Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Mycoplasma hyorhinis

(

M.hyorhinis, M.hy

) liittyy kehittämiseen mahalaukun ja eturauhasen syöpiä. NLRP3 inflammasome, proteiinikompleksin ohjaamiseksi kypsymisen tärkeää proinflammatoristen sytokiinien interleukiini (IL) -1β ja IL-18, on myös kasvaimien syntyyn liittyvien ja etäpesäkkeiden eri syövissä.

Menetelmät /Principal Ensimmäisen

selventämään,

M.hy

edistää kasvainten kehittymistä kautta inflammasome aktivointia, analysoimme monosyyttien IL-1β ja IL-18-tuotanto

M.hy

haaste. Kun altistuu

M.hy

, ihmisen monosyyteistä näytteillä nopea ja kestävä IL-1β ja IL-18-eritys. Olemme lisäksi havainneet, että lipidien kalvoproteiini (LAMP) kohteesta

M.hy

oli vastuussa IL-1β induktio. Soveltamalla kilpailua estäjät, geenispesifisistä shRNA ja geenin kohdennettua hiiriä, olemme varmistaneet, että

M.hy

indusoi IL-1β eritys oli NLRP3 riippuva

in vitro

ja

in vivo

. Katepsiini B aktiviteetti, K

+ efflux, Ca

2+ virtaa ja ROS tuotanto olivat kaikki tarvittavat NLRP3 inflammasome aktivointi

M.hy

. Mikä tärkeintä, se on IL-1β, mutta ei IL-18 valmistettu makrofagien altistettiin

M.hy

edistänyt mahasyövässä solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että aktivointi NLRP3 inflammasome mukaan

M.hy

voi liittyä sen edistämiseen mahasyövän etäpesäke, ja anti-

M.hy

terapia tai rajoittamalla NLRP3 signalointi voisi olla tehokas lähestymistapa valvontaan mahalaukun syövän kehitykseen.

Citation: Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Xing Y, Wang X, et ai. (2013)

Mycoplasma hyorhinis

Aktivoi NLRP3 Inflammasome ja Edistää Migration and Invasion mahasyövän Cells. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10,1371 /journal.pone.0077955

Editor: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, Intia

vastaanotettu: 5. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty: 06 syyskuu 2013; Julkaistu: 06 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia 100 Talent Program Kiinan tiedeakatemia, Natural Science Foundation of China (91029707, 31170868), Shanghai Natural Science Foundation (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, SA-SIBS stipendiohjelmassa sekä avustusta National Key ohjelmat Infectious Disease (2012ZX10002007-003). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mykoplasmat ovat pleomorphic, seinä vapaa, prokaryoottisia organismeja, jotka sijaitsevat joko eukaryoottinen solukalvojen tai solujen sisällä, ja ne ovat pienimpiä organismeja pystyy itse lisääntymään [1]. Tähän mennessä ainakin 16 mykoplasmalajeja on eristetty ihmisistä [2].

Mycoplasma hyorhinis

(

M.hy

) katsottiin ei-patogeeninen ihmisille, koska se yleensä tarttuu sika johtaa hengitysteiden sairauksien ja tulehdus rinnassa ja nivelet [3], [4] . Kuitenkin, varaamiseen todisteet osoittavat, että

M.hy

infektio ihmisellä ei johda kliinisiä tuloksia.

M.hy

todettiin 56% mahalaukun karsinooma, 55% paksusuolen syöpä ja 52,6% ja keuhkosyöpä koepaloja [5]. Lisäksi 36% miehillä eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) ja 52% miesten eturauhassyövän ovat

M.hy

seropositiivinen. Nämä kliiniset havainnot viittaavat siihen mahdollisesta yhteydestä

M.hy

altistuksen mahalaukun, paksusuolen, keuhko- ja eturauhassyövät [5], [6].

Kun mikrobi-infektion, isäntä hahmontunnistus reseptorit ( PRRS), kuten TLR tunnistavat taudinaiheuttajia ja käynnistää synteesin pro-inflammatoristen sytokiinien, kuten pro-IL-1β ja pro-IL-18: n kautta NF-KB: n aktivaation. Samaan aikaan, toinen ryhmä PRRS lukien NLRP3 rekrytoida sovittimen proteiinin ASC ja johtaa kaspaasi-1, joka on aktiivinen proteaasi, joka pilkkoo esiaste sytokiinien muodossa, kuten pro-IL-1β ja pro-IL-18- kypsiksi, eritetyn muodon [7]. Taudinaiheuttajia tai haastava aineet aiheuttavat kaliumin ulosvirtausta, mitokondriot vahinko, mitokondriot DNA julkaisu, ROS tuotanto, solunsisäisen kalsiumin lisäys tai solujen syklisen AMP väheneminen synnynnäisen immuunijärjestelmän soluja, jotka kaikki osallistuvat kaspaasi-1 aktivointi [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Tänä prosessin NLRP3, ASC ja prokaspaasia 1 muodostavat molekyyli- alustan nimeltään inflammasome. Tähän mennessä useita inflammasomes on tunnistettu, ja Heille NLRP3 inflammasome on yhteydessä esiintyvistä kasvaimen kehittymisen [14], [15], vaikka kiistaa esiintyy eri mallit [16], [17]. Kuitenkin, IL-1β: n raportoitiin edistää kasvainsolujen kasvua ja etäpesäkkeiden indusoimalla useita pro-metastaattisen geenejä, kuten matriksin metalloproteinaasien ja endoteelisolujen adheesiomolekyylien, sekä TGF-β, kemokiinit ja kasvutekijät [18]. Vuonna Korean väestö, yhdistelmä lisääntynyt limakalvon IL-1β tason ja homotsygoottisiksi IL-1β -31T yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) voivat molemmat aiheuttaa lisääntynyt riski mahasyövän [18]. Lisäksi Tu et al. havaittiin, että vatsa-ekspressio ihmisen IL-1β siirtogeenisissä hiirissä johtaa spontaaniin mahalaukun tulehdus ja syöpään [19], joka lisäksi viittaa siihen, että IL-1β voi edistää ihmisen mahasyövän. Sitä vastoin, IL-18 tehostaa NK-solujen aktiivisuutta, vähentää kasvaimen kehittymisen, indusoi apoptoosia ja estää angiogeneesin kasvainsoluissa käyttämään antituumorivaikutuksia [20], [21]. Lisäksi, sopimattoman IL-18: n havaittiin myötävaikuttaa patogeneesiin syöpien ja voi vaikuttaa kliiniseen lopputulokseen potilailla [22]. IL-18 oli raportoitu stimuloivan matriisi–9 tuotanto, mikä lisää muuttoliikkeen ja hyökkäyksen sepelvaltimon sileälihassolujen ja HL-60 myelooinen leukemia solujen [23], [24]. On myös raportoitu, että seerumin IL-18-tason mahasyövän potilasryhmässä oli merkittävästi suurempi kuin vuonna mahahaava potilasryhmässä [25] ja IL-18 voi lisätä etäpesäke ja immuunijärjestelmän karkaamisen mahasyöpä kautta alas-säätely CD70 ja ylläpito CD44 ihmisen mahasyövän solulinjaa NCI-N87 ja SNU16 [26]. Se on myös tärkeä välittäjäaine VEGF-lisätä maastamuuttoa ihmisen mahasyövän solulinjoissa SNU-601 [27]. Edellä esitetyt havainnot osoittavat, että

Mycoplasma hyorhinis

voi edistää muuttoliikettä ja invaasion mahasyövän solujen aktivoimalla inflammasome.

Toistaiseksi laaja kirjo mikrobeja kuten viruksia, bakteereita, sieniä ja alkueläimiä ovat olleet tunnistettu aktivoida NLRP3 inflammasome [28]. Tuore tutkimus osoitti, että

Mycoplasma pneumoniae

kykeni myös indusoimaan IL-1β tuotantoa ihmisen soluissa [29]. Kuitenkin, onko

M.hy

, joka on tärkeä tekijä mahalaukun syövän kehitykseen, kuten edellä on mainittu [5], [30], [31], aktivoi NLRP3 inflammasome ja onko tämä aktivointi edistää mahalaukun syöpä kehitys ei vielä tunneta. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että

M.hy

laukaisi IL-1β eritystä NLRP3 inflammasome riippuvaisella tavalla, ja tuloksena IL-1β aiheuttama muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja.

tulokset

M.hy

käynnistimet IL-1β ja IL-18-tuotanto THP-1 solut

Voit selvittää

M.hy

indusoi IL -1β tuotannon synnynnäisen immuunijärjestelmän solut, tarkkailtiin kypsän IL-1β tasot ihmisen monosyyttisolulinjassa THP-1-solut altistettiin eri määriä

M.hy

. Tässä kokeessa vahva induktio IL-1β annoksesta riippuvalla tavalla ei havaittu (kuvio 1A). Seuraavaksi mittasimme pro-IL-1β mRNA-tasoja soluissa ja kypsän IL-1β-proteiinin tasot viljelmäsupernatanteissa eri ajankohtina sen jälkeen

M.hy

haaste. Havaittiin, että IL-1β mRNA-tasot olivat korkeimmillaan 3 tuntia altistuksen jälkeen (kuvio 1 B) ja kypsän IL-1β (kuvio 1C) ja IL-18 (kuvio 1 D) proteiini oli korkeimmillaan 12 tuntia altistuksen jälkeen. Lisäksi, THP-1 johdettujen makrofagien on myös esillä vankka eritystä IL-1β, IL-18 sekä muiden inflammatoristen sytokiinien, kuten IL-6 ja IL-8 (kuvio 1 E, kuvio S1). Vahvista yllä havainnoista THP-1-solulinjassa, tutkimme IL-1β tuotantoa ensisijainen ihmisen monosyyteissä terveiltä luovuttajilta altistettiin

M.hy

, jossa IL-1β myös vahvasti aiheuttama (kuvio 1 F) . Nämä tiedot osoittivat, että

M.hy

laukeaa vahva IL-1β: n ja IL-18-eritystä ihmisen myeloidisoluissa.

A, 5 x 10

4 THP-1-soluja käsiteltiin

M.hy

eri annoksilla, 12 tuntia myöhemmin supernatantit kerättiin IL-1β ELISA. BD, 2 x 10

5 THP-1-soluja käsiteltiin

M.hy

pitoisuutena 6,7 ​​x 10

7 CCU /ml, solut ja supernatantit kerättiin eri ajankohtina IL-1β mRNA: ta (B) ja IL-1β (C) sekä IL-18-proteiinin (D) havaitseminen reaaliaikaisella-PCR: llä ja ELISA: lla, kuten osoitettu. E-F, 5 x 10

4 PMA aiheuttama makrofagien (E) ja ihmisen ensisijainen monosyytit (F) hoidettiin

M.hy

, 12 tuntia myöhemmin supernatantit kerättiin sytokiinien ELISA. Arvot edustavat keskiarvoa ± keskihajonta (SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. *** Edustaa P 0,001, ** edustaa P 0,01 ja * edustaa P 0,05 verrattuna ohjaus tilastollinen analyysi.

LAMP johdettu

M.hy

on vastuussa IL-1β induktio läpi TLR2

Seuraavaksi, tutkimme replikaatiota

M.hy

vaadittiin IL-1β tuotantoa monosyyteissä. Kuten on esitetty kuviossa 2A,

M

.hy

inaktivoitiin kuumentamalla tai UV-(UV) indusoi yhtä paljon IL-1β eritystä THP-1-soluja, kuten live

M .hy

. Tämä osoitti, että tietyt lämpöä ja UV-kestävä komponentti

M.hy

oli vastuussa induktion IL-1β eritystä. Lipid kalvoproteiini (LAMP) on ekspressoidaan runsaasti pinnalla

M.hy

[32], ja edellisessä tutkimuksessa havaittiin, että kalvo lipoproteiinien muista mykoplasmalajeja indusoi IL-1β eritystä [33]. Olemme siis arveltu, että

M.hy

johdettu LAMP (MLAMP) voi olla vastuussa IL-1β induktio THP-1-soluissa. Sitten uutetaan LAMP päässä

M.hy

(kuvio 2B) ja testattiin kyky MLAMP indusoida IL-1β eritystä THP-1-soluissa. Olemme havainneet, että MLAMP selvästi indusoimaa IL-1β annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas vesifaasi

M.hy

uute ei voi tehdä niin (kuvio 2C). Jos haluat jättää mahdolliset RNA ja /tai DNA saastumisesta MLAMP, käsittelimme MLAPMs RNaasi ja DNaasia ja totesi, että MLAMP oli pääkomponentti IL-1β induktion (kuvio S2).

A, 5 x 10

4 THP-1-soluja käsiteltiin lämmöllä tai ultravioletti- säteilytys inaktivoitu

M.hy

6 tuntia ja supernatantit kerättiin IL-1β ELISA. B, yhteensä proteiini

M.hy

, MLAMP uutetaan

M.hy

ja vesipitoinen proteiini havaittiin SDS-PAGE: lla ja hopeavärjäyksellä. C, 5 x 10

4 THP-1-soluja käsiteltiin MLAMP eri pitoisuuksina ja vesipitoista, 6 tuntia myöhemmin supernatantit kerättiin IL-1β ELISA. D, 5 x 10

4 THP-1-soluja esi-inkuboitiin osoitetuilla määrillä mAb T2.5 tai conT2 (ug /ml) 0,5 tunnin ajan ja altistettiin TLR2 ligandin P3CSK4 (positiivinen kontrolli), TLR4-ligandin, LPS (negatiivinen kontrolli) ja

M.hy

pitoisuutena 6,7 ​​x 10

7 CCU /ml sen jälkeen 6 tuntia, supernatantit kerättiin IL-1β ELISA. Arvot edustavat keskiarvoa ± keskihajonta kolmen erillisen kokeen. *** Edustaa P 0,001, ** edustaa P 0,01 ja * edustaa P 0,05 verrattuna ohjaus tilastollinen analyysi.

Kerrottiin, että MLAMP pääasiassa aktivoitu NF-KB kautta TLR2 ja TLR6 [34], [35]. Siksi meidän ensimmäinen soveltaneet TLR2 neutraloivan vasta-aineen T2.5 estää TLR2 signaali, jossa ConT2 toimii isotyyppikontrolli [36]. Kuten kuviossa 2D on esitetty, T2.5 täysin esti IL-1β eritystä stimuloitiin TLR2 agonistin P3CSK4 mutta ei sen TLR4-ligandin, LPS. Tärkeää on, IL-1β eritystä

M.hy

infektoituja soluja voimakkaasti vähennetty T2.5, mikä osoittaa, että TLR2 oli mukana MLAMP laukaisi IL-1β eritystä ihmisen monosyyteissä. Mielenkiintoista on, että IL-1β: n eritys

M.hy

infektoituja soluja ei täysin estänyt T2.5 (kuvio 2D), joka viittasi siihen, että TLR2-riippumaton signalointireitin oli mukana myös MLAMP laukaisi IL-1β eritystä, joka ansaitsee lisätutkimuksia tulevaisuudessa.

M.hy

indusoi IL-1β eritys kautta aktivointi NLRP3 Inflammasome

Voit testata, onko

M.hy

indusoi IL-1β eritystä inflammasome aktivointia, ensin hyödyntää LPS pohjustettu THP-1 johdettujen makrofagien tarkistamaan, onko

M.hy

voi aktivoida inflammasome kuten ATP tai MSU, jotka tunnetaan inflammasome aktivaattoreita. Kuten on esitetty kuviossa 3A,

M

.hy

kykeni indusoimaan IL-1β vapautumista pohjustettu soluissa. Seuraavaksi tutkimme pilkkominen kaspaasi-1 ja oligomerointi ASC, kaksi tärkeää päättäjät varten inflammasome aktivointia. Olemme havainneet, että

M.hy

edistänyt pilkkominen kaspaasi-1 ja oligomerointi ASC (kuvio 3B), joka osoittaa suoraa aktivoitumista inflammasome mukaan

M.hy.

A, 1 x 10

5 PMA-indusoidun makrofagien esikäsiteltiin 50 ng /ml LPS: ää, käsiteltiin sitten

M.hy

, LPS, MSU tai ATP: ssa 5 tuntia, supernatantit kerättiin IL-1β ELISA. B, lohkaisu kaspaasi-1 ja oligomerointi ASC on inflammasome rikastettu ja silloitettu lysaatit THP-1 johdettujen makrofagien käsiteltiin

M.hy

, LPS: n ja MSU 6 tuntia. Monomeerejä, dimeerejä ja oligomeerejä ASC oli merkitty vastaavasti. C, 5 x 10

4 THP-1 esikäsiteltiin kaspaasi-1-estäjä AC-YVAD-CHO ja sitten altistettiin

M.hy

pitoisuutena 6,7 ​​x 10

7 CCU /ml, 12 tunnin kuluttua supernatantit kerättiin IL-1β ELISA. D, Onnistunut hiljentäminen (knock-down, KD) ASC ja kaspaasi-1 varmistettiin western blottauksella. E, 5 x 10

4 THP-1 sekoituskoodin, kaspaasi-1 KD-solujen ja ASC KD soluja käsiteltiin

M.hy

pitoisuutena 6,7 ​​x 10

7 CCU /ml, 12 tuntia myöhemmin supernatantit kerättiin IL-1β ELISA. F, 5 x 10

4 THP-1-soluja esikäsiteltiin NLRP3 inflammasome estäjän Glybenclamide ja sitten altistettiin

M.hy

, 12 tuntia myöhemmin supernatantit kerättiin IL-1β ELISA. G, Onnistunut vaimentaminen NLRP3 varmistettiin western blottauksella. H, 5 x 10

4 THP-1 sekoituskoodin ja NLRP3 KD soluja käsiteltiin

M.hy

pitoisuutena 6,7 ​​x 10

7 CCU /ml, 12 tunnin kuluttua supernatantit olivat kerätään IL-1β ELISA. I, immunoblottaus analyysi prokaspaasia 1 ja kypsiä (P10) muodossa kaspaasi-1 ja kypsän IL-1β (P17) supernatanteistaja pro-IL-1β (P31) ja β-aktiini soluekstrakteissa THP-1 ryntäily ja kaspaasi-1 KD, ASC KD ja NLRP3 KD soluja käsiteltiin

M.hy

6 tuntia. Esitettyjen tietojen ovat keskiarvoja ± SD on yksi edustaja kolmesta itsenäisestä kokeesta. *** Edustaa P 0,001 verrattuna ohjaus tilastollinen analyysi.

Lisäksi testasimme

M.hy

indusoi IL-1β eritys oli riippuvainen tietyistä inflammasome komponentteja. Ensimmäinen, olemme huomanneet, että tietyn kaspaasi-1-estäjä AC-YVAD-CHO laski IL-1β eritystä THP-1-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3C). Seuraavaksi, kun erityinen shRNA käytettiin vaientaa ilmentymistä kaspaasin 1 ja ASC (kuva 3D), IL-1β tuotanto laski voimakkaasti

M.hy

haaste (kuvio 3E), mikä osoittaa, että

M.hy

indusoi IL-1β eritys oli riippuvainen kaspaasi-1: n ja ASC.

Sitten testasimme, onko NLRP3 vaadittiin

M.hy

indusoi IL-1β eritystä. Ensimmäinen, olemme huomanneet, että NLRP3 estäjä Glybenclamide tukahdutetaan

M.hy

indusoi IL-1β eritystä annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3F) [37]. Kun erityiset shRNA käytettiin vaientaa ilmaus NLRP3 (kuvio 3G), IL-1β tuotanto laski voimakkaasti

M.hy

haaste (kuvio 3H), mikä osoittaa, että

M.hy

indusoi IL-1β eritys oli riippuvainen NLRP3. Tämä varmistettiin edelleen immunoblottaus, jossa kaspaasi-1 aktivointia ja IL-1β tuotanto olivat molemmat NLRP3 riippuvainen (kuvio 3I). Lisäksi olemme edelleen havainneet, että MLAMP oli pääkomponentti vastuussa NLRP3 inflammasome aktivoinnin

M.hy

(kuvio S2C). Lisäksi, AIM2 inflammasome oli kuitenkin aktivoida DNA [38], ja olemme havainneet, että

M.hy

DNA indusoi IL-1β erityksestä AIM2 inflammasome (kuvio S3A). Mielenkiintoista,

M.hy

indusoi IL-1β eritys oli pääasiallisesti riippuvainen NLRP3, kun AIM2 oli vain osittain mukana (kuvio S3A). Yhdessä nämä tulokset osoittivat selvästi, että

M.hy

indusoi IL-1β eritystä aktivoimalla NLRP3 inflammasome ihmisen monosyyttejä.

mekanismeista

M.hy

Käynnistetty NLRP3 inflammasome Activation

aktivointi NLRP3 inflammasome erilaisilla ärsykkeille riippuu katepsiini B toimintaa, K

+ efflux, kalsiumin ja /tai reaktiivisten happiradikaalien (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Tutkia mekanismeista IL-1β release vastauksena

M.hy

haaste, ensin sovellettu katepsiini B-spesifinen estäjä CA-074 Me ja havaittu heikentyi merkittävästi IL-1β eritys upon

M .hy

haaste. Pitoisuutena 100 uM, CA-074 Me täysin tukossa IL-1β release (kuva 4A). Tämä inhibitio ei johtunut myrkyllisiä vaikutuksia soluille kuin IL-8 eritystä vaikuta estäjä oli hyvin lievä (kuvio 4E). Tärkeää on, kun soluja käsiteltiin Katepsiini K: n estäjä I, väheneminen IL-1β eritys ei ollut selvää ollenkaan (kuvio 4B ja 4F), mikä viittaa siihen, että katepsiini B-aktiivisuus erityisesti mukana NLRP3 inflammasome aktivoinnin aikana

M .hy

haaste. Lisäksi kun estänyt K

+ ulosvirtaus lisäämällä solunulkoinen K

+ pitoisuus, IL-1β eritystä THP-1-solujen upon

M.hy

haaste väheni merkittävästi annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 4C). Jälleen, ei ollut toksista vaikutusta KCL, kuten IL-8 tuotantoa samoista soluista normaali (kuvio 4G). Selvittää, onko kalsiumin auttoi inflammasome aktivointia, lisäsimme eri annoksilla EGTA solun elatusalustaan ​​ja se havaittiin, että EGTA hoito estää

M.hy

indusoimaan IL-1β eritystä annoksesta riippuvalla tavalla, ja myrkyllisiä päivästä EGTA havaittiin osoituksena IL-8 tuotantoa (kuvio 4D ja 4H).

5 x 10

4 THP-1 esikäsiteltiin eri annoksilla katepsiini B: n estäjä CA-074 Me (A, E), tai Cathepsin K Inhibitor I (B, F), KCL (C, G) tai EGTA (D, H), sitten altistettiin

M.hy

pitoisuutena 6,7 ​​x 10

7 CCU /ml, 6 tunnin kuluttua supernatantit kerättiin IL-8 ja IL-1β ELISA samanaikaisesti. Esitettyjen tietojen ovat keskiarvoja ± SD on yksi edustaja kolmesta itsenäisestä kokeesta. *** Edustaa P 0,001, ** edustaa P 0,01 ja * edustaa P 0,05 verrattuna ohjaus tilastollinen analyysi.

Lisäksi testasimme

M.hy

haaste aiheuttamaa ROS sukupolvi THP-1-soluissa. Tässä määrityksessä THP-1-soluja ensin ladataan redox-herkkien fluoroforin DCFDA ja altistettiin sitten

M.hy

, ATP sisällytettiin positiivisena kontrollina. Kuten on esitetty kuviossa 5A, 16,9% CM-H2DCFDA positiivisia soluja havaittiin 30 minuutin kuluttua

M.hy

hoitoon verrattuna 1,6% käsittelemättömissä soluissa. Nämä tiedot osoittivat, että ROS saattavat edistää NLRP3 inflammasome aktivoinnin vastauksena

M.hy

haaste. Voit tarkistaa tätä mahdollisuutta, esikäsittelimme THP-1-solujen ROS estäjän diphenyliodonium (DPI) 30 minuuttia, ja sitten haastoi solut

M.hy

ennen mittausta IL-1β tuotanto 6 tuntia myöhemmin. Kuten odotettua, DPI vähentynyt huomattavasti

M.hy

indusoi IL-1β release (kuvio 5B). Tuore tutkimus osoitti, että ROS-estäjä kuten DPI poistettava IL-1β vapautumista hiiren makrofageissa estämällä NLRP3 geeniekspressiota [40]. Siksi me myös seurataan mRNA taso pro-IL-1β ja NLRP3 alle DPI hoitoa. Olemme havainneet, että DPI vähensi huomattavasti ilmentymisen pro-IL-1β ja NLRP3 (kuvio 5C-D), joka oli yhdenmukainen sen havainnon kanssa, hiiren soluihin [40]. Lisäksi olemme myös tutkinut kaspaasi-1 ja totesi, että pieninä annoksina (1 tai 10 uM) DPI hoito ei vaikuta kaspaasi-1 aktivointi, kun taas 100 uM DPI esti kaspaasin 1 aktivaation (kuvio 5E). Tämä osoitti, että ihmisen soluissa DPI häirinnyt NLRP3 inflammasome aktivointi estämällä NLRP3 transkription sekä kaspaasi-1 aktiivisuutta, kun suuri annos sovellettiin. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että katepsiini B toimintaa, K

+ efflux, Ca

2+ virtaa ja ROS kaikki osaltaan NLRP3 inflammasome aktivoinnin vastauksena

M.hy

haaste.

A, tasot ROS

M.hy

käsiteltiin THP-1-solut analysoitiin CM-H2DCFDA merkintöjä. Data edustaa keskiarvoa prosenttiosuuden CM-H2DCFDA-positiivisia soluja. B, 5 x 10

4 THP-1-soluja esi-inkuboitiin osoitettujen määrien DPI 0,5 tuntia ja altistettiin

M.hy

jälkeen 6 tuntia, supernatantit kerättiin IL- 1β ELISA. 1 x 10

5 THP-1-soluissa (C) ja PMA indusoi makrofagit (D) esi-inkuboitiin osoitettujen määrien DPI 0,5 tuntia ja altistettiin

M.hy

(lopullinen pitoisuus, 6,7 x 10

7 CCU /ml) sen jälkeen 3 tunnin ajan, solut lyysattiin ja mRNA uutettiin ja cDNA-synteesi ja lopuksi IL-1β ja NLRP3 geeniekspressiota real-time PCR. E, immunoblottianalyysi prokaspaasia 1 ja kypsiä (P10) muodossa kaspaasi-1 ja kypsän IL-1β (P17) supernatanteista ja otteita THP-1 johdettu makrofagit hoidettiin

M.hy

varten 6 tunnin kuluttua DPI esikäsittelyn 0,5 tunnin ajan. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SD on yksi edustaja kolmesta itsenäisestä kokeesta.

M.hy

Aktivoi NLRP3 Inflammasome

in vivo

kun hiiren luuytimen dendriittisoluista (BMDCs) infektoitiin

M.hy

, jatkuva IL-1β induktio havaittiin (kuvio 6A). Lisäksi kokeet BMDCs eristetty villityypin (WT) hiirillä tai hiirillä puutteellinen kaspaasi-1, ASC tai NLRP3 kanssa

M.hy

haaste vahvistettiin, että

M.hy

induktio IL- 1β oli NLRP3 inflammasome riippuvainen (kuvio 6B). Lisäksi systeeminen inokulointi

M.hy

WT-hiirissä indusoi IL-1β tuotantoa seerumissa ja vatsakalvon huuhtelu nestettä (PLF), mutta ei hiirillä puuttuu ASC tai NLRP3 (kuvio 6C-D). Mielenkiintoista, pohjapinta taso IL-1β ASC hiirissä oli selvästi korkeampi kuin WT tai NLRP3 hiirillä, mutta haasteena

M.hy

ei lisätä eritystä IL-1β tällaisissa hiirissä (kuvio 6C-D). Yhdessä nämä havainnot vahvistivat, että

M.hy

aktivoidaan myös NLRP3 inflammasome hiirillä

in vitro

ja

in vivo

.

, 1 x 10

5 hiiren luuytimen dendriittisoluista (BMDCs) altistettiin

M.hy

lopullisessa pitoisuudessa 5 x 10

7 CCU /ml eri ajankohtina, supernatantit kerättiin IL -1β ELISA. B, 1 x 10

5 BMDCs eristetty villityypin ja kaspaasi-1 puutteellinen (knock-out, KO), ASC KO ja NLRP3 KO hiiri altistettiin

M.hy

lopullisessa pitoisuudessa 5 x 10

7 CCU /ml, 24 tunnin kuluttua supernatantit kerättiin IL-1β ELISA. C-D, C57BL /6, ASC KO ja NLRP3 KO hiiriin ruiskutettiin i.p. 5 x 10

8 CCU /ml

M.hy

200 ul PBS: ää. Hiiret lopetettiin 6 tuntia injektion jälkeen, ja seerumi tai vatsakalvon huuhtelu nestettä (PLF) kerättiin IL-1β ELISA: lla (C, D). Koe toistettiin kolme kertaa, ja tiedot yhdistettiin ja osoitti keskiarvona ± SD. *** Edustaa P 0,001 ja ** edustaa P 0,01 verrattuna ohjaus tilastollinen analyysi.

M.hy

aiheuttama IL-1β Edistää mahakasvaimen Cell Migration ja Invasion

edellä olevat tiedot osoittivat selvästi, että

M.hy

kykeni indusoimaan IL-1β tuotannon synnynnäisen immuunijärjestelmän solut kautta NLRP3 inflammasome aktivointia. Varhainen epidemian tutkimukset paljastivat mahdollista roolia mykoplasman kehittämisessä mahasyövän [5]. Ja

Mycoplasma hyorhinis

osoitettiin edistää kasvainten solujen vaeltamiseen, invaasiota ja etäpesäkkeiden

in vitro

ja

in vivo

[41]. Oletimme, että saattaa olla olemassa toinen mekanismi tähän tarjoukseen, jonka mukaan

M.hy

voi edistää mahasyövän ja /tai etäpesäkkeiden edistämällä IL-1β tuotantoa. Ja me vahvisti, että

M.hy

edistänyt mahasyövässä solumigraatioon ja invaasiota (kuva S5). Koska

M.hy

osoitettiin infektoimaan mahalaukun syövän soluja ([41], kuvio S4), on näin ollen mahdollista, että

M.hy

voi aiheuttaa inflammasome aktivaatio syöpäsoluja suoraan. Ei kuitenkaan inflammasome aktivaatio havaittiin mahalaukun syövän soluissa (kuvio S6).

vieressä määritti ihmisen rekombinantti-IL-1β (rIL-1β) on mahasyövän karsinogeneesin on pesäkemuodostusta, joka paljasti, että rIL-1β ei vaikuttanut leviämisen mahasyövän solulinjan MGC-803 (Kuva S7). Koska IL-1β ilmoitettiin edistää etäpesäkkeiden muiden kasvainten [18], tarkistimme vaikutuksia rIL-1β maahanmuutto- ja hyökkäys MGC-803 soluja. Tuloksemme osoittivat, että MGC-803 muuttoliikettä ja invaasio parannettiin rIL-1β hoitoa (kuvio 7A ja 7C), kun taas käsittely rIL-18 eivät osoittaneet mitään vaikutusta (kuvio 7B ja 7D). Seuraavaksi käsitellään näitä mahasyövän solujen viljelmäsupematanteista

M.hy

haastoi THP-1 peräisin makrofagien tai makrofaagien vaiennettu NLRP3, ASC ja kaspaasi-1 Muuttoliikettä ja invaasiomääritys. Tuloksemme osoittivat, että viljelmäsupematanteista

M.hy

haastoi scramble makrofaagisoluissa voimakkaasti lisätä maastamuuttoa ja invaasion mahasyövän solujen viljely taas supernatantit NLRP3, ASC tai kaspaasi-1 Knockdown makrofagien ei, todennäköisesti johtuen vähentynyt IL-1β erittymistä (kuvio 8A ja 8C). Tämä lisätä maastamuuttoa ja hyökkäys MGC-803 solut poistettiin käsittelemällä solut anti-IL-1β mAb (kuvio 8B ja 8D). Yhdessä tuloksemme osoittivat, että

M.hy

johtuvaan muuttoliikkeeseen ja hyökkäys mahasyövän solulinjan MGC-803 edistämällä IL-1β eritystä monosyyttisoluilla. Lisäksi meidän tulokset osoittivat, että

M.hy

aiheuttama inflammasome aktivointi voi edistää

M.hy

replikointi (kuvio S8), jotka saattavat aiheuttaa positiivista palautetta ja lopulta johtaa kroonisuusaste tauti.

5 x 10

4 MGC-803 soluja käsiteltiin osoitetulla annoksia IL-1β (A ja C) tai IL-18 (B ja D) analysoitiin TranswellTM muuttoliike ja invaasion määrityksissä. Ylempi kulkeutuivat tai tunkeutuneet soluja ja alempi olivat keskimääräinen lukumäärä 4 mikroskooppikentäs- kunkin vastaavan kokeen vastaavasti. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen ja virhepalkkeja edustavat SD. *** Edustaa P 0,001 verrattuna ohjaus tilastollinen analyysi.

A-B, 5 x 10

4 MGC-803 soluja käsiteltiin SN salatulta makrofageja verrokkina, ja SN: alkaen

M.hy

käsiteltiin Casp-1 KD, ASC KD ja NLRP3 KD makrofagit analysoitiin TranswellTM muuttoliike (A) ja invaasiota (B) määritykset. C-D, 5 x 10

4 MGC-803-soluja käsiteltiin SN välillä

M.hy

käsiteltiin THP-1 johdettujen makrofagien tai SN sisältävät anti-IL-1β mAb analysoitiin Transwell muuttoliike (C ) ja invaasio (D) määritykset. Ylemmät paneelit siirtyvät tai tunkeutuneet soluja ja alempi paneelit ovat keskimääräinen lukumäärä 4 mikroskooppikentäs- jokaiselle vastaavalle kokeiluja, vastaavasti. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen ja virhepalkkeja edustavat SD. *** Edustaa P 0,001, ** edustaa P 0,01 ja * edustaa P 0,05 verrattuna ohjaus tilastollinen analyysi.

Keskustelu

Mykoplasmat erottuvat muista bakteereista pieni koko, minuutti genomin ja puute soluseinän. Monet mykoplasmojen perustaa kolonisaation ja infektion kautta noudattaminen isäntä kudoksiin. Koska niiden dynaaminen pinta arkkitehtuuri on antigeenisesti ja toiminnallisesti monipuolinen, mykoplasmoja pystyvät kiertämään isännän immuunijärjestelmän hyökkäys ja sopeutua monia elinympäristöjä ja aiheuttaa kroonisia sairauksia [32]. Koska tunnistaminen

M.hy

sian vuonna 1962, vähän tutkimusta suoritettiin tämän taudinaiheuttajan kunnes todettiin liittyvän useisiin ihmisen syöpiin [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. Viime aikoina tutkijat havaitsivat, että

M.hy

proteiini p37 oli vastuussa edistää syöpäsolujen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [30], [44]. Tämän lisäksi suora mekanismi, tämä mikrobi voi myös aiheuttaa kasvaimen kehittymisen tai etäpesäkkeiden epäsuorasti paikallisen krooninen tulehduksellinen prosessi. On tunnettua, että IL-1β on tärkeä proinflammatorinen sytokiini, joka edistää kasvua paksusuolen syövän solujen ja parantaa invasiivisuus ja etäpesäkkeiden B16-melanoomasoluja [19], [45]. Yli-ilmentyminen IL-1β havaittiin indusoivan mahalaukun tulehdus ja syöpään hiirissä [19]. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko NLRP3 inflammasome, joka ohjaa IL-1β kypsymisen, aktivoitiin

M.hy

, ja onko tämä aktivointi voidaan osaltaan

M.hy

liittyvien maha- etäpesäke . Tuloksemme osoittivat, että

M.hy

aktivoinut NLRP3 inflammasome

in vitro

ja

in vivo

, ja edistämällä mahasyövän solumigraation ja hyökkäystä

M .hy

oli riippuvainen NLRP3 inflammasome aktivointia. Sitä paitsi NLRP3, huomasimme, että

M.hy

DNA myös aktivoinut AIM2 inflammasome, mutta MLAMP aktivointi NLRP3 oli hallitseva osa IL-1β induktio

M.hy.

äskettäin on raportoitu, että asyloidun lipopeptidit lämmöllä tapettuja mykoplasman

Acholeplasma laidlawii

(HKAL) indusoi IL-1β tuotantoa NLRP7 inflammasome ihmisen soluissa, kun koko HKAL indusoi IL-1β eritys oli osittain NLRP3 riippuvainen [46], mikä osoittaa, että useita inflammasomes voidaan aktivoida tiettyjä mykoplasma. Tuloksemme ei sulkenut pois mahdollista osallistumista NLRP7 in

M.hy

indusoi IL-1β tuotantoa, mutta

M.hy

pääasiassa aktivoinut NLRP3 inflammasome, koska IL-1β eritys oli lähes kokonaan lakkautettiin NLRP3 vaiennettu soluja (kuvio 3H ja 3I).

Varhaiset tutkimukset ehdotti, että ROS aktivoinut NLRP3 inflammasome aktivoimalla kaspaasi-1 [47]. GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG.