spesifinen pp32: FWD 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ’ , REV 5’-CAGGTTCTCGTTTTCGCTTC-3 ’.

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy RNA: n eristys-kittiä (Qiagen), ja sitten käsiteltiin Turbo-DNA

(Ambion, Austin, TX) ja poistaa pieniä määriä gDNA [25].

ribonukleoproteiini immunosaostus (RNP-IP) ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR).

Solut maljattiin 65% konfluenssiin ja käsiteltävä ilmoitetulla. Immunosaostus suoritettiin käyttäen joko anti-Hur tai anti-IgG-kontrollivasta-aineita, kuten aiemmin on kuvattu (MBL International, Woburn, MA) [23], [26]. RT-PCR suoritettiin sitten sen jälkeen, kun massa normalisointi RNA-näytteet, tuottaa cDNA: ta. Optinen tiheys cDNA mitattiin ja RT-kvantitatiivista PCR: ää (qPCR) suoritettiin ABI 7500 väline; 75 ng cDNA-templaattia käytettiin reaktiota kohti määrittämään suhteellinen runsaus dCK, VEGF, ja Hur mRNA: t; näytteet normalisoitiin GAPDH-mRNA-tasoja.

SDS-PAGE /Western-blottaus

Mia.pp32 ja Mia.EV solut trypsinoitiin ja kokosolulysaateista saatiin käyttäen RIPA lyysipuskuria. Proteiini kvantitointi suoritettiin käyttäen Bradfordin menetelmällä (BioRad, Hercules, CA). Näyte pitoisuudet tasoittuvat käyttäen RIPA. Näytteet sekoitettiin sitten 01:01 2X Laemmli-puskuria ja erotettiin käyttäen 10% Bis-Tris polyacrylimide geelin 1x MOPS-ajopuskurissa ja proteiinit siirrettiin ja blotattiin mainituilla vasta-aineilla, kuten aikaisemmin edellä on kuvattu [13].

immunofluoresenssilla

Mia.pp32 ja Mia.EV solut maljattiin kammion liukuu ja käsiteltiin osoitetuilla lääkkeillä. Käsittelyn jälkeen solut pestiin PBS: llä, inkuboitiin osoitetun vasta-aineen ja käsitellään kuten aikaisemmin on kuvattu [23]. Solujen tumat värjättiin DAPI ja kammio dioja asennettiin analysoitavaksi Zeiss LSM-510 konfokaali Laser mikroskooppi.

Sytoplasmiset uutteet

MiaPaCa2 solut maljattiin 60% konfluenssiin. Kuuden tunnin käsittelyn jälkeen 1 uM gemsitabiinin (Eli Lilly) tai ilman hoitoa, sytoplasmisen uutteet valmistettiin, kuten on kuvattu [23], [26], ja immunoblot-analyysi suoritettiin [23] käyttämällä primaaristen vasta-aineiden, joka tunnisti Hur (3A2, 1:1000, Santa Cruz), hnRNP tai pp32 (1:500) [13].

Growth määrityksessä

käyttäen samaa transfektioprotokolla edellä on esitetty, MiaPaCa2 vanhempien solut transfektoitiin yhtä suuret määrät pp32 koodaavan ja tyhjät pcDNA T-75-pulloihin. Kasvualusta vaihdettiin ja Zeocin ™ valikointi suoritettiin, kuten edellä on kuvattu. Lopussa kahden viikon ajan, väliaine aspiroitiin ja pulloja värjättiin kristalliviolettiliuoksella 20 minuuttia, jonka jälkeen perusteellinen pesua tai solut laskettiin, kuten on kuvattu kuvassa legenda.

Drug Herkkyys Analyysit

Herkkyys analyysit suoritettiin käyttäen PicoGreen ™ (Invitrogen), joka on fluoresoiva väriaine, joka sitoutuu selektiivisesti kaksijuosteista DNA: ta. Intensiteetti fluoresoivan signaalin korreloi elinkykyisten solujen lukumäärän. Lyhyesti, 2000 solua maljattiin kuoppaa kohti 96-kuoppaiselle levylle ja käsiteltiin 24 h myöhemmin [23]. Kemoterapeuttiset aineet hankittiin Sigmalta ellei toisin ole mainittu.

RNA-sitoutumismääritykset

ribonukleoproteiini immunosaostusta (RNP-IP) analyysi, MiaPaca2 solut maljattiin 65% konfluenssiin, käsiteltiin 24 h myöhemmin 1 uM gemsitabiinin 3 tuntia ja IP suoritetaan käyttäen joko anti-Hur tai IgG kontrollivasta-aineiden, kuten on kuvattu [23], [26]. Sen jälkeen, kun RNA: n eristys, dCK mRNA-tasot mitattiin PCR-analyysillä käyttämällä alukkeita TCTCTGAATGGCAAGCTCAA ja CTATGCAGGAGCCAGCTTTC [23].

Immunohistokemia ja potilaan näytteitä

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotettu lohkojen käsiteltiin, kuten on kuvattu [ ,,,0],23] lämmön antigeeni haku ja avidiini-biotiini monimutkainen havaitsemiseen. Immunovärjäys suoritettiin 37 resektoitiin PDA yksilöitä Thomas Jefferson University patologia arkistoon jälkeen Thomas Jefferson University Institutional Review Board (IRB). Me kiinni kaikki eettiset näkökohdat tässä. Kaikki potilaan näytteitä käytettiin alla Thomas Jefferson University Institutional Review Board (IRB) hyväksytyn tutkimussuunnitelman. Niinpä tämä tutkimus suoritettiin 100% potilaan suostumusta. Ei uusia solulinjoja, syntyy suoraan ihmisen kudoksesta käytettiin tässä tutkimuksessa. Suostumus on kirjoitettu. IRB hyväksyntä otsikko on ”Collection, pankki, ja arviointi kudoksissa, veren, haiman mehu ja sappi potilailta, joilla haiman ja liittyvät karsinoomat joille kirurginen resektio.” Mukaisesti Yhdysvaltain terveys- ja sosiaaliministeriön (IRB hyväksytty). Suurin osa potilaista sai GEM yksin tai yhdistelmänä Xeloda- tai sädehoitoa. Tunnistavien vasta-aineiden pp32 [14] tai Hur [23] käytettiin aiemmin [23]. Solusijaintipaikan (ydin- vs. sytoplasman) ja värjäyksen voimakkuuden (vahva versus heikko) pisteytettiin. Perustuen prosenttiosuus värjättyjen solujen ( 50% vs. 5-50%) ilmaisulla pisteytettiin levinnyttä tai polttovälin, vastaavasti. Survival käyrät luotiin käyttäen GraphPad Prism (versio 4.0) ja p-arvot laskettiin käyttäen log-rank (Mantel-Cox) testi.

Tulokset

karakterisointi pp32 yliekspressoivassa solulinjojen

Plasmidi integroitumista MiaPaCa2-soluissa varmistettiin monistamalla PCR: llä genomi-DNA: ta (tuloksia ei ole esitetty). Kuvio 1 kuvaa vahvistuksen pp32-proteiinin yli-ilmeneminen Mia.pp32 solulinjassa suhteessa Mia.EV. Yhtä suuri kuin proteiinin loading vahvistettiin värjäämällä kalvosta käyttäen Fast Green (kuvio 1A). Vahva ydinvoima läsnäolo pp32 vuonna Mia.pp32 soluissa havaittiin immunofluoresenssilla (kuvio 1 B). Määräajoin immunoblot-analyysi suoritettiin vahvistamaan jatkuu yli-ilmentymisen pp32-proteiinin Mia.pp32 soluissa (kuvio 1).

(A) immunoblot-analyysi proteiinin teissa Mia.pp32 solujen ja valvontaa. Mia.pp32 ekspressoi kasvoi pp32 tasolla kuin Mia.EV soluja. (B) Immunofluoresenssi Mia.pp32 ja Mia.EV solut (

Top). Immunofluoresenssikoe suoritettiin myös merkintöjä Hurin pp32 ja DAPI alla suurennettuna (

alhaalla

). Sitten solut analysoitiin käyttäen laser konfokaalimikroskopialla. (C) Mia.pp32 solut ovat merkittävästi vähentäneet kasvupotentiaalia suhteessa Mia.EV soluihin. (

Left

) Solut yhtä pinnoitettu ja kerättiin vuorokausina 3 ja 5 ja laskettiin. Viisinkertainen vähemmän Mia.pp32 solusta, laskettiin 5 päivää verrattuna Mia.EV soluihin. (

Oikea

) MiaPaCa2-solut transfektoitiin yhtä suuret määrät pp32 ja tyhjät pcDNA 3.1 (Zeo). Pullot käsiteltiin samalla tavalla yli kahden viikon ajan ja sen jälkeen värjättiin kristallivioletilla kvantitoimiseksi elinkykyisten solujen lukumäärän (katso menetelmät). Kuhunkin pulloon on tyypillinen 3 pulloihin.

haimasyöpä solut ovat merkittävästi vähentynyt kasvupotentiaalia kontrollisoluihin verrattuna.

lukuisia yrityksiä kehittää Hs766T ja PL5 solut yli-ilmentävät pp32 epäonnistuivat, kun taas tyhjän vektoriplasmidi syntyy pesäkkeitä rutiininomaisesti (julkaisemattomia tietoja, katso menetelmät) [14]. Samanlaisia ​​tuloksia on kuvattu aiemmissa tutkimuksissa [8], [14].

Mia.pp32 soluja tarvitaan rutiininomaisesti harvemmin siirrostamalla kuin Mia.EV soluja. Kasvu määrityksissä (kuvio 1 C,

jäljellä

) suoritettiin kuten on kuvattu (katso menetelmät) paljasti, että päivällä 5 oli 5-kertainen vähemmän Mia.pp32 soluja kuin Mia.EV soluja. Huomautus tyypillinen logartihmic kasvua Mia.EV verrattuna pyöristetty, lineaarinen kasvu Mia.pp32. Emme havainneet merkittäviä solukuoleman joko solulinjassa että subkonfluenteista tilassa, tukee päätelmää, joka vähensi solujen kasvua, pikemminkin kuin apoptoosin, oli dramaattinen ero solumäärät, kuten aiemmin on kuvattu [14].

transfektoitiin pp32 ja tyhjän vektoriplasmidit saman verran vanhempien MiaPaCa2 soluja. Dramaattinen väheneminen kasvun MiaPaCa2-soluissa, jotka on transfektoitu pp32 havaittiin verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla. Havaitsimme, vähenee merkittävästi värjäytymistä pp32-transfektoiduissa pulloon (kuvio 1C,

oikea

), mikä osoittaa vähentynyt kasvupotentiaalia näiden solujen kontrolliin verrattuna. Yhdessä nämä kokeet sulkea pois mahdollisuutta, että pp32 vähensi solujen lisääntymistä johtuen aseman vaikutus kirjavassa ”johtuva satunnainen integrointi geeni toivottuja alueelle genomissa.

Drug herkkyys määritykset paljastivat Mia.pp32 solujen resistenttejä nukleosidi- analogeja

Kun on stabiilisti transfektoitu Mia.pp32 ja Mia.EV solulinjat perustettiin, soluja käsiteltiin eri kemoterapeuttisten aineiden eri lääkeryhmien (taulukko 1). Useimpien lääkkeiden, kuten etoposidin, sisplatiinin, oksaliplatiini (kuvio 2A), syklofosfamidi ja paklitakseli (kuvio 2B, katso taulukko 1 huumeiden kurssikuvausten) vain vähäinen muutokset kemosensitiivisyys nähtiin välillä Mia.pp32 ja Mia.EV soluja (taulukko 1 ja Kuvio 2A ja B). Lisäksi osa-linja pp32 transfektoitujen solujen (Mia.pp32-2) sisällytettiin kokeellisen ohjaus, ja eroja havaittiin kaikkien pp32 yli-ilmentävät solulinjat ja tyhjän vektorisäätö soluja, mikä sulkee pois artefakti kloonauksen (kuvio 2 ). Sekä Mia.pp32 linjat ja Mia.EV lisääntyneet samaan tahtiin, kuten on osoitettu merkityksetön havaitut erot solussa surivival prosenttiosuudet välillä solulinjoissa äärimmäisen pieniä annoksia ja keskittyminen kunkin lääkkeen testattu (kuviot 2A-C).

Survival of Mia.pp32 ja Mia.EV linjat mitattiin PicoGreen määrityksen jälkeen 5-7 päivää inkubaation osoitetun lääkeannoksia. (A) Lääkkeet, jotka aiheuttavat ei pp32-riippuvainen herkkyys; (B), huumeet osoittaa vaatimaton eroja herkkyydessä; (C) lääkkeet, joille pp32 siirrettävä erityisen kestäviä. Käyrät edustavat yksittäisiä kokeita (S.E.M.); Jokaisessa kokeessa on tyypillinen kolme yksittäistä kokeita. Mia.pp32 linjat on merkitty ▴▪ ja tyhjän vektorin kontrolli solut on merkitty ♦.

oli vähäinen herkkyyden lisääntyminen Mia.pp32 linjat proteiinikinaasi C estäjä staurosporiini (STS) verrattuna Mia.EV (kuvio 2B,

oikea

). Mia.pp32 solut kaksi kertaa herkempi 5-FU verrattuna Mia.EV soluja (kuvio 2C,

vasemmalle

). Kuitenkin dramaattisin muutos merkittiin lääkeaineilla samaan luokkaan, jotka käyttävät dCK solumetabolialle: GEM ja sytarabiini (ARA-C) (taulukko 1 ja kuvio 2C,

keskimmäinen ja oikea

). Mia.pp32 solut näytetään kymmenen kertainen resistenssi GEM verrattuna Mia.EV, ja 2-kertainen resistenssi ARA-C (taulukko 1 ja edustavia tietoja, kuvio 2C,

keskellä

).

siRNA knockdown endogeenisen pp32 ilmaisun herkistää soluja gemsitabiiniannokseen

haimasyövän solulinja PL5, jossa runsaasti pp32 ilme, transfektoitiin käyttämällä joko pp32 siRNA tai kontrolli salattu järjestyksessä. Knockdovvn pp32 ekspressio (Kuva 3A) sulatettu soluja noin 3-kertaiseksi herkempi GEM kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 3B). pp32 Knockdown ei vaikuttanut solujen elävyyden seuraava etoposidia (negatiivinen kontrolli) käsittely (kuvio 3C). Emme havainneet mitään muutoksia solujen kasvun parametrit tai solujen fenotyyppi pp32 siRNA soluja.

(A) immunoblottianalyysi pp32 runsautta lysaatit PL5 soluista 48 tuntia transfektion jälkeen. Transfektoiduissa soluissa, kuten on selitetty (A), herkkyys GEM (B) tai etoposidi (C) testattiin PicoGreen solujen eloonjäämistä määrityksessä.

yli-ilmentyminen ja vähentää pp32 häiritsee VEGF Hur, ja dCK mRNA transkriptin sitoutuminen HUR ja vähentää dCK proteiinin ilmentymiseen

Aiemmin osoitimme, että dCK mRNA sitoutuu HUR mikä parantaa dCK proteiini käännös [23]. Me manipuloitu pp32 ekspressiotasot (kuvio 4A) in isogeenisiin syöpäsoluissa ja sitten kvantitatiivisesti yhdistyksen tunnettujen Hur mRNA tavoitteet dCK [23], verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) [27], ja Hur [28] mRNA: iden Hur by ribonukleoproteiinin immunosaostus (RNP-IP) määritys edellä kuvatulla [23]. Kun lyhyt GEM käsittely, yhdistyksen välillä Hur ja dCK mRNA havaittiin MiaPaCa2 soluissa (kuvio 4B). Kuitenkin merkittävä väheneminen dCK, VEGF, ja Hur mRNA: t havaittiin Hur-vasta-aine-immunosaostettiin-solujen RNA yli-ilmentävät pp32 (kuvio S1 ja kuvio 4A ja B); kun taas pp32 siRNA-transfektoiduissa soluissa merkittävä, yhdenmukainen parannus ( 4-kertaisesti) dCK, VEGF, ja Hur mRNA: t sitoutuneen Hur (kuvio 4A ja B). Kertamuutoksia määritettiin vertaamalla HUR-vasta-immu–RNA: iden transfektoiduista soluista tyhjentää vektori transfektoituja soluja, joilla on normaali, endogeenisen pp32 ekspressiotasot. Spesifisyyden, arvioimme ja ei löytänyt mitään sitovaa GAPDH ja pp32-mRNA: iden (kuvio 4B ja tuloksia ei esitetty). Kuvassa S1 esittää dramaattinen vaikutus vakaan yliekspressio pp32 (Mia.pp32 solut) olla dCK mRNA sitoutumiseen Hur.

(A) pp32-mRNA-tasot normalisoidaan GAPDH mRNA tasot tyhjä vektori transfektoituja soluja, pp32 siRNA transfektoituja soluja, ja pp32 plasmidi transfektoitiin soluihin. Numero osoittaa kertainen muutos pp32-mRNA ilmaisun leimatun syntyy solulinjojen verrattuna tyhjän vektorin kontrolli soluja. (B) Hur VEGF: ään sitoutumisen ja dCK mRNA: t havaittiin RNP-IP-analyysi MiaPaCa2-soluissa, jotka on transfektoitu pp32 siRNA, pp32 plasmidin tai tyhjän vektorin kontrolli (A). mRNA tasot HUR ja IgG IP näytteet ensin normalisoitiin GAPDH mRNA-tasoja samassa IP reaktioita, ja sitten piirrettiin suhteellinen kertaiseksi rikastamiseen VEGF, dCK ja Hur mRNA Hur IP vs IgG IP. Tiedot osoittavat keskiarvo 3 itsenäisestä datapisteitä. Kaksi itsenäistä kokeet suoritettiin, jotta tulosten varmistamiseksi. Numerot osoittavat kertainen muutokset verrattuna IgG-kontrolli. (C) Western blot-analyysi pp32 ja dCK ekspressiotasot proteiinin teissa Mia.pp32 ja Mia.EV soluja. (D) Kolme kaistaa edustavat lysaatit HEK293T soluista tuotettu jotka joko vasemmalta oikealle: yli-ilmentää Hur, tyhjän vektorin tai pp32 koodattu myc /DCK. Western blot-analyysi sisältyvät vasta-aineet tunnistamaan pp32, Hur, dCK, alfa-tubuliinin, ja tymidylaattisynteesin (TS) proteiineja.

Lisäksi huomasimme, että dCK proteiini pitoisuus väheni Mia.pp32 soluissa verrattuna kontrollisolut (kuvio 4C). Lopuksi, käytimme eri soluviljelymalli vahvistaa nämä havainnot. Proteiini lysaatit Human HEK293T soluista (katso menetelmät), jotka yli-ilmentyy Hur pp32 ja ohjaus- vektorin. Validointi HUR ja pp32 yliekspressio varmistettiin immunoblottauksella (kuvio 4D). Kuten odotettua, olemme havainneet parannettu dCK proteiinin ilmentymistä Hur yli-ilmentyminen lysaatit [23], kun vertailuryhmän ja laski dCK proteiinin ilmentymistä pp32 yli-ilmentyminen lysaatit verrattuna kontrolliin (kuvio 4D). Alfa-tubuliinia ja tymidylaattisynteesin käytettiin osoittamaan yhtä suuri Proteiinilisäyksen. Nämä tiedot vahvistavat, että dCK ylössäädellään olosuhteissa, kun Hur yli-ilmennetään ja vaimentua olosuhteissa, kun pp32 yliekspressoidaan. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että pp32 voivat vaikuttaa sekä dCK mRNA sitoutumalla HUR ja dCK proteiinin ilmentymisen (kuva 4).

STS ja GEM parannettu sytoplasman pp32 runsaus

vahvistaneet aikaisempien raporttien [29 ], että STS voi lisätä pitoisuudet sytoplasmassa sekä Hur ja pp32 syöpäsoluissa (kuvio 5A). Samoin GEM hoito lisäsi pp32 sytoplasmisen runsaasti, mutta vähemmässä määrin kuin Hur (kuvio 5A). Kasvu pp32 ja Hur pitoisuudet sytoplasmassa jälkeen GEM hoidon arvioitiin Western blot -analyysillä (kuvio 5B). Ei muutosta pp32 ja Hur ekspressiota havaittiin kokosolulysaateista GEM-käsitellyistä soluista (kuvio 5B), kanssa edellisessä tuloksiin [23]. Seuranta tasot hnRNP (C1 /C2) vahvisti puhtaus sytoplasmisen lysaatit (kuvio 5B).

(A) immunof- oli lisääntynyt Hur ja pp32 sytoplasmista ekspressiota soluissa, joita käsiteltiin STS (1 uM: ssa 3 h ) ja GEM (1 uM 3 h), kuten on osoitettu valkoisilla nuolilla. (B) immunoblottianalyysi HUR ja pp32 tasoilla sytoplasman ja kokosolulysaateista valmistettiin soluista, jotka oli käsitelty kuten edellä (kuva 5).

Nuclear pp32 intensiteetti on biomarkkeri huonon ennusteen PDA mutta ei paranna ennustearvo HUR GEM hoitoon

erikseen havaita molemmat vahvat ja heikot ydin- ja sytoplasmista ekspressiota sekä HUR ja pp32 PDA yksilöt [14], [23] (taulukko 2 ja kuva 6A, Hur,

vasemmasta paneelista

ja pp32,

oikea paneeli

). Kaikkien hoidettujen potilaiden GEM (n = 31) [23], pp32 ydin- intensiteetti eivät korreloineet merkittävästi GEM vaste osalta kokonaiselinaikaa (kuvio 6B). pp32 ydinvoiman ekspressiotasoja yhdistettynä Hur soluliman tila (kuviot 6C ja D) ei lisännyt ennustearvo Hurin yksin merkkiaineena GEM vasteen (p = 0,0009, data osoittaneet [23]). Löysimme vaatimaton yhdistyksen välillä pp32 ja Hur solunosasijaintia ekspressiotasot (taulukko 3). Taulukossa 2 kuvataan yhdistyksen välillä alhainen ydin- pp32 tasoja ja aggressiivisempia kasvaimia (korkeampi laatu, p = 0,0002, ja positiivinen imusolmuke etäpesäke, p = 0,0069, taulukko 2). Tämä näyttö tukee aiempien havaintojen erillisessä kliinisessä datajoukon, jotka osoittavat, että alhainen pp32 ilmaisu korreloi huonosti eriytetty PDA [14], [15].

(A) runsaudella ja solunosasijaintia Hur (

vasen

) ja alhainen poissa ydinaseiden pp32 lauseke (

oikeus

) näytteissä haimasyövän potilaat arvioitiin immunohistokemiallisesti; suurennos, 200x. Näytteet edustavat kohortin analysoitiin B-D. (B) välinen korrelaatio pp32 ydin- ilmaisun ja vaste GEM hoitoon (p = 0,3, log rank -testi). (C) välinen korrelaatio ydinvoiman pp32 ilmentävä kasvain näytteet kerrostuu korkea tai matala HUR aseman suhteen GEM vasteen (p = 0,88, log rank -testi). (D) välinen korrelaatio korkea sytoplasminen Hur ilmentävä kasvain näytteet ositettu osaksi korkea ja matala pp32 ydinvoiman ilmaisu korreloi GEM vaste (p = 0,25, log rank -testi).

Keskustelu

Lukuisat tutkijat ovat toisistaan ​​riippumattomasti tunnusomaista, pp32 kuin tuumorisuppressoriproteiinia erilaisissa kokeellisissa malleissa [8], [9], [12], [13], [30], [31]. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että pp32, läpi tietyn toimialueen koostuu z25 aminohappojen toiminut kuten kasvain vaimennin estämällä K-ras, mutantti p53, c-jun, E1A, E6 ja E7 [12], [13]. Löysimme vahvan korrelaation sekä korkea-asteen kasvaimet ja imusolmuke etäpesäke heikoilla pp32 ydin- lauseke (taulukko 2), joka tukee meidän aikaisempia havaintoja, pp32 toimii tuumorisuppressoriproteiinia PDA [14]. Tuloksemme viittaavat siihen, että pp32 ekspressiotasoja suoraan häiritä tai helpottamaan Hur: n kykyä tukea syövän solujen elinkelpoisuuden ja lisääntymisen häiritsemällä stabilointi mRNA-transkriptien, jotka koodaavat proteiineja tarpeen kasvainsolujen eloonjäämisen, kuten dCK, VEGF, tai Hur (kuvio 7). Oletamme, että läsnäolo pp32 voi häiritä HUR: n rooli tuettaessa kasvainten synnyssä ja syövän solujen eloonjäämistä, kun taas puuttuminen pp32 helpottaa kasvaimien syntyyn. Työmme tukee ja laajenee yli vuosikymmenen tutkimus, joka on osoittanut, että pp32 toimii kuin tuumorisuppressorigeeniä useita malleja ja kasvainten [8], [9], [11], [12], [13], [30] , [31], [32] (kuva 7).

vasemmalla puolella näkyy skenaario, jossa pp32 on huonontunut tai puuttuu (kasvaimen kehittymisen) ja Hur on käytettävissä liittää ja vakauttaa mRNA: iden, jotka tukevat syöpäsolun selviytymistä ja elinkelpoisuus. Oikealla puolella on skenaario, jossa pp32 on läsnä (tuumorisuppressiogeeneksi) ja Hur ei voi sitoutua mRNA: iden tärkeä syöpäsolun selviytymisen. Huomautus: GEM on todennäköisemmin metaboloituvan sen aihiolääkemuodoksi sen aktiivisen metaboliitin dCK skenaariossa vasemmalla.

modulaatio pp32 ilmaisun yli-ilmentyminen tai Äänenvaimennusjärjestelmä muuttanut herkkyyttä syöpäsolujen nukleosidi analogien GEM ja ARA-C (kuviot 2C ja 3). Edelleen, tehostettu tai vähentynyt pp32 ekspressiotasot suoraan muuttanut vuorovaikutusta Hur kanssa dCK mRNA (kuvat 4) ja vähensi merkitsevästi dCK proteiinin ilmentymisen (kuviot 4C ja D). Nämä tulokset osoittavat, että pp32 on rooli Hur n transkription jälkeisen sääntelyn dCK. Me todentaa aiemmin raportoi, että sytoplasminen pp32 tasot voivat lisätä läsnäollessa erityisten stressitekijöiden [22], [33]. Ehkä eri stressitekijät kuljettaa eri pp32-geenin perheenjäsenten kanssa Hur. Esimerkiksi Fries B

et al.

Osoitti, että

huhtikuu

eikä pp32 toimii ligandina ja voi auttaa Hur sen transkription säätelyyn CD83 [33]. Jäsenet pp32 proteiinin perhe (esim huhtikuu, pp32r1, pp32) todennäköisesti tarjota lisää sääntelymenetelmistä HUR ja sen kohde-mRNA: [31].

Vaikka tiedot antavat vahvaa näyttöä siitä, että pp32 moduloi HUR tehtävänä, kliinisen tiedot osoittavat, että ennen hoitoa, endogeenisen pp32 ilmaisun ja solunosasijaintia ei muuta Hur n ennustearvo GEM vasteen (kuva 6). Lisäksi, kun taas assosioitunut pp32 ja Hur solunosasijaintia kasvaimen yksilöt (taulukko 3) perusteella näyttää siltä, ​​että kukin proteiini ei täysin säädellä solunosasijaintia muiden

in vivo

.