Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

78-kDa glukoosin säätelemä proteiini (GRP78) indusoituu syöpä mikroympäristössä ja sitä voidaan pitää uutena ennustaja vasteajan kemoterapian moniin syöpiin. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että solunsisäinen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja Nukleaaritekijä erytroidien 2 liittyvä tekijä 2 (Nrf2) tumaansiirtymiseen olivat suuremmat GRP78 pudotus DLD-1 koolonsyöpäsoluihin verrattuna sekoitetun ohjaus soluihin.

Menetelmät /Principal havainnot

hoito epirubisiinia GRP78 pudotus DLD-1-solujen parannettu apoptoosin ja liittyi vähentynyt tuotanto solunsisäisten ROS. Lisäksi apoptoosi lisääntyi antioksidantit propyyligallaatti (PG) ja ditiotreitolia (DTT) in epirubisiinin saaneilla sekoitetun ohjaus soluja. Epirubisiiniannosta käsiteltyjen GRP78 pudotus soluissa johti enemmän inaktivoidun Akt-reitin jäseniä, kuten fosforyloitu Akt ja GSK-3β, sekä alavirtaan kohteina β-kateniinin ilme. Knockdovvn Nrf2 pieniä häiritseviä RNA (siRNA) nousi apoptoosin epirubisiiniannosta käsiteltyjen GRP78 pudotus soluja, joiden mukaan Nrf2 voi olla ensisijainen puolustusmekanismi GRP78 pudotus soluissa. Olemme myös osoittaneet, että epirubisiini-käsiteltyjen GRP78 pudotus solut voitaisiin vähentää selviytymisreittiin signaloinnin kautta redox aktivaation proteiinifosfataasi 2A (PP2A), joka on seriini /treoniini-fosfataasi, joka säätelee negatiivisesti Akt-reitin.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittavat, että epirubisiini laski solunsisäistä ROS GRP78 pudotus soluissa, mikä laski selviytymisen signalointi kautta sekä Akt-reitin ja aktivointi PP2A. Yhdessä nämä mekanismit osaltaan kohottamiseen epirubisiinin aiheuttaman apoptoosin, joka havaittiin GRP78 pudotus soluja.

Citation: Chang YJ, Huang YP, Li ZL, Chen CH (2012) GRP78 Knockdown Parantaa Apoptosis kautta Down-asetus oksidatiivinen stressi ja Akt Pathway jälkeen epirubisiini hoito Colon Cancer DLD-1 solut. PLoS ONE 7 (4): e35123. doi: 10,1371 /journal.pone.0035123

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 helmikuu 2012; Hyväksytty: 13 maaliskuu 2012; Julkaistu: 18 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Science neuvoston, Taiwan (NSC 99-2320-B-415-002-MY3; National Science neuvoston verkkosivustossa: https://web1.nsc.gov.tw/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

GRP78 on tärkein säätelijä Endoplasmakalvosto (ER) funktio. Roolit GRP78 ovat (1) proteiini taitto ja kokoonpano, (2) kohdistaminen väärin laskostuneen proteiinin hajoamista, ja (3) ER Ca

2 + sitovan kohdan ja valvonta aktivoinnista transmembraanisen ER jännitysantureita. Lisäksi, koska sen anti-apoptoottisen ominaisuus, GRP78 indusoidaan erilaisia ​​syöpäsoluja ja lääkeresistenttejä syöpäsolujen [1]. Mielenkiintoista, GRP78 ilme on huomattavasti vahvempi paksusuolensyöpä kuin paksusuolen adenooma ja normaalin kudoksen [2]. Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa kävi ilmi, että GRP78 Knockdown paitsi tehokkaasti tukahdutetaan leviämisen RKO koolonkarsinoomasoluissa vaan myös indusoi varhaisen apoptoosin solujen [3]. Lisäksi GRP78 downregulation on osoitettu johtavan paksusuolensyöpä herkistyminen paklitakselin indusoiman apoptoosin [4]. Yhdessä nämä raportit korostavat tärkeä rooli GRP78 terapeuttisessa hoidossa.

Useat syöpälääkkeiden aiheuttaa oksidatiivista stressiä tuottamalla reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja aiheuttaen sytotoksisuutta sekä apoptoosin syöpäsoluissa [5]. Oksidatiivisen stressin, joka tapahtuu kemoterapian aikana, voivat kuitenkin häiritä sytotoksisia vaikutuksia syöpälääkkeiden, jotka riippuvat nopeaan lisääntymiseen syöpäsolujen optimaalinen aktiivisuus [5]. Muut tutkimukset ovat myös osoittaneet, että maltillinen oksidatiivinen stressi voi stimuloida ja selviytymistä syöpäsolujen kautta ilmastointi mekanismeja, kun taas parantamiseksi ROS ylituotannosta pro- oksidantteja ankarissa oksidatiivista stressiä voi johtaa apoptoosin ja solukuoleman [6]. Redox signalointi, Nrf2 on keskeisessä asemassa transkription sarja geenejä, jotka edistävät vaiheen II /III entsyymejä ja puolustuksen oksidatiivista stressiä vastaan ​​[7]. On yhä enemmän todisteita usein mutaatiot Nrf2 ihmisen syövissä, joiden seurauksena suuri määrä Nrf2 tumaansiirtymiseen ja johtavat ilmentämällä sytoprotektiivista ja vieroitus geenejä. Kasvu edut ja kestävyys apoptoosia, jonka nämä geenit tarjoavat chemoresistance hoidon aikana [8]. Muut raportit ovat myös osoittaneet, että kemoterapeuttisen lääkeaineiden aktivoi Nrf2 reitti, joka indusoi soluja suojaavat geenien ja moduloi kemosensi- koolonkarsinoomasoluissa [9]. Siksi esto Nrf2 tumaansiirtymiseen voidaan olettaa tukahduttaa solujen lisääntymistä ja apoptoosin tehostamiseksi syövissä. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että oksidatiivisen stressin ja redox sääntely on tärkeä rooli kemoterapiaa.

Akt on apoptoottinen säädin, joka aktivoituu monien syöpien ja saattavat edistää lääkeresistensseihin

in vitro

[10 ]. Survival signaalit aiheuttama eri reseptoreita välittyy pääasiassa Akt; Näin ollen, Akt reitti voi edistää resistenttejä fenotyypit [11]. Toistuvat avautumisen ja Akt selviytymisen signalointireitin syövissä on johtanut merkittävää kiinnostusta tutkijoiden yrittää estää tämän reitin hoitoon tarkoituksiin [12]. Siten estyminen Akt-reitin harkitaan uutena strategia herkistää syöpäsolut syöpälääkkeiden [13].

Epirubisiini on doksorubisiinijohdannaisen antrasykliini analoginen että on parempi terapeuttinen indeksi kuin doksorubisiini [14]. Samalla annoksella, epirubisiini saa aikaan alempi hematologinen ja sydäntoksisuutta kuin doksorubisiini [15]. Mekanismi epirubisiini sytotoksisuuteen näyttää liittyvän tuotannon ROS [16]. Tähän mennessä yksityiskohtainen syövänvastainen mekanismi epirubisiinia GRP78 pudotus koolonkarsinoomasoluissa ei ole selvitetty. Esillä olevassa tutkimuksessa, olimme kiinnostuneita ymmärtämään syövänvastainen vaikutus epirubisiinin apoptoottiseen potentiaalia GRP78 pudotus ihmisen paksusuolen DLD-1 syöpäsoluja. Olimme myös kiinnostuneita ymmärtämään apoptoottisen mekanismin GRP78 Knockdown oksidatiivista stressiä, redox sääntely ja Akt selviytymisreittiin aikana epirubisiinia hoidon niin, että opas voidaan kehittää uusia antineoplastisia terapeuttisten ihmisen paksusuolen syöpiin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell linja, reagenssit ja kemikaalit

ihmisen koolonisyöpäsolulinja DLD-1 saatiin Bioresource Collection ja Research Center (Hsinchu, Taiwan). RPMI-1640-elatusaineessa ja naudan sikiön seerumia (FBS) saatiin Hyclone (South Logan, UT) ja Gibco Inc. (Freehold, NJ), vastaavasti. Pidätys-Transfektiossa aine saatiin Open Biosystems Inc. (Huntsville, AL). Nrf2 siRNA, salattu siRNA, ensisijainen vasta-aineita p-Akt (Thr308), Akt, Nrf-2-, GSK-3β, β-kateniinin, SP-1 ja GAPDH saatiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA ). Akt kinaasianalyysiä pakki hankittiin Cell Signaling Technology (Boston, MA). Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssi hankittiin Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). Ser /Thr-fosfataasi iinianalyysikitissä hankittiin Millipore Corporation (Billerica, MA). Propyyligallaatti (PG), ditiotreitoli (DTT), propidiumjodidia (PI), 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA), DNaasi-RNaasia A, dimetyylisulfoksidi (DMSO), trypaanisinistä, anti-aktiini ensisijainen Vasta-aineen ja muiden kemikaalien hankittiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Soluviljely ja käsittely

DLD-1-soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää . Kantaliuosta epirubisiinin liuotettiin DMSO: hon, ja käsiteltiin pitoisuus (500 ng /ml) valmistettiin RPMI-1640-väliaine.

Generation of GRP78 pudotus DLD-1-soluja

Ilmaisu of GRP78 pudotettiin DLD-1 solujen siRNA. Lyhyesti, kohdesekvenssi ihmisen GRP78 mRNA oli 5′-AAGGTTACCCATGCAGTTGTT-3 ’. Salattu siRNA-sekvenssi oli 5’-AAGGTGGTTGTTTTGTTCACT-3 ’. Grp78 siRNA ja salattu siRNA insertoitiin pSUPERIOR vektoriin ja transfektoitiin DLD-1-soluissa. Solut, jotka oli onnistuneesti transfektoitujen ja valittiin antibioottiresistenssin, kuten aikaisemmin on kuvattu [17] – [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa, DLD-1-solut transfektoitiin GRP78 siRNA nimettiin GRP78 knockdown-soluja, ja DLD-1-solut transfektoitiin salattu siRNA nimettiin sekoitetun kontrollisoluihin. Ilmaus GRP78 on sekoitettu kontrollipeptidi-soluihin ja GRP78 pudotus solut arvioitiin western blottauksella.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinieksluusiolla määrityksessä. -Soluja (1 x 10

6) viljeltiin 60 mm: n kudosviljelymaljoille 24 tuntia. Elatusaine korvattiin uudella elatusaineella ja solut altistettiin epirubisiinia 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen, seos tehtiin 1 osa 0,4% trypaanisinisellä ja 1 osa solususpensiota. Sitten seosta inkuboitiin noin 3 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, pisara trypaanisinisellä /soluseosta levitettiin hemasytometriä ja värjäämättä (elinkelpoinen) ja värjättiin (käyttökelvottomaksi) solut erikseen laskettiin hemasytometriä.

DNA-vaurioita ja solusyklin analyysi

DNA-vaurioita ja solukierron arvioitiin PI värjäys ja virtaussytometria. -Soluja (1 x 10

6) viljeltiin 60 mm: n kudosviljelymaljoille yön yli. Viljelyalusta korvattiin tuoreella alustalla, ja soluja käsiteltiin epirubisiinia 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), kiinteä PBS-metanoli (01:02, tilavuus /tilavuus) liuosta, ja pidettiin 4 ° C: ssa vähintään 18 tuntia. Yhden PBS pesun, solupelletit värjättiin PI-liuosta (PBS, 40 ug /ml PI, ja 40 ug /ml DNaasi-vapaata RNaasi A) 30 min ajan huoneenlämpötilassa pimeässä ja analysoitiin Becton-Dickinson FACScan-virtaussytometrillä (Franklin Lakes, NJ). Vähintään 10000 solut laskettiin näytettä kohti, ja DNA-histogrammit arvioitiin edelleen käyttäen Modfit ohjelmiston PC-työasema laskea solujen prosenttiosuus eri vaiheissa solusyklin sekä mitata solujen DNA-vaurioita (subG

1. vaihe).

solunsisäinen ROS mittaus

tuotanto solunsisäinen ROS havaittiin virtaussytometrillä käyttäen DCFH-DA. Käsittelyn jälkeen solut pestiin kerran PBS: llä, käsiteltiin 20 uM DCFH-DA 30 minuuttia pimeässä, pestiin jälleen PBS: llä, kerättiin sentrifugoimalla, ja suspendoitiin PBS: ään. Solunsisäiset ROS tasot, jotka ilmaistaan ​​fluoresenssi dikloorifluoreskiiniliuoksella (DCF), mitattiin kautta 530/22 nm sulkusuodin käyttäen Becton-Dickinson FACScan-virtaussytometrillä.

Nrf2 siRNA transfektion

hiljentäminen geenin ilmentymisen Nrf2, kolme sarjaa siRNA oligonukleotidit suunniteltiin: (1) 5′-GCAUGCUACGUGAUGAAGAtt-3 ’(sense) ja 5′-UCUUCAUCACGUAGCAUGCtt-3′ (antisense); ja (2) 5’-CUCCUACUGUGAUGUGAAAtt-3 ’(sense) ja 5′-UUUCACAUCACAGUAGGAGtt-3′ (antisense); ja (3) 5’-GUGUCAGUAUGUUGAAUCAtt-3 ’(sense) ja 5′-UGAUUCAACAUACUGACACtt-3’ (antisense). Solut (4 x 10

5) viljeltiin 60 mm: n annoksia 5 ml: ssa RPMI-1640-väliaine täydennettiin 10% FBS: ää ja transfektoitiin 40%: n konfluenssiin lisäämällä pidätys-Transfektiossa ainetta (Huntsville, AL) ja Nrf2 siRNA. Kontrollisoluja käsiteltiin pidätys-Transfektiossa aineen ja salattu siRNA [5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’(sense) ja 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’ (antisense)], jotka eivät johda erityiseen hajoaminen tahansa solun viestien . Solut huuhdeltiin väliaineen jälkeen 25 min inkubaation ja sitten pidettiin viljelmässä vielä 24 tuntia. Ydin- Nrf2 ilmentymistä arvioitiin Western blot.

Akt-kinaasin aktiivisuuden määritys

Akt havaittu kinaasiaktiivisuuden käyttäen ei-radioaktiivista Akt kinaasimääritys kit. Lyhyesti, soluja viljeltiin 60 mm: n maljat käsiteltiin 500 ng /ml epirubisiini tai ajoneuvon kontrollina. Epirubisiinin jälkeen hoidon, solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja kerättiin soluhajotuspuskurin [20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti , 1 mM β-glyserofosfaatti, 1 mM Na-

3Vo

4, ja 1 ug /ml leupeptiiniä]. Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssia. Akt-kinaasin immunosaostettiin solu-uutteesta (300 ug proteiinia) käyttäen helmi-konjugoidun fosfo-Akt (Ser473) kanin monoklonaalista vasta-ainetta ja inkuboitiin varovasti keinutuoli yön yli 4 ° C: ssa. Pelletit pestiin kaksi kertaa solun lyysipuskuria ja sitten pestiin kahdesti 500 μ1 kinaasipuskuria. Pelletit suspendoitiin 50 ul: aan kinaasipuskuria, jota oli täydennetty 1 ui 10 mM ATP: tä ja sopivan määrän kinaasin substraatti (GSK-3-fuusioproteiinia) 30 minuutin ajan 30 ° C: ssa. Reaktio lopetettiin 25 ui 3 x SDS-näytepuskuria. Fosforylaatio GSK-3-fuusioproteiini havaittiin Western-blottauksella antiphospho-GSK-3α /β (Ser21 /9) kanin vasta-aineella.

Proteiinifosfataasi 2A (PP2A) aktiivisuusmäärityksen

PP2A aktiivisuus määritettiin käyttämällä Ser /Thr fosfataasianalyysi kit. Lyhyesti, solut hajotettiin kanssa hajotuspuskuria ehdottaman protokollan pakkauksessa mukana. Alikvootti, joka vastaa 50 ug proteiinia käytettiin arvioimaan PP2A aktiivisuus käyttämällä protokollaa valmistajalta. Absorbanssi reaktioliuos mitattiin 96-kuoppalevyille 405 nm: ssä mikrolevylukijalla (Bio-Rad, Richmond, CA).

Western blotting -analyysi

Käsittelyn jälkeen solut pestiin PBS: llä, suspendoitiin uudelleen proteiini uuttopuskuria 10 minuuttia, ja sentrifugoitiin 12000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, jolloin saatiin uutettu proteiinien (supernatantti). Proteiinikonsentraatiot mitattiin Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssia. Uutettu sellulaaristen proteiinien keitettiin latauspuskurissa, ja erä, joka vastaa 50-100 ug proteiinia erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin sähköllä päälle polyvinylideenifluoridi siirto kalvo. Jälkeen blotting, kalvoja inkuboitiin eri primaaristen vasta-aineiden yön yli ja pestiin sitten PBST-liuoksella (0,05% Tween 20 PBS: ssä). Pesun jälkeen sekundääristä vasta-ainetta, joka oli leimattu piparjuuriperoksidaasilla, lisättiin kalvolle 1 h ja pestiin sitten PBST-liuoksella (0,05% Tween 20 PBS: ssä). Antigeeni-vasta-kompleksit on todettu tehostetun kemiluminesenssin (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), jossa on kemiluminesenssin analysaattorin.

Tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvo ± keskihajonta vähintään kolmen erillisen kokeen ja analysoitiin käyttäen Studentin

t

testejä.

P

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä [20].

Tulokset

GRP78 Knockdown tehostunutta solukuolemaa ja indusoiman apoptoosin epirubisiinia hoito

Kuvio 1A esittää ilmentymisen GRP78 on salattu ohjaus DLD-1-soluja ja GRP78 pudotus DLD-1-soluja. GRP78 pudotus DLD-1 solut osoittivat alempaa ilmaus GRP78 kuin salattu ohjaus DLD-1-soluissa. Arvioimme lisäksi solujen elävyyden ja apoptoosia epirubisiinia kohtelun GRP78 knockdown ja salatun ohjaus DLD-1-soluissa. Kuvio 1B osoittaa, että solujen elinkelpoisuus oli huomattavasti vähentynyt GRP78 pudotus soluja verrattuna salattu ohjaus soluja 48 tunnin jälkeen 500 ng /ml epirubisiini hoitoa. Lisäksi, apoptoosin prosenttiosuus GRP78 knockdown-soluja (83,17%) oli paljon korkeampi kuin prosenttiosuus havaittu sekoitetun ohjaus soluja (35,12%), 48 tuntia sen jälkeen epirubisiini hoidon (kuvio 1C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että GRP78 on kohdeproteiinin varten epirubisiiniannosta solukuolema ja apoptoosin DLD-1 paksusuolensyöpä.

(A) analyysi GRP78 ilmaisun salattu ja GRP78 knockdown DLD-1-soluissa Western-blottauksella . Analyysi (B) solujen elinkelpoisuuden ja (C) apoptoosia käsittelyn jälkeen kantajaa (kontrolli) ja epirubisiini (epi). Sekoitetun ohjaus ja GRP78 pudotus DLD-1-soluja käsiteltiin epirubisiinia (500 ng /ml) 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinieksluusiolla määrityksessä. Prosenttiosuudet soluja, jotka olivat subG

1 vaihe (merkitty DNA-vaurioita) määritettiin kuten hahmoteltu

Materiaalit ja menetelmät

. Arvot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (n = 5-8) yksittäisten kokeita. Merkittäviä eroja kontrolliryhmän ja sekoitetun kontrolliryhmän ovat

P

0,05 (*) ja

P

0,05 (#), tässä järjestyksessä. Nämä kokeet tehtiin vähintään 3 kertaa, ja edustava koe esitetään.

GRP78 pudotus pienentää epirubisiinin aiheuttaman solunsisäisen ROS

arvioimiseksi solunsisäistä oksidatiivisen stressin, solunsisäiset ROS arvioitiin by DCFH-DA värjäytymisen salatun ohjaus soluihin ja GRP78 pudotus soluja. Kuvio 2A esittää, että GRP78 pudotus solut osoittivat 7- 10-kertainen suurempi DCF fluoresenssi kuin sekoitetun ohjaus soluissa, sen jälkeen 24-48 tunnin viljelyn, joka osoitti, että merkittävää oksidatiivista stressiä ollut olemassa GRP78 knockdown-soluja. Hoito salatut kontrollisolujen epirubisiinilla johti ROS lisäyksiä 1,3- ja 1,5-kertaiseksi 24 ja 48 tuntia verrattuna sekoitetun ohjaus soluja ilman epirubisiini (kuvio 2B). Sen sijaan solunsisäisten ROS pieneni 0.65 ja 0.81-kertaisesti epirubisiiniannosta käsiteltyjen GRP78 pudotus solujen 24 ja 48 tuntia verrattuna GRP78 pudotus soluja ilman epirubisiini (kuvio 2B). Annos epirubisiini enemmän kuin 500 ng /ml ei lisää ROS on GRP78 pudotus DLD-1-soluja. Epirubisiini inhiboi ROS annoksesta riippuvalla tavalla, että GRP78 pudotus DLD-1-soluissa (kuvio 2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että solunsisäiset ROS vähentäminen saattaa lisätä apoptoosia epirubisiini-käsiteltyjen sekoitetun kontrollisoluihin. Kun antioksidantit PG ja DTT: tä, joita käytetään vähentämään solunsisäisten ROS, lisättiin epirubisiini käsitellyn sekoitetun kontrollisoluja, apoptoosi kasvoi 35,12%: sta 53,18% ja 83,06%, vastaavasti (kuvio 2D). Mielenkiintoista on, ole PG eikä DTT yksinään voi indusoida apoptoosia sekoitetun kontrollisoluissa.

Scrambled ohjaus ja GRP78 pudotus DLD-1-soluja (A) viljellään 24 ja 48 h tai (B) käsiteltiin epirubisiinia (500 ng /ml), 24 tai 48 tuntia. (C) GRP78 pudotus DLD-1-soluja käsiteltiin epirubisiinia (500, 750, 1000 ng /ml) 48 tuntia. Solunsisäinen ROS arvioitiin DCFH-DA värjäys ja virtaussytometria esitettyä

Materiaalit ja menetelmät

. (D) Salattu ohjaus DLD-1-soluja käsiteltiin 500 ng /ml epirubisiini (epi) yksinään, 25 uM propyyligallaatti (PG) yksinään, 1 mM ditiotreitolia (DTT), yksin tai epirubisiini yhdessä PG tai DTT: ssa 48 tuntia. Prosenttiosuudet soluja, jotka olivat subG

1 vaihe (merkitty DNA-vaurioita) määritettiin kuten hahmoteltu

Materiaalit ja menetelmät

. Arvot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (n = 5-8) yksittäisten kokeita. Merkittävä ero kontrolliryhmän asetettiin

P

0,05 (*).

Nrf2 on mukana puolustusmekanismi on GRP78 pudotus solut

Nrf2 on transkriptiotekijä, joka vastaa solunsisäisen ROS stimulaatiota ja siirtyy tumaan, sitomalla antioksidantti vaste-elementin ja soitintaminen vaiheen II entsyymejä. Tutkimme Nrf2 tumaansiirtymiseen vuonna salatun ohjaus soluihin ja GRP78 pudotus soluja. Kuvio 3A esittää, että Nrf2 tumaansiirtymiseen kasvoi noin 1,6-kertaiseksi GRP78 pudotus soluja verrattuna salatun ohjaus soluja. Olemme myös arvioineet, onko Nrf2 tumaansiirtymiseen ollut puolustava rooli vastaan ​​epirubisiini aiheuttamaa apoptoosia GRP78 pudotus soluja. Grp78 knockdown-soluja käsiteltiin Nrf2 siRNA 24 h inhiboida Nrf2 ilmentymistä ennen inkubointia epirubisiinia 48 tuntia. Sen jälkeen, kun epirubisiini inkuboinnin apoptoosi arvioitiin virtaussytometrialla. Kuvio 3B esittää, että Nrf2 ilmentyminen inhiboivat merkittävästi Nrf2 siRNA on GRP78 pudotus soluja, ja kuvio 3C esittää, että apoptoosin kasvatti merkittävästi Nrf2 siRNA käsittely epirubisiiniannosta käsiteltyjen GRP78 knockdovvn soluja, mikä osoittaa, että Nrf2 oli merkittävä puolustusmekanismi kun GRP78 pudotettiin vuonna DLD-1-soluissa.

(A) Scrambled ohjaus ja GRP78 pudotus DLD-1-soluja viljeltiin 48 tuntia, ja ydinvoiman Nrf2 ilmentyminen arvioitiin western blottauksella. (B) toinen GRP78 pudotus DLD-1-soluja esikäsiteltiin salattu siRNA (sc) tai Nrf2 siRNA: ssa 24 tuntia, ja ydin- Nrf2 ilmentymistä arvioitiin Western blot. (C) grp78- pudotus DLD-1-soluja esikäsiteltiin salattu siRNA (sekoituskoodin) tai Nrf2 siRNA: ssa 24 tuntia ja käsiteltiin 500 ng /ml epirubisiini (epi) vielä 48 tunnin ajan. Hoidon jälkeen solujen prosenttiosuus, jotka olivat subG

1 vaihe merkitty DNA-vaurioita määritettiin hahmoteltu

Materiaalit ja menetelmät

. Nämä kokeet tehtiin vähintään 3 kertaa, ja edustava koe esitetään.

GRP78 Knockdown parannettu epirubisiiniannosta estoa Akt-reitin

On yhä enemmän todisteita siitä, että Akt polku tarjoaa yhteyden solunulkoisen eloonjääntisignaaleja ja tekijöitä, jotka aiheuttavat apoptoottisia tapahtumia soluissa [21]. Tutkia, onko Akt-reitin osallistuu epirubisiinin välittämän apoptoosin, tutkimme fosforyloitumisaste Akt vuonna salatun ohjaus soluihin ja GRP78 pudotus solut epirubisiinin jälkeen hoidon. Solulysaatit valmistettiin ja fosforylaation taso Akt analysoitiin western-blottauksella anti-fosfo-Akt (Thr308) vasta-aine. Akt-fosforylaation oli laskenut suuremmassa määrin GRP78 knockdown-soluja verrattuna salattu ohjaus soluissa, sen jälkeen 24 ja 48 tunnin epirubisiinin hoitoa (kuvio 4A). Tutkimme myös vaikutuksia epirubisiini on Akt kinaasiaktiivisuutta käyttäen immunosaostus ja western blotting tekniikoita. Epirubisiini esti fosforylaation taso GSK-3α /3β, (kuten nähtiin kanssa Akt kinaasiaktiivisuutta) sekä salatun ohjaus soluihin ja GRP78 pudotus soluja, ja lasku Akt kinaasiaktiivisuuden näytti tehostetaan vuonna GRP78 knockdown solut 48 h (kuvio 4B). Koska viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, että GSK-3β proteiini, joka on keskeinen toimija stressi reagoivaa apoptoosin, on yksi alavirran proteiinin substraatteja Akt-kinaasin [22], epirubisiiniannosta aiheuttama tukahduttaminen Akt fosforylaation voi estää Akt-riippuvaisen fosforylaatio GSK-3β. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, proteiinin kokonaismäärän lysaatit valmistettiin epirubisiini-käsiteltyjen sekoitetun kontrollisoluja ja GRP78 pudotus solut altistettiin immunoblottauksella, jossa on fosfo-GSK-3β-vasta-aine, joka tunnistaa spesifisesti GSK-3β fosforyloitu Ser-9. Salatut ohjaus solut ja GRP78 pudotus solut osoittivat merkittävää laskua GSK-3β fosforylaation, ja korkein esto tapahtunut GRP78 pudotus soluja inkuboitiin epirubisiinilla 48 tuntia (kuvio 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että inhibitio Akt signalointiryöpyn on tehostaa GRP78 pudotus on epirubisiini-käsitellyissä soluissa.

Scrambled ohjaus ja GRP78 pudotus DLD-1-soluja käsiteltiin epirubisiinia (500 ng /ml) varten ilmoitettu kertaa. Fosforylaatio (A) Akt ja (C) GSK 3β arvioitiin western-blottauksella. (B) Akt-aktiivisuutta määritettiin hahmoteltu

Materiaalit ja menetelmät

. Proteiini on PVDF kalvo värjättiin Coomassie brilliant blue näkyy sisäisenä kontrollina. Nämä kokeet tehtiin vähintään 3 kertaa, ja edustava koe esitetään.

GRP78 Knockdown parannettu epirubisiiniannosta välittämää downregulation loppupään tavoitteita Akt-reitin

olivatko estämällä Akt signalointireitin vaikuttanut loppupään tavoitteet salattu ohjaus soluissa ja GRP78 pudotus soluja käsiteltiin epirubisiinia. β-kateniinin on GSK-3β tavoite, joka on osallisena apoptoottisten kestävyys ja eloonjääminen merkinanto [23], ja lisääntynyt ilmentyminen β-kateniinin on korreloitu elonjäämisetua syövän [23]. Tarkastelu β-kateniinin ilmaisu paljasti, että se ei merkittävästi muuttunut salattu ohjaus soluja jälkeen 24 tai 48 tunnin epirubisiinin hoitoa. Vähentäminen β-kateniinin ilmentymistä, kuitenkin, havaittiin 48 tunnin kuluttua epirubisiinin kohtelun GRP78 knockdown-soluja (kuvio 5).

Scrambled ohjaus ja GRP78 pudotus DLD-1-soluja käsiteltiin epirubisiinia (500 ng /ml) osoitetut ajat, ja ilmentymistä β-kateniinin arvioitiin western-blottauksella. Nämä kokeet tehtiin vähintään 3 kertaa, ja edustava koe esitetään.

GRP78 pudotus parannettu proteiini 2A aktiivisuutta epirubisiinia hoidon

Useat tutkimukset ovat osoittaneet yhteyksiä Akt-reitin ja fosfataasit. Esimerkiksi, PP2A on osoitettu olevan keskeinen Akt fosfataasi, joka voi defosforyloida Akt sekä Thr 308 ja Ser 493-tähteet ja estää Akt-reitillä [21]. Olemme edelleen tutki ilmaisua ja aktiivisuus PP2A oli mukana epirubisiinin aiheuttaman apoptoosin salatun ohjaus soluihin ja GRP78 pudotus soluja. Kuvio 6A esittää, että ilmentyminen PP2A väheni epirubisiiniannosta käsiteltyjen sekoitetun säätökennoja kuluttua 48 h hoidon. Toisaalta, ilmaus PP2A lisättiin 24 tunnin ja ei laskenut 48 h epirubisiinin käsiteltyjen GRP78 knockdown-soluja. Aktiivisuus PP2A oli hieman laskenut 24 tunnin ja laski merkittävästi 48 tuntia epirubisiiniannosta käsiteltyjen sekoitetun ohjaus soluja. Sen sijaan, PP2A aktiivisuus kasvoi merkittävästi noin 2-kertaisesti 24 h epirubisiiniannosta käsiteltyjen GRP78 pudotus solut (kuvio 6B). PP2A toiminta ei merkittävästi supistunut 48 h epirubisiiniannosta käsiteltyjen GRP78 knockdown soluja. Nämä kokeet osoittivat selvän yhteyden lisääntynyt PP2A aktiivisuus ja apoptoosin induktion kautta estämällä Akt väylän GRP78 pudotus solujen aikana epirubisiinia hoidon. Tämä korosti GRP78 pudotus inhiboimiseksi DLD-1-solujen proliferaatio.

Scrambled ohjaus ja GRP78 pudotus DLD-1-soluja käsiteltiin epirubisiinia (500 ng /ml) ja osoitettujen kertaa. (A) ilmentymistä PP2A arvioitiin western blotting, ja (B) aktiivisuus PP2A määritettiin hahmoteltu

Materiaalit ja menetelmät

. Nämä kokeet tehtiin vähintään 3 kertaa, ja edustava koe esitetään.

Keskustelu

yhteisenä piirteenä moniin syöpiin on niiden täydennetty tasot ROS. Ensisijainen lähde näiden ROS on lisääntynyt aineenvaihdunta [21]. Korkea ROS tasoilla ja Nrf2 tumaansiirtymiseen että GRP78 pudotus soluista osoitti, että GRP78 näyttelee redox homeostatic rooli DLD-1-soluissa. Läsnä ollessa GRP78, epirubisiinia vain indusoi alhainen ROS ( 2-kertaisesti) DLD-1-soluissa, ja alhainen ROS voi johtaa aktivoimalla tiettyjä antioksidantti järjestelmien syövän soluja, jotka voivat aiheuttaa resistenssin kemoterapiaa. Mielenkiintoista, antioksidantteja DTT ja PG sekä parannettu apoptoottisen vaikutuksen epirubisiinia salatun ohjaus soluja. Vähentäminen ROS mukaan epirubisiini on GRP78 pudotus solut korosti mahdollisuutta, että lisääntynyt ROS tasoilla DLD-1 solut voivat olla suora vaikutus solun eloonjäämisreittejä.

GRP78 on kaperoni- joka on olemassa ER. Stressaamattomista soluissa, ER transmembraaniproteiineja (PERK ja IRE1) pidetään aktiivisessa tilassa kautta kiinnitys GRP78 niiden ER-luumenin domeenit [24]. Yleisesti, luumenin domeenit aktiivinen muotojen PERK ja IRE1 koostuvat 01:01 komplekseja GRP78 [25]. Kun ER-stressi ilmenee, GRP78 disjoins ja sitoutuu laskostumattoman tai väärin laskostuneet proteiinit, joka mahdollistaa homo-oligomerointi PERK, IRE1 tai molemmat, ja tuloksia autofosforylaatiota näiden entsyymien ja aktivointi niiden substraattien [24]. Nrf2 on suora substraatti PERK ja efektori PERK-riippuvaisten solujen eloonjäänti [26], mikä selittää, miksi GRP78 pudotus DLD-1-soluissa ilmaistuna suuri määrä ydin- Nrf2.

Nrf2 toimii anturi oksidatiivisen stressin ja säätelee aktivointi puolustavien geenien, joka johtaa solujen suojaamiseksi epäsuotuisia vaikutuksia vastaan ​​oksidatiivisen stressin ja edistää solujen eloonjäämistä [27]. Monissa syöpäsolut, Nrf2 osoittaa pro kasvaimen ominaisuuksia, jotka ovat samanlaisia ​​kuin identtisiä sytoprotektiivista geenejä, jotka voivat lisätä syöpäsolujen vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä [8]. Esimerkiksi, fluoriurasiili stimuloi Nrf2-reitin, joka moduloi kemo- ja indusoi cytoprotective geenien HT-29 koolonin syöpäsolujen [9]. Nrf2 on ratkaiseva transkriptiotekijä, joka ohjaa suojaava vastaan ​​myrkyllisiä loukkauksia laajasta spektrin kemiallisten aineiden [25]. Viime vuosina tutkimukset ovat osoittaneet roolin Nrf2 suojaavat sekä uusille että nykyisille kemoterapeuttisten lääkkeiden verisyöpä [8]. Nrf2 yli-ilmentyminen on havaittu myös haimasyövän [7]. Lisäksi tutkimus on osoittanut, että vakaa yliekspressio Nrf2 syöpäsoluissa indusoi parempaan vastustuskyky kemoterapia-aineiden, mukaan lukien doksorubisiini, etoposidi ja sisplatiini [25]. Muut raportit ovat osoittaneet, että strategia käyttää Nrf2-inhibiittorit lisäämään tehoa kemoterapeuttisten aineiden ei rajoitu syöpälääkkeiden tai tiettyihin syöpätyyppeihin. Todellakin, Nrf2-inhibiittoreita voidaan käyttää kemoterapian aikana ja hoitaa monia syöpätyyppejä [25]. Tämä tutkimus osoitti, että apoptoosin parantaa epirubisiinihoidon kohtelun Nrf2 siRNA-käsiteltyjen GRP78 pudotus soluja, mikä viittaa siihen, että Nrf2 on ratkaiseva puolustava rooli GRP78 pudotus soluja.

Tuore tutkimus paljasti, että vaiennettaisi Lin et ai.