Krooninen sairaus

tiivistelmä

Chemoresistance on tärkein syy hoidon epäonnistumisen pitkälle peräsuolen syöpä (CRC). Kuitenkin molekyylitason mekanismit tätä ilmiötä vielä selvittämättä. Aikaisemmassa työssä me tunnistettu alhainen PKM2 otaksutuksi oksaliplatiinia resistenssimarkkerin HT29 CRC solulinjoissa ja myös potilaille. Sen arvioimiseksi, miten PKM2 vaikuttaa oksaliplatiini vaste CRC soluissa, me vaiennetaan PKM2 käyttämällä erityisiä siRNA: t in HT29, SW480 ja HCT116-soluissa. MTT testi osoitti, että PKM2 hiljentämisen aiheuttama vastus HT29 ja SW480-solujen ja herkkyyttä HCT116-soluissa. Sama kokeiluja isogeenisiin HCT116 p53 null soluja ja kaksinkertainen vaiennettu p53 ja PKM2 in HT29 ole osoittanut vaikutusta p53. Käyttämällä trypaanisinistä tahra ja FITC-anneksiini V /PI testejä olemme havainneet, että PKM2 Knockdown liittyi lisäys solujen elinkelpoisuutta mutta ei lasku apoptoosin aktivoitumisen HT29. Fluoresenssimikroskopia paljasti PKM2 tumaansiirtymiseen vastauksena oksaliplatiinille HCT116 ja HT29 mutta ei oksa-resistenttien HTOXAR3 soluissa. Lopuksi, käyttämällä qPCR Array osoitimme, että oksaliplatiinin ja PKM2 hiljentäminen muuttuneen solukuoleman geeniekspressiomalleja mukaan lukien BMF, joka oli lisääntynyt HT29 vastauksena oksaliplatiini, annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, mutta ei siPKM2 -HT29 ja HTOXAR3 soluja. BMF geenien in HT29 johtaa vähenemiseen oksaliplatiinia solukuolema. Lopuksi tietomme raportoivat uusia vähemmän glykolyyttisissä roolit PKM2 vastauksena genotoksisia vahingot ja ehdottaa BMF mahdollisena kohteena geenin PKM2 olla mukana oksaliplatiinia vasteen ja resistenssin CRC soluissa.

Citation: Ginés , Bystrup S, Ruiz de Porras V, Guardia C, Musulén E, Martínez-Cardus A, et al. (2015) PKM2 solunosasijaintia osallistuu Oksaliplatiini Resistance Acquisition in HT29 paksu- ja peräsuolisyövän Cell Lines. PLoS ONE 10 (5): e0123830. doi: 10,1371 /journal.pone.0123830

Academic Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 16 syyskuu 2014; Hyväksytty: 07 maaliskuu 2015; Julkaistu: 08 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Ginés et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat beca bianual de la Fundación Olga Torres 2008-2009 (https://www.fundacioolgatorres.org/beques_d-investigacio/) ja EMB AGM AA AMC EM JLM.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä aiheuttaa syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti. 5 vuoden eloonjäämisaste on alle 10% pitkälle edennyt tauti ja solunsalpaajahoitoa edelleen välttämätöntä näille potilaille. Saatavuudesta huolimatta uuden tavoitteen hoitoja vastaan ​​EGFR tai VEGF, yhdistelmiä oksaliplatiinin (oksa) kanssa fluoropyrimidiinien edelleen yleisimmin käytetty etulinjan hoito Metastasoituneessa [1, 2]. Sytotoksisuuden oksa koostuu pääosin muodostumista platina-DNA addukteja seurauksena DNA transkriptio ja replikaatio saarto. Näin ollen se aktivoi useita signalointireittien DNA vaurioita korjaus ja /tai aktivointia solukuoleman ohjelmien [3], joka puolestaan ​​riippuu muiden tekijöiden ohella, on mutaatiostatuksesta riippumatta kasvaimen p53 [4-6]. Kuitenkin on ilmeistä, että kaikki potilaat hyötyvät oksa hoidon vastus prosesseja, jotka edustavat suurimpana esteenä hoidon tehokkuudesta. Chemoresistance platinaa aineita on monimutkainen ja monitekijäinen prosessi, jossa useita mekanismeja kuten huumeiden tulva /ulosvirtaus muunnoksia, muutoksia DNA-vaurioiden korjaus, vähennys solukuoleman aktivaation, autokriinisella selviytyminen signalointi tai korkea vieroitus toiminta voisi osallistua [7-10]. Valitettavasti useimmat koskevat tutkimukset platina huumeiden vastustuskyky ovat keskittyneet sisplatiinia ja todellinen biologista käyttäytymistä ja mekanismit vastaus oksa peräsuolen soluissa on enimmäkseen tuntematon.

Viime vuosina monet tutkimukset ovat suunnattu huomionsa kasvaimen solujen aineenvaihduntaa mekanismi solujen sopeutuminen lääkeaineen herkkyys [11, 12]. Tällä rivillä, löysimme aiemmassa tutkimuksessa, joka isoformi M2 pyruvaattikinaasin entsyymin (PKM2) liittyy oksa vastus hankintaan käytettäessä

in vitro

malli ja pystyimme kääntämään tuloksemme pieneen kohortin metastaattinen CRC potilasta, jotka olivat saaneet OXA /5-FU kemoterapiaa [8]. Muut kirjoittajat ovat raportoineet, että PKM2 ilmaisua ja aktiivisuus liittyy sisplatiinin resistenssiä mahakasvaimen soluissa [13] ja peräsuolen syövän solujen kehittynyt resistenssi 5-FU hoidossa [14]. Nämä tosiasiat osoittavat, että tämän entsyymin voisi olla tärkeä rooli resistenssin yrityskauppaprosesseja eri kemoterapeuttisten. Lisäksi on osoitettu, että jotkin PKM2 biologisten toimintojen riippuvat entsyymin tumaansiirtymiseen, jotka edistävät eri translaation jälkeisiä modifikaatioita, kuten tyrosiinifosforylaatiota [15-17], lysiini asetylaatio [18], tai sumoylation [19] vastauksena tekijät EGFR [20], IL-3 [21] tai Oct-4 [22] vastaavasti. Vaikka suurin osa edellä mainituissa tapauksissa PKM2 translokaatio tuloksia solujen lisääntymisen stimuloituminen, on osoitettu, että sen jälkeen, kun muita erilaisia ​​ärsykkeitä, kuten DNA: n vaurioiden tai oksidatiivisen stressin, PKM2 siirtyy tumaan solujen johtaa aktivaatioon solukuoleman joka caspases ja Bcl-2 riippumattomalla tavalla [23].

Teoksessa esitetään tässä, halusimme selvittämiseksi PKM2 liittyvän molekyylitason mekanismeja vastuussa oksa vastus hankintaan käytettäessä

in vitro

mallin aikaisemmin kuvannut meitä [24]. Koska se näkyy, modulaatio PKM2 ilmaisun muuttunut oksa herkkyys ei ainoastaan ​​tässä solujen mallia vaan myös muissa ihmisen CRC solulinjat. Osoitamme, että PKM2 siirtyy tumaan, vastauksena genotoksisia aiheuttamien vahinkojen oksa herkkien mutta ei solulinjoissa hankittu resistenssi lääkeaineelle, ja se säätelee ekspressiokuviota solukuoleman geenejä, kuten BMF, jonka on osoitettu olevan osallisena aktivoinnissa apoptoottisten ja ei-apoptoottista solukuolemaa.

Materiaalit ja menetelmät

Allekirjoitettu suostumus saatiin kunkin potilaan ja kliinisen tutkimuksen eettisen lautakunnan päässä Hospital saksalaisten Trias I Pujol säädetty hyväksyntä tutkimusta varten.

Solulinjat

HCT116 koolonkarsinoomasoluja ja sen isogeenisistä johdannaisen kanssa kohdennetun inaktivaation p53 olivat lahja tri Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine). SW480 ja HT29 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Jälkimmäinen käytettiin emo-solujen OXA-resistentti alalinja HTOXAR3, joka saatiin tuloksena jatkuvan ja lisääntynyt altistuminen oksa kuten aiemmin on kuvattu [9]. Solulinjoja kasvatettiin yksikerrosviljelminä DMEM (HT29, SW480 ja HTOXAR3; Invitrogen Life Technologies) tai RPMI 1640 (HCT116 ja HCT116 p53 null; Invitrogen Life Technologies), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FCS: ää (Reactiva), 400 yksikköä /ml penisilliiniä, 40 ug /ml gentamysiiniä, ja 2 mM L-glutamiinia (Sigma) ja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Solut ajoittain testattiin saastumisen

Mycoplasma

ja olivat todistusvoimaisiksi lyhyitä tandem repeat profilointia.

Drugs

oksa valmistettiin veteen (1 mm) kantaliuosta ja varastoidaan -20 ° C: ssa. Lisälaimennukset lääkkeen tehtiin elatusaineeseen lopullisiin konsentraatioihin ennen käyttöä.

siRNA transfektiot

Solut ympättiin 60% konfluenssiin seerumissa ja antibiootti-free OptiMemiä väliaineessa (Invitrogen) 6 , 12 ja 96-kuoppalevyille, riippuen seuraavat kokeet. PKM2 oli ohimenevästi vaiennetaan käyttämällä kolmea eri siRNA kohdistaminen PKM2 (seq. NM_002654, NM_182470, NM_182471, Ambion). P53 ja BMF esto toteutettiin altaat 4 eri siRNA: iden (Smartpool On-tavoite plus:

TP53

, # L-003329;

BMF

, # L-004393-00, Dhamacon, GE). Transfektion aineena käytettiin Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Äänenvaimennin negatiivinen transkription kontrolli (Cat No. AM4611; Ambion) otettiin käyttöön kussakin kokeessa. Seuraavat 24 h transfektion väliaine korvattiin täysin DMEM tai RPMI 1640 väliaineiden täydennetty seerumia ja antibioottia. Validointi PKM2, p53 ja BMF knockdown arvioitiin qPCR ja Western blot (WB), ainoastaan ​​WB ja vain qPCR, vastaavasti. In hienosäätää kokeissa siGAPDH 3 nM positiivisena kontrollina (NM_002046, Ambion) ja ei-transfektoiduissa soluissa (Mock) otettiin käyttöön sen varmistamiseksi, että transfektio oli vain vähäinen vaikutus geenien ilmentyminen, leviämisen ja solujen elinkykyä (S1 Kuva).

Western blot

Solut homogenoitiin RIPA plus puskuri [fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS); NP-40 1%; Na deoxycolate 0,5%; SDS 0,1%; EDTA 1 mM; NaF 50 mM; NAvó

3 5 mM], joka sisältää cocktail EDTA-vapaata proteaasi-inhibiittorit (Roche). Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä käyttäen BCA Protein Assay Kit (Pierce) ja naudan seerumin albumiinia standardina. Kaksikymmentä mikrogrammaa proteiinia ladattiin ja suoritettiin elektroforeesi 10% SDS-PAGE-geeleissä (Invitrogen) ja siirrettiin PVDF-membraaneille (Bio Rad). 1 h kuluttua estää (LICOR Biosciences) kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kanin polyklonaalisella anti-PKM2 primaarista vasta-ainetta (Cell merkinanto 1: 1000), tai hiiren monoklonaalisella anti-p53 (Abcam; 1: 500). Kanin monoklonaalista anti-Actin (1: 2000) ja hiiren monoklonaalinen anti-α-Tubulin vasta-aineiden (1: 15000) (molemmat valmistajalta Sigma Aldrich) käytettiin sisäisen valvonnan. Kalvoja inkuboitiin IRDye kanin ja hiiren toissijainen vasta (1: 15000) (LICOR Biosciences) 45 minuuttia valolta suojattuna. Kalvot skannattiin käyttämällä Odyssey Imaging System ja analysoitiin Odyssey v2.0 ohjelmisto (LICOR Biosciences).

qPCR

Geenien ilmentyminen kokeet suoritettiin kuten kuvattu aiemmassa työssä [24]. Retrotransskription suoritettiin MMLV käänteiskopioijaentsyymin (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Alukkeita ja koettimia PKM2 (määritystä ei. Hs00762869_s1) ja BMF (Hs.00372938_m1) mRNA: n ilmentymisen analyysi hankittiin valmiista Applied Biosystems. PCR-tuote koko syntyy näillä alukkeilla oli 62 emäsparia PKM2 ja 59 emäsparia BMF. Suhteellinen geenin ilmentymisen määrän laskettiin vertailevan Ct menetelmällä kuten muualla on kuvattu, käyttämällä 18S (Stratagene), tai β-Actin (Applied Biosystems), kuten endogeeniset valvontaa. Kaikissa kokeissa, vain kolmena rinnakkaisena Ct-arvo pienempi kuin 0,20 SD hyväksyttiin. Lisäksi kunkin analysoidun näytteen, joka on retrotranscriptase miinus kontrolli ajettiin samalla levyllä varmistaa ettei genomista DNA saastuminen.

MTT

sytotoksisuus oksa arvioitiin 3- ( 4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) 2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) testi. Solut ympättiin ja transfektoitiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille (Nunc) tiheydellä 1000 (HT29 ja SW480) ja 2000 solua /kuoppa (HCT116). Neljäkymmentä kahdeksan tunnin kuluttua siRNA transfektion oksa lisättiin eri pitoisuuksina; Solujen elinkelpoisuus määritettiin 24 tuntia inkubaation jälkeen MTT-määritystä (Roche Diagnostics) [25]. Estävät pitoisuudet (IC, jotka vaihtelevat 10%: sta 90% solujen elinkelpoisuuden) määritettiin kussakin solulinjassa mediaani-vaikutus line-menetelmällä. Tiedot ilmoitetaan edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kolmen erillisen kokeen.

trypaanisineä tahra

Soluja kasvatettiin 12-kuoppalevyille ja käsiteltiin 15 uM oksa 24 tuntia. Kuluttua lääkkeen altistumista solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen DMEM-alustassa pitoisuutena 1×10

5 solua /ml. Sytotoksisuus arvioitiin käyttäen trypaanisinistä värjäystä. Kymmenen mikrolitraa 0,05% trypaanisinisellä (Invitrogen) sekoitettiin 10 ul: aan solususpensiota, levitettiin Neubauer kammion ja peitetään peitinlasilla. Vaikka Elävien solujen jättää väriaine ja näyttävät läpikuultavia, käyttökelvottomaksi solut näyttävät sinistynyt. Elinkelpoisuus ja kuolleisuutta vähintään 3 rinnakkaisnäytettä kustakin koetilalle kvantifioitiin.

anneksiini V /propidiumjodidia test

Apoptoosi määritettiin käyttämällä FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vähintään 10

4 solua per näyte analysoitiin käyttäen FACS Canto II virtaussytometrillä (Becton Dickinson Immunocytometry System). Vähintään 3 rinnakkaista per koeolosuhteissa analysoitiin. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit (sidospuskuri vain, propidiumjodidi (PI) vain, FITC-anneksiini V vain) käytettiin perustamaan asianmukaiset olosuhteet kompensoimiseksi ilmaisimet ja neljännestä. Oksa-solukuolema jälkeen BMF geenien mitattiin käyttämällä PI. BMF on vaimennettu käyttämällä siRNA kohdistamisen BMF kuten edellä on kuvattu. 72 tunnin kuluttua oksaliplatiinihoito, HT29 kerättiin Accutasella (Ref. A11105-01, Invitrogen) ja suspendoitiin kylmään PBS PI pitoisuus 3 uM. PI Fluoresenssi määritettiin FACSCanto II virtaussytometrillä (Becton Dickinson Immunocytometry System). BMF geenien vahvistettiin qPCR.

Solusyklianalyysiä

arvioimiseksi solusyklin jakelu solut otettiin talteen, pestiin PBS: ssä, kiinnitettiin 1 ml 70% jääkylmää etanolia ja varastoitiin 4 ° C vähintään 30 minuutin ajan. Pelletit suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: aan 0,1 M HCl-puskuria ja inkuboitiin 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Reaktiot pysäytettiin 2,5 ml: lla PBS: ää. Soluja inkuboitiin 1 ml: PI-värjäyksellä liuosta (30 uM (Applichem); RNAasi 200 ug /ml (Sigma)), vähintään 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Vähintään 10000 solua analysoitiin DNA sisällön käyttämällä FACS Canto II virtaussytometrillä (Becton Dickinson Immunocytometry System). Solujen osuus G1, S-vaiheessa ja G2 /M määritettiin käyttäen Flowjo Software v9.2.

Immunofluoresenssianalyysi

PKM2 solunosasijaintia havaittiin immunofluoresenssilla. 24 h kuluttua kiinnityskohdassa solussa kammiossa levyt (Millipore), soluja käsiteltiin oksa ja kiinnitetty peitinlasit kylmässä asetonissa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Esto ja läpäiseväksi tehtiin PBS-T /FBS 10%. Soluja inkuboitiin huoneenlämpötilassa kanin polyklonaalisella anti-PKM2 primaarista vasta-ainetta (Cell Signaling, 1: 100) 1,5 tuntia ja sen jälkeen, ja sekundaarinen vasta-aine anti-kani-Alexa-568 (Invitrogen, 1: 200). Tumat värjättiin DAPI kulta-mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää reagenssia (Invitrogen). Peitelaseja havaittiin fluoresenssimikroskoopilla Axiovision Z1 käyttäen Apotome järjestelmän 40x immersioöljy linssi (Carl Zeiss, Heidelberg, Saksa). Useita kuvia otettiin eri painopiste etäisyyksillä käyttäen z-pinoaminen (paksuus väli: 0,750-1 um) paikallistaa PKM2 eri polttovälin syvyyksiin.

qPCR array

Quantitative real-time PCR ( qRT-PCR) suoritettiin käyttäen Human solukuolemareittiin Finder PCR Array 384 HT (PAH-212Z, SA Biosciences), joka on qPCR Array sisältävän 84 solukuolemaan liittyviä geenejä. Lyhyesti, kokonais-RNA kerättiin solut käyttäen EZNA kokonais-RNA Kit I (Omega) ja käsiteltiin DNAasilla (Ambion). RNA kvantitoitiin kanssa Nanodrop TM ND-1000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific). RNA eheys ja puute genomisen saastumisen arvioitiin ajamalla näytteet 1% agaroosigeeleillä. Yhteensä 500 ng RNA: ta käytettiin käänteistranskriptioon RT

2 First Strand Kit (SA Biosciences). PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen RT

2 Profiler PCR array mainittiin ja RT

2 Reaaliaikainen SYBR Green PCR Master Mix (SA Biosciences) on 7900HT Fast Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosciences) ja seuraava valmistajan ohjeet. Suhteelliset muutokset geenien ilmentyminen laskettiin 2

^ – ACt (kynnys sykli) menetelmällä. Ne siivouspalveluista geenit, jotka eivät osoittaneet väliseen vaihteluun koeolosuhteet valittiin sisällytettävä array (RPLP0 ja ACTB) normalisoida cDNA määriä. Kolme riippumatonta biologinen rinnakkaista tehtiin.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen PASW tilastoista 18 (IBM) lukuun ottamatta annosvastekäyriltä analyysi, joka suoritettiin PRISM4 ohjelman ( GraphPad Software). Tilastolliset erot IC

50 määritettiin graafisesti annos-vaste käyrät ja myöhemmin ei-lineaarista regressioanalyysiä ja F-testin. U-Mann Whitneyn testiä käytettiin määrittämään solusyklin jakelu eroja. Vertailut eri koeolosuhteissa in qPCR Array ja BMF ilmaisun kokeet suoritettiin kautta T-Student testi. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä

P 0

.

05

.

Tulokset

PKM2 geenien sivupersoonat oksa herkkyys ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja

Edellisessä työssä löysimme alhaisempi tasot PKM2 proteiinin ja mRNA ilmaisun CRC solujen kehittynyt resistenssi oksa (HTOXAR3) ja kasvainten OXA vastaamattomia potilaita, erityisesti niitä, joilla on p53 [8]. Sen arvioimiseksi vaikutusta alaspäin säätäminen PKM2 on oksa vaste vanhempien soluissa, me nimenomaan esti PKM2 geenin ilmentymistä käyttämällä siRNA-oligonukleotidien HT29. Herkkyys oksa hallinnassa (siNTC) ja PKM2 taintumisen soluja (siPKM2) verrattiin MTT: llä. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia sen jälkeen, kun geenien, solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin 24 h oksa annoksilla, jotka vaihtelivat 0-30 uM. PKM2 pudotus tehokkuus oli suurempi kuin 95% sekä mRNA ja proteiini tasoilla ja kesti 96 tuntia tai enemmän (S1 Kuva). Kuten voidaan nähdä kuviosta 1, vuonna HT29, PKM2 hiljentäminen johtivat yli 40% lisäys oksa vastustuskyky verrattuna siNTC soluihin (fold = 1,42; p 0,0001) vahvistaa vaikutuksen PKM2 alassäätöä in oksaliplatiini vastus näissä soluissa. Nämä tulokset validoitu SW480-soluissa (fold = 1,61 p 0,0001), mutta ei HCT116 jossa PKM2 Knockdown liittyi suurempi herkkyys oksa (taittaa = 0,80; p = 0,007) (kuvio 1). Oletimme, että PKM2 vaikuttanut kasvaimen solut ”vastaus oksa riippuen lisätekijä /s. Yksi yksi mahdollisuus voisi olla mutaatiostatuksesta riippumatta p53 koska kaikki näissä solulinjoissa on epänormaali EGFR signalointireitin (HT29 satamat mutaatiot BRAF ja PI3K, HCT116 vuonna KRAS ja PI3K ja SW480 in KRAS), mutta esillä eri p53 mutaatiostatuksesta riippumatta (HT29 ja SW480 ovat p53 mutatoitunut ja HCT116 ovat p53 painosta). Osoittaakseen tämän hypoteesin, käytimme HCT116 isogeenisestä johdannaisen kohdennettua inaktivaation p53 (HCT116 p53 – /-) [26]. p53-tyhjä-solut olivat erittäin resistenttejä oksaliplatiinia, kuten aiemmin on raportoitu [27], mutta inhibition PKM2 geenin ilmentymisen johti jälleen laskuun oksaliplatiinin vastus (kuvio 2). Nämä tulokset osoittivat mahdollista vaikutusta ei riippuen paino- p53 vaan voitto-of-function (GOF) p53: n mutaatio. Tämän mukaan odotimme muutos oksaliplatiini herkkyys HT29-siPKM2 solujen jälkeen hiljentäminen p53-geenin ilmentymisen. Kuten on esitetty kuviossa 2, p53-geenin kaataa vuonna HT29 (siNTC) johti heikentynyt vastustuskyky oksaliplatiini, mutta näissä olosuhteissa puute PKM2 ilmaisun myös lisääntynyt vastus näissä soluissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että rooli PKM2 in oksaliplatiinin herkkyys on solulinja riippuvia ja että muut tekijät, poikkeaa p53

sinänsä

, mutta luultavasti liittyy p53-mutatoitunut karsinogeenisia yhteydessä voisi olla vaikuttaminen eri käyttäytyminen havaittiin näissä solulinjoissa jälkeen PKM2 geenien. Jatkotutkimukset ovat perusteltuja, jotta voidaan osoittaa tässä vaiheessa.

Annosvastekäyrät varten HT29, SW480 ja HCT116 solulinjoissa jälkeen PKM2 geenien ja oksa hoitoa 0-140 uM ja 0-32 uM 24 tuntia. Käyrät edustavat keskiarvoja vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Solujen proliferaatio mitattiin MTT-määrityksellä. Pystypalkit grafiikka edustavat ± SD. Sisäkkeet osoittavat PKM2 inmunoblotting jälkeen siRNA-suunnattu inhibition. Erityiset IC50-arvot oksaliplatiinin kaikissa olosuhteissa näkyvät taulukossa. IC50-arvot Mock olosuhteissa (ilman transfektio) olivat hyvin samanlaisia ​​kuin siNTC ja ei ole esitetty. * P-arvot ovat tulos verrattuna siNTC kunnossa.

Pylväät edustavat IC 50 ± SD (keskiarvoja vähintään kolmen itsenäisen kokeen) ja oksaliplatiinin kunkin kunnossa. Sisäkkeet osoittavat PKM2 ja p53 inmunoblotting jälkeen PKM2 geenien. Erityiset IC50-arvot oksaliplatiinin kaikissa olosuhteissa näkyvät taulukossa. IC50-arvot Mock olosuhteissa (ilman transfektio) olivat hyvin samanlaisia ​​kuin siNTC ja ei ole esitetty. * P-arvot ovat tulos verrattuna siNTC kunnossa. *

P arvo

0,05. **

P-arvo

0,01; ***

P-arvo

0,001

PKM2 geenien in HT29 liittyy lisäys solujen elinkelpoisuutta mutta ei laskua apoptoosin jälkeen oksa altistuksen

jälkeen tärkein tavoite, halusimme tietää, onko vaikutus PKM2 geenin hiljentäminen on oksaliplatiini resistenssin meidän

in vitro

mallissa johtui lisäys solujen elinkelpoisuuden vähenemiseen apoptoosin tai molemmat. PKM2 hiljennettiin vuonna HT29 ennen käsittelemällä niitä 15 uM oksa 24 tuntia. Vaikutuksia verrattiin hallita käsiteltyjä soluja samalla tavalla. Käyttämällä trypaanisinistä värjäystä, elinkelpoisuus hinnat välillä oksa käsiteltyjen (T) ja ei-käsiteltyjen (NT) solut laskettiin 0, 24 ja 48 h palautumisajat (hoidon jälkeen oxalplatin solut jätettiin toipua 0, 24 ja 48 h, vastaavasti). Kaksikymmentäneljä tuntia käsittelyn jälkeen (ajankohta 0h) selkeä vaikutus oksa havaittiin. Solupopulaation siNTC ja siPKM2 solujen pieneni vuoden kuluttua 48 h hoidon. Kuitenkin elinkelpoisuus oli hieman suurempi siPKM2 soluissa verrattuna siNTC soluihin kaikkina ajankohtina, mikä oli tilastollisesti merkitsevä 0 h (kuvio 3A ja 3B). Tämä seikka osoittaa, että PKM2 vaikuttaa oksa vastetta näissä soluissa. Tutkimiseksi edelleen myötävirtaan liittyviä mekanismeja PKM2 liittyviä kasvu elinkelpoisuutta vastauksena oksa, olemme analysoineet vaikutus apoptoosin avulla anneksiini V /PI kaksoisvärjäystä määrityksessä (kuvio 3C). Sytotoksisuus aiheuttama oksa ei merkittävästi muuttavan tasoa indusoi varhaisen apoptoosin vasta 48 tunnin kuluttua jatkuvan altistuksen (kuvio 2D). Lisäksi meillä ei löytänyt merkittäviä eroja apoptoosin aktivoitumisen välillä vaiennetaan PKM2 ja valvonta solujen läsnäollessa oksa mutta siellä oli suuntaus siNTC soluja kuoli suurempi osuus kuin siPKM2 soluja. Nämä tulokset vahvistavat ajatusta, että PKM2 osallistuu oksa kestävyys ja että apoptoosi ei ole pääasiallinen reaktiotie osallisena solukuoleman aktivoituu kun oksa altistuksen tässä solulinjassa.

Kun siRNA transfektion solut käsiteltiin 15 uM OXA 24 h ajan, havaittiin optisella mikroskopialla 0, 24 ja 48 tunnin päättymisen jälkeen lääkkeen altistumista (0 h viittaa soluihin, käsiteltiin 24 tunnin ajan; 24 h viittaa soluihin, käsiteltiin 24 tunnin ajan ja jätettiin toipua vielä 24 h) (A ) ja kvantifioidaan trypan blue -värjäyksellä (B). Apoptoosin aktivaation jälkeen 24 ja 48 tuntia 10 uM oksa altistus määritettiin FITC-anneksiini V /PI kaksoisvärjäystä (C), ja mitattiin suhde prosentteina apoptoottisten käsiteltyjen (T) ja ei-käsiteltyjen (NT) soluja (D) . Pystypalkit grafiikka edustavat ± SD. *

P-arvo

0,05. NT: ei-käsiteltyjen solujen. Optinen mikroskopia: Tavoitteena 10-kertainen suurennus.

Cell cycle jakelu jälkeen oksa valotuksen muuttaa PKM2 Knockdown vuonna HT29 mutta ei HCT116-solut

oksa on raportoitu muuttaa proteiinin ilmentymisen ja vakaus p53 mikä johtaa pidätykseen soluja G1 ja /tai G2 /M pääasiallisesti riippuen sen mutaatiostatuksesta riippumatta [5, 27-29]. Sen arvioimiseksi, jos PKM2 lauseke, oksa ja p53 mutaatiostatuksesta riippumatta aiheuttanut erilaisia ​​solusyklin etenemistä, tutkimme solusyklin jakautumista pitkin 72 h PKM2 vaiennetaan ja ohjaus HT29 ja HCT116-soluissa potilaan jatkuvaan 10pM oksa. Kuten on esitetty kuviossa 4, käsittelemättömät solut oli sama solusyklin jakautuminen, läsnä ollessa tai puuttuessa PKM2, mikä tarkoittaa, että tämä proteiini ei ole vaikutusta solusyklin säätelyssä

sinänsä

. Kuitenkin, OXA indusoi erilaisia ​​vasteita solusyklin kontrolli kahden solulinjojen. HCT116-solut käsiteltiin oksa pääosin säilytetty G1 ja G2 /M vaiheiden läpi 72 h jatkuva altistuminen platina huumeiden ja PKM2 ablaatio ei ollut merkittävää vaikutusta solusyklin jakeluun. Sen sijaan hoito HT29, johdatti heidät säilytetään S ja G2 /M vaiheiden pääasiassa. Nämä solut vaikutti merkittävästi PKM2 Knockdown viimeisten 48 ja 72 tunnin altistus (S vaiheessa olevien solujen: 67,2% siNTC vs. 48% siPKM2; p = 0,05; G2 /M vaiheessa olevien solujen: 66,5% siNTC vs. 39,7% siPKM2; p = 0,05). siPKM2-HT29 ei omista enempää kuin 24 tuntia missään vaiheessa solusyklin, jolloin vältetään solusyklin tarkastuspisteitä. Nämä tulokset vahvistavat, että CRC-solut reagoivat oksa muuttaa niiden solusykliä riippuen p53 mutaatiostatuksesta riippumatta ja PKM2 ilmaisun.

Molemmat solulinjat transfektoitiin ja /tai altistettiin 10 uM oksa 8, 24, 48 ja 72 tunnin . Jälkeen propidiumjodidivärjäys, solujen osuus solusyklin vaiheissa G1, S ja G2 /M mitattiin virtaussytometrialla ja kvantifioidaan Flowjo v9.2 ohjelmisto. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

P-arvot

≤ 0,05 ovat edustettuna *.

PKM2 siirtyy tumaan vastauksena oksa herkillä mutta ei resistenttien solujen

Se on osoitettu, että genotoksinen aiheuttamat vahingot UV ja oksidatiivisen stressin stimuloi PKM2 tumaansiirtymiseen edistää solukuolemaa [23]. Johtuen farmakologisista ominaisuuksista ja vaikutusmekanismi oksa, halusimme tietää, jos se voisi aiheuttaa samanlaisia ​​muutoksia PKM2 solunosasijaintia. Käsittelimme HCT116, HT29 ja HTOXAR3 solujen eri annoksilla lääkettä (1,65, 10 ja 30 uM) koko 72 h, ja havaitsimme PKM2 lokalisointi fluoresenssimikroskopiaa käyttäen. Kuten on esitetty kuviossa 5, on pohjapinta olosuhteissa PKM2 jaettiin sytoplasmassa kaikkien solulinjojen analysoitiin. Kuitenkin altistuminen oksa indusoi merkittäviä muutoksia PKM2 lokalisointiin HCT116 ja HT29 solulinjoissa mutta silmiinpistävän, nämä muutokset ei havaittu HTOXAR3 soluissa. Ohimenevä ydin- translokaatio PKM2 havaittiin HCT116-soluissa ensimmäisen 24 tunnin kuluttua 1,65 uM OXA altistumista. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, PKM2 siirtyi jälleen sytoplasmassa. Tällä hetkellä, suurin osa soluista ilmestyi kutistunut ja irrottaa korreloivat kasvu määrä indusoimaa solukuolemaa de lääkettä. Vuonna HT29, oksa aiheuttama progressiivinen ja kasvava ydinvoiman kertymistä PKM2 pitkin 72 h sekä 10 tai 30 uM. Solut, joissa PKM2 tumassa osoitti merkittävästi koko kasvaa ja esittää välimerkein ekspressiokuviota proteiinin. Sen sijaan, PKM2 pysyi sytoplasmassa HTOXAR3 solujen läpi kaikki hoidon ajankohtina alhainen (10 uM) ja IC

50 (30 uM) annosta platinan ainetta. Tärkeää on, HTOXAR3 solut osoittivat vähemmän PKM2 värjäytymistä kuin HT29 vahvistavia meidän aikaisemmat tulokset [8]. HT29 siPKM2 soluja käytettiin kontrollina vasta-aineen värjäyksen spesifisyys (S2 kuvassa).

Immunoflourescence värjäytymisen PKM2 (punainen) osoittaa ydin- kertymistä HCT116 ja HT29-solujen käsittelyn jälkeen oksa on ajasta ja annoksesta riippuvaisella tavalla mutta ei resistenttejä HTOXAR3 soluissa. Tumat värjättiin sinisellä. NT: Non-käsitellyt solut. Objektiivi: 40x immersioöljy. Mitta-asteikko: 10 um.

On raportoitu, että ydin- PKM2 ja tasot β-kateniinin fosforylaatio korreloi laadut gliooman pahanlaatuisen ja ennusteen [30]. Muut kirjoittajat ovat myös raportoineet pohjapinta PKM2 tumaanohjaussignaali ihmissolulinjoissa eri alkuperää, kuten peräsuolen syöpä [31]. Vahvista PKM2 solunosasijaintia ihmisen Kolorektaalituumorien ja sen mahdollista suhdetta koko β-kateniinin, analysoimme niiden immunohystochemical värjäytyminen kudoksessa microarray 41 kasvaimen näytteiden metastaattinen CRC potilaista, joka oli aiemmin käytetty meille [8]. Tuloksemme vahvistivat selvästi PKM2 sytoplasman tahra kaikissa kasvaimet analysoitiin (S3 kuvassa). On huomionarvoista, että nämä havainnot tehtiin käyttämällä 2 eri vasta-aineita (katso S1 File). PKM2 ja β-kateniinin olivat erittäin ilmaistaan ​​useimmissa kasvaimia analysoitiin, mutta emme löytäneet mitään positiivista korrelaatiota PKM2 ja β-kateniinin ydinvoiman lokalisointi.

PKM2 geenien muuttaa ekspressiokuvioita solukuoleman geenien CRC solulinjoja vastauksena oksa

Kuten on osoitettu tässä työssä, PKM2 siirtyy tumaan HT29-solujen vastauksena tähän platinavalmiste kun sen oksa-fenikoliresistenttiin solujen ei. Ottaen huomioon aikaisemmat tulokset liittämällä tumaansiirtymiseen ja PKM2 ja kaspaasi-riippumattoman solukuoleman polkuja [23], me arveltu, että PKM2 edistää geenien transkriptiota mukaan vastauksena OXA. Käyttämällä RT

2 Profiler qPCR Array olemme analysoineet ilmentymistä 84 avain liittyvistä geeneistä eri solukuolemaa mekanismeja (apoptoosin, nekroosi ja autophagy) selventämiseksi joka solukuolemareittiin /s tai geenin /s on merkittävä rooli vastauksena oksa ja onko PKM2 geenien vaikuttaa liittyvän transkriptio kuvioita. Voit tehdä, että HT29-soluja transfektoitiin erityisiä siRNA edellä kuvatulla tavalla, ja käsiteltiin oksa 10pM 48 h, jotta varmistetaan korkea ydinvoiman PKM2 (kuvio 5). Kuten on esitetty kuviossa 6A, malleja geenin ilmentymistä vasteena oksa olivat varsin erilainen eri HT29, siPKM2-HT29 ja HTOXAR3 soluja. Kuten odotimme, osuus vapautettu geenien seurauksena oksa altistus oli huomattavasti suurempi HT29 verrattuna HTOXAR3 koska 10gM oksa vastaa IC

50 herkkien solujen ja suunnilleen IC

25 HTOXAR3 soluja. Mielenkiintoista, siPKM2 solut osoittivat ”keskitason” kuvio solukuoleman geenien ilmentymisen. Kuten on selvästi esitetty lämpöä kartta kuviossa 6B, kun oksa hoidon, geeni-ilmentymisen profiili siPKM2 solujen oli lähempänä HTOXAR3 soluja kuin kuin herkkiä soluja. Kaksikymmentäkahdeksan näiden geenien osoitti korkeimman (fold-muutos) ja /tai tilastollisesti merkitseviä eroja koeolosuhteita analysoitu (taulukko 1 ja S1 taulukko). 0,05.