Krooninen sairaus

tiivistelmä

erittäin toistuvia Alu retroelements pidetään metylointi keskukset genomissa. Metylointi geenissä promoottorit voidaan levittää niistä. Promoottori metylaatio

MLH1

usein havaitaan syövissä, mutta taustalla mekanismi on epäselvä. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on ymmärtää, onko metylaatio Alu elementtejä liittyy promoottori metylaatio MLH1 geenissä. Bisulfiitti genomista sekvensointia käytettiin analysoimaan CpG sivustoja 5′(promoottori, eksoni 1 ja Alu sisältävää intronin 1) on

MLH1

geenin peräsuolen syövän soluja ja kudoksia, ja mahasyövän kudoksiin. Hypometylaatio että Alu elementtejä ja hypermetylaation että promoottorit ja alueiden välillä edistäjiä ja Alu elementit havaittiin kaksi syövän solulinjoissa ja seitsemän syöpä kudoksiin. Kuitenkin demetylaatio tai hypometylaatio on MLH1 promoottorin ja alueiden välillä promoottorin ja Alu elementtejä, ja hypermetylaation että Alu elementit, tunnistettiin normaaleissa kudoksissa.

MLH1

promoottori metylaatio voi levitä Alu elementtejä, jotka sijaitsevat introni 1

MLH1

geeni.

trans-toimivia

elementtejä sitoutuminen mutaatio sivustoja voisi olla rooli Metylointilaitteistoon leviämisen.

Citation: Wang X, Tuuletin J, Liu D, Fu S, Ingvarsson S, Chen H (2011) leviäminen Alu metylointi Järjestäjälle on

MLH1

Gene mahasyövän. PLoS ONE 6 (10): e25913. doi: 10,1371 /journal.pone.0025913

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 14 heinäkuu 2011; Hyväksytty 13 syyskuuta 2011; Julkaistu: 12 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat Huazhong tiede ja teknologia (2010MS034). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MLH1

on merkittävä virhepariutumista korjaava geeni, joka on tärkeä rooli ylläpitää vakautta genomin.

MLH1

toimintahäiriö voi aiheuttaa korkeaa geenimutaatioita genomin. Promoottori metylaatio

MLH1

, erityisesti C-aluetta (-310–240 suhteessa aloituskodoni), joka sisältää 8 CpG sivustoja, on yleinen tapahtuma syöpää, mikä voi aiheuttaa sen

MLH1

ilmaisun [1] – [3]. Tähän mennessä mekanismi

MLH1

metylaatio on epäselvä. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että

MLH1

metylaatio saattaa liittyä

MLH1

-93SNP [4], [5]. Kuitenkin molekulaarisen perustan takana ei tunneta.

Alu on yksi toistuvia elementtejä genomin, joka on hypermetyloitunut normaaleissa soluissa [6]. Alu elementit uskotaan olevan metylaation keskuksia genomissa [7]. Syövän,-geenin promoottori metylaatio voi levitä viereisiin toistuvia elementtejä [7]. Graff, et ai. [8] kartoitettiin metylaation on

E-kadheriinin

ja

von Hippel-Lindaun

tuumorisuppressorigeeneille sekä normaaleilla että neoplastisten solujen, ja totesi, että rajat välillä metyloitumattomalla promoottorien ja läheisille hypermetyloitunut Alu elementtejä, säilyttää metyloitumattomalla tilan promoottorien normaaleissa soluissa, ja että rajat saa vähitellen ohittaa käytännöillä metylaatio Alu elementtejä, jolloin promoottori metylaatio neoplasia.

kolme Alu elementit on tunnistettu in introni 1

MLH1

etsimällä tietokannasta ihmisen Alu toistoelementtiä (Fig. 1). Ei Alu elementit olemassa

MLH1

promoottorialueen. Metylaatiostatuksen kunkin CpG-Alu elementit

MLH1

ei ole tuotu esiin. On mahdollista, että

MLH1

promoottori metylaatio tapahtuu läheiseltä Alu elementtejä. Tämän testaamiseksi olemme analysoineet metylaatiostatuksen kaikkien CpG sivustoja

MLH1

5′(C-alue, joka sisältää promoottorin, eksonin 1 ja suurin osa introni 1) (Fig. 1) kolorektaalisyövässä solujen ja kudosten , mahasyöpä ja normaalit kudokset käyttävät bisulfiitti genomista sekvensointia, ja totesi, että Alu elementtejä introni 1

MLH1

ovat hypometyloidut ja promoottorit ja alueiden välillä

MLH1

promoottoreita ja Alu elementtejä ovat hypermetyloitunut syövissä. Kuitenkin normaaleissa kudoksissa Alu elementit hypermetyloitunut, ja promoottorit ja alueiden välillä promoottoreita ja Alu elementit eivät metyloituja tai hypometyloidut.

On kolme Alu elementtejä introni 1, joiden koot ja sijainnit esitetty nukleotidi numerot. Suhteellinen koot ja sijainnit 27 PCR amplikonista kuvattu rohkeita linjoja, jotka kattavat alueen -339-116 + 2876.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä tutkimus on hyväksynyt kistusneuvostolta Huazhong Science and Technology. Saimme kudosnäytteet kirjallisen tietoisen suostumuksen osallistujilta mukana tutkimuksessa. Eettisen toimikunnan erikseen hyväksynyt menettelyjä.

Normaali ja syöpänäytteissä

Kaksi peräsuolen syövän solulinjoissa, RKO ja SW48, jossa

MLH1

promoottori metylaatio [2] tilattiin Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). Kaikkiaan 188 peräsuolen ja 27 mahasyövän kudoksiin Hyväksytty normaali limakalvo saatiin Tongji sairaala (Wuhan, Kiina). Ääreisverestä terve yksilö oli myös saatu Tongji sairaalasta (Wuhan, Kiina).

Soluviljely ja DNA: n eristä-

Soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ° C 5% CO

2 ilmakehässä. DNA uutettiin soluista, syöpä kudoksiin, normaali limakalvo ja verinäytteiden avulla DNA eristyspakkausta (Sangon, Shanghai, Kiina) ja TIANamp genomista DNA Kit (Tiangen, Peking, Kiina).

ominaispiirteiden kasvainten

Kaikki tuumorit arvioitiin mikrosatelliitti epävakaus (MSI) käyttäen viittä microsatellite toistoja (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, ja D17S250), kuten aiemmin on kuvattu [1]. MSI kasvaimia, uutettu DNA muunnettiin käyttäen EZ DNA Metylointi Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA, USA).

MLH1

metylaation sytosiinit at -250 ja -252 suhteessa aloituskodonista arvioitiin käyttäen yhdistettiin bisulfiitin restriktioanalyysi (COBRA) kanssa BstUI [1].

immunohistokemiallinen (IHC) värjäys

IHC värjäyksen MLH1 proteiinien suoritettiin 5 um: n osia parafinoidut kasvain ja vieressä normaali kudos lohkojen vasta-MLH1 (ab92312, Abcam, UK). Leikkeet deparaffinised, vedettömät, ja huuhdeltiin vesijohtovedellä ennen antigeenin haku keittämällä 0,01 M sitraattipuskuria (pH 6,0) kaksi kertaa 5 min. Leikkeitä inkuboitiin vasta-aineiden kanssa yön yli 4 ° C: ssa. IHC värjäys visualisoitiin käyttämällä Strep ABC Complex /piparjuuri peroxidise (HPR). Kasvaimet luokitellaan värjäytymisen intensiteetti negatiiviseksi, heikosti positiivinen, kohtalaisen positiivisia ja vahvasti positiivinen.

bisulfiittimodifiointi genomista sekvensointia

COBRA-positiivista näytettä, metylaatiostatuksen

MLH1

5′- päässä määritettiin käyttäen bisulfiitin genomista sekvensointia. Oli yhteensä 27 PCR amplikonit peittävä alue -339-116 + 2876, suhteessa translaation aloituspaikasta (Fig. 1). Käytetyt alukkeet on esitetty taulukossa S1. PCR suoritettiin 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 55-61 ° C: ssa 45 sekuntia ja 72 ° C 1 min ja sen lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min. Kuuma käynnistys käytettiin lisäämällä entsyymin ensimmäisen jakson aikana noin 72 ° C, kun esi-inkubointi aika 5 minuuttia 95 ° C: ssa. PCR-tuotteet testattiin 2% agaroosigeelillä ja kloonattiin sitten Peasy-T1-vektoriin (transgeeniset Biotech, Peking, Kiina). Siirtomaa PCR tehtiin seulontaan pesäkkeet. Kloonien oikean kokoisia PCR-tuotteita sekvensoitiin ABI sekvensseri väriterminaattorit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Jossa sekvensointi tulokset viidestä kloonista, metylointi taajuus määritettiin kullekin CpG.

mutaatio seulonta

MLH1

5 ’päättyy metylointianalyysi sekvensoitiin käyttäen konvertoitumaton DNA syövän soluja ja kudoksia. 10 paria alukkeita käytetään on esitetty taulukossa 1. PCR suoritettiin 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 35 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 58-66 ° C: ssa 30 sekuntia ja 72 ° C: ssa 1 min lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min. Sitten PCR-tuotteet sekvensoitiin suoraan käyttäen ABI sekvensserin.

Tulokset

Seulonta peräsuolen ja mahasyövän kudosnäytteiden kanssa MLH1 promoottori metyloinnin

Niistä 188 peräsuolen ja 27 mahasyöpä kudoksiin, 48 peräsuolen ja 9 mahasyövän näytteen havaittiin olevan MSI positiivinen fenotyyppi. MSI positiivista näytettä tutkittiin sitten MLH1-promoottorin metylaation, ja 4 peräsuolen ja 3 mahasyövän näytteet omasivat MLH1-promoottorin metylaation (Fig. 2).

neljä peräsuolen syöpiä (C8T, C15T, C35T ja C156T) ja 3 syöpien (G9T, G19T ja G24T) analysoitiin. Symboli ”-” tarkoittaa, että PCR-tuotteet digestoitiin ilman

BstUI

, ja ”+” tarkoittaa pilkkomalla

BstUI

.

ry MLH1 metylaation ja negatiivinen tai heikko ilmentyminen MLH1

seitsemän MLH1 metylaatio näytteitä sekä niiden viereisten normaaleissa kudoksissa, analysoitiin MLH1 ilmaisun avulla IHC värjäystä. Kaikki seitsemän syöpäkudoksissa oli negatiivinen tai heikosti positiivisen ekspression MLH1, ja niiden viereiset normaalit kudokset oli voimakasta ekspressiota (Fig. 3).

A ja B edustavat peräsuolen kasvain (T) ja viereisen normaalin kudoksen (N ), vastaavasti; C ja D näyttää mahakasvaimen (T) ja viereisen normaalin kudoksen (N). V: negatiivinen värjäys; C: heikko värjäys; B ja D: voimakas värjäytyminen.

vertailu MLH1 metylaatiovyöhykkeiden välillä normaalit ja syövät

Yhteensä 93 CpG sivustoja sijaitsee alueella analysoitiin mitattiin metylaatiostatuksen käyttäen bisulfiitti genomista sekvensointi (Fig. 4). Kahden paksusuolen syövän solulinjat, neljä MSI positve peräsuolen syövän kudoksissa, ja kolme MSI positiivisen mahasyövän kudosten osoitti erilaisia ​​kuvioita verrattuna MSI negatiivinen peräsuolen syövän kudoksen, normaali ja peräsuolen ja mahan limakalvoa ja ääreisverenkierron (Fig. 5). MSI negatiivinen peräsuolen syövän kudosta, normaali peräsuolen ja mahan limakalvoa ja ääreisverenkierron näkyvät ei metylaatio

MLH1

promoottori, ja demetylaatio tai hypometylaatio (alle 50%) alueilla välillä promoottorien ja Alu elementtejä, kun taas alueiden sisällä tai myötävirtaan Alu elementtien näytteillä hypermetylaation (yli 50%). Sen sijaan, että peräsuolen syöpä solujen ja kudosten (MSI positiivinen) ja mahasyövän kudoksissa (MSI positiivinen),

MLH1

promoottoreita ja alueiden välillä promoottorien ja Alu elementit hypermetyloitunut, lukuun ottamatta hyvin harvat hypometyloidut CpG sivustoja. Kuitenkin alueilla, tai siitä alavirtaan Alu elementtien osoitti tiettyä hypometylaatio tai demetylaation verrattuna normaaleihin kudoksiin. Lisäksi hypometylaatio ja demetylaatio olivat useammin nähtävissä peräsuolen ja mahasyövän kudoksissa (MSI positiivinen) verrattuna peräsuolen syövän solut (Fig. 5).

CpG sivustot ovat korosti. Kloonit 1, 3 ja 4 näytetään metylaatio, ja kloonit 2 ja 5 ei metylaatio. Metylointi taajuus CpG on 60%. WT, villityypin; CT, muunnettu tyyppi.

Yhteensä 93 CpG sivustoja analysoidaan. Kuitenkin, 92 CpG sivustoja voidaan nähdä normaalissa paksusuolen ja peräsuolen limakalvon, koska siirtymä G A: n CpG välillä Alus 1 ja 2 •, ▴, ▪, □, △ ja ○ ovat metylaatio taajuudella 100%, 80%, 60%, 40%, 20% ja 0, vastaavasti. 80% osoittaa, että 5-kloonien, 4 näytteillä metylaation CpG-sivusto. RKO ja SW48: peräsuolen solut; C8T, C15T, C35T, C156T: MSI positiivinen peräsuolen syöpä kudoksia; C161T: MSI negatiivinen peräsuolen syöpä; C161N: C161T täsmäsi normaali kudos; ja G9T, G19T ja G24T: MSI positiivinen mahasyövistä.

mutaatio seulonta syöpäsoluissa ja kudosten

Mutaatiot

MLH1 5 ’

päättyy metylaation analyysi seulottiin 2 syöpäsoluja ja 7 syöpäkudoksissa. Yksi peräsuolen ja yksi mahasyövän kudosta havaittiin mutaatioita verrattuna niiden viereisten normaaleissa kudoksissa (Fig. 6). Yksi peräsuolen ja yksi mahasyövän näytteillä identtisen heterotsygoottinen mutaatio, A → G, samassa paikassa, IVS1 +681 bp. Niiden vieressä normaalit kudokset eivät osoittaneet mutaatio, joka osoittaa, että se on somaattinen ja kasvainspesifisiä.

Yksi peräsuolen ja yksi mahasyövän, C15T ja G19T, osoitti identtisen heterotsygoottinen mutaatio, A → G, samaan site, IVS1 +681 bp. Niiden vieressä normaaleissa kudoksissa, C15N ja G19N, ei näytä mutaatiota. Nuolet näyttää sivustoja mutaatioista.

Keskustelu

metylaation Alu elementtien

MLH1

ei ole aikaisemmin tutkittu normaaleissa kudoksissa. Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet metylaatiostatuksen CpG sivustojen kolmen Alu elementit sijaitsevat introni 1

MLH1

, ja totesi, että kaikki kolme Alu elementit ovat tasoilla hypermetylaation normaaleissa peräsuolen ja mahan limakalvoa ja ääreisverenkierron (Fig. 5). Se on linjassa aiempien toteamisesta Alu elementit hypermetyloitunut normaalissa mahalaukun limakalvon, rintojen epiteelin ja munuaisten kudosten [6], [8]. MSI negatiivinen peräsuolen kasvain näkyy hyvin samanlainen metylaatio kuin normaaleissa kudoksissa (kuvio. 5). Normaalisti metylaation Alu elementtejä ei levinnyt viereisiin CpG-saarekkeiden vuoksi tukos jonka SP1 elementit [9], [10]. Täällä kävi ilmi, että alueet ylävirtaan Alu elementit ovat metyloitumattomia tai hypometyloidut normaalissa peräsuolen ja mahan limakalvoa ja ääreisverenkierron. Selkeät rajat nähdään välillä hypermetyloitunut Alu elementtien ja hypometyloidut ylävirtaan heistä (Fig. 5). On olemassa useita hypometyloidut CpG sivustoja ylävirtaan Alu elementtien normaaleissa kudoksissa, ja ne CpG sivustot ovat pois C-aluetta (Fig. 5), mikä viittaa rajallinen leviäminen Alu metylaation normaaleissa soluissa. Jotkut CpG paikoissa ympäri tai sen sisällä Alu elementit normaaleissa kudoksissa näytetään alle 100% metylaatio (Fig. 5), mikä viittaa siihen, että metylaatio yksittäisiä kohtia, ei ole kloonaamalla saatu, vaikka yleisen mallin metylaation lähetetään solusta soluun. Tämän mukaisesti, on osoitettu, että hiiren adeniinifosforibosyylitransferaasi geeni on metylaation, jotka eroavat maksan soluihin [10]. Mekanismi takana tämä voisi olla, että metylaatio keskukset identtiset geenit eri soluissa on vaihteleva voimakkuus kulkevan signaalin ylävirtaan tai alavirtaan [11].

Häiriöt SP1 elementtien helpottaa

de novo

metylaatio viereisen CpG sivustoja [9], [10], [12], ja indusoi epigeneettisiä geenin inaktivaatio [12]. On ehdotettu, että Alu elementit ovat metylaation keskuksia genomissa [8]. Metylointi kuviot Alu elementtien

MLH1

denaturoidulla peräsuolen syövän solut RKO ja SW48 ei ole tutkittu aikaisemmin. RKO ja SW48 on todettu olevan metylaatio

MLH1

promoottorialue, etenkin C-alueen (-310–240 suhteessa aloituskodoni), joka aiheuttaa vähensi

MLH1

ilmaisun [2]. Tässä tutkimuksessa analysoitiin myös metylaatiovyöhykkeiden

MLH1

promoottorit, kolme Alu elementtejä ja alueiden välillä promoottorien ja Alu elementtejä. Verrattuna normaaliin peräsuolen ja mahan limakalvoa ja ääreisverenkierron, Alu elementit osoitti hypometylaatio erityisesti Alus 2 ja 3 sekä RKO ja SW48. Lisäksi alueen alavirtaan Alu 3 osoitti hypometylaatio sekä RKO ja SW48 (Fig. 5). Kuitenkin promoottorit ja erityisesti alueet välillä promoottorien ja Alu-elementit hypermetyloitunut RKO ja SW48 (Fig. 5). Tämä viittaa vahvasti siihen, että

MLH1

promoottorin metylaation leviää metylaation keskusten intronin 1

MLH1

.

Koska viljellyt syöpäsolulinjat katsotaan olevan korkeampi metylaatio kuin ensisijainen kasvaimia [13], päätimme analysoida primäärikasvaimissa varten MLH1 metylaatiokuvion samoilla alueilla kuin solulinjat. Jonkin verran vähäisempi metylaation havaittiin MLH1 promoottori alue 4 MSI positiivinen peräsuolen ja 3 MSI positiivinen mahasyöpä verrattuna kahdessa solulinjassa (kuvio. 5). Kuitenkin hypermetyloitunut promoottorit, erityisesti C alueilla, ja alueiden välillä promoottorien ja Alu elementit nähdään kaikissa seitsemässä syövät analysoitiin. Jotkin alueet sisällä ja ympärillä Alu-elementit ilmeisesti hypometyloidut kasvainkudoksessa. Näin ollen tiedot syöpäsoluissa viittaavat vahvasti siihen, että metylaatio on leviämässä Alu elementtejä 5 ’alueen MLH1 MSI positiivinen peräsuolen ja mahasyövän kudoksissa, samoin kuin, että paksusuolen syövän solulinjat. Alu hypometylaatio on havaittu mahakarsinoomat ja melanoomasolulinjat [6], [14]. Toinen toistuva sekvenssi, LINE-1, osoitti myös hypometylaatio pahanlaatuisissa ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet [15]. Hypometylaatio saattaa lisätä pahanlaatuistumisriskin kasvainten indusoimalla kertyminen kromosomipoikkeavuuksien tai metylointi leviää promoottorien tuumorisuppressorigeeneille. Näin metylaatio toistuvia sekvenssit voivat olla hyödyllinen markkeri maligniteetti arviointiin.

SP1 elementti tunnistettiin -119 on

MLH1

promoottorialueen avulla transkriptiotekijä hakuohjelmistomme (TFSEARCH ver.1.3 ). Sen selvittämiseksi, onko mutaatiot SP1 elementti, sekvensoimme koko alueen analysoitu edellä syövän solulinjoissa ja kudoksissa. Ei mutaatiot SP1 elementti havaittiin, mutta yksi MSI positiivinen peräsuolen ja yksi MSI positiivinen mahasyövän osoitti A → G mutaatio, samassa paikassa, IVS1 +681 bp MLH1 geenissä. Tämä sivusto on promoottorin ja Alu elementtejä. Meidän havainto viittaa siihen, että alue on mutational hotspot patogeneesissä peräsuolen ja mahasyövässä. Me spekuloida, että

trans-toimivia

elementtejä sitoutumisesta tämän sivuston, tai muihin sivustoihin, jotka ovat välillä promoottori ja Alu elementtejä, voi olla osallisena Metylointilaitteistoon leviämässä Alu elementtejä promoottorialueen. Näin ollen nämä

transaktivoivia

tekijät voisivat käyttäytyä vartijoina Metylointilaitteistoon keskuksia, esim. Alu elementtejä. Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta etsimään niille

transaktivoivia

elementtejä, jotka voivat olla hoitotavoitteet syöpien tulevaisuudessa.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Oligonukleotidi sekvenssit alukkeiden metylointianalyysi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0025913.s001

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Anna Yates kriittisesti tarkistaa käsikirjoituksen.