Krooninen sairaus

tiivistelmä

Immuunijärjestelmä paeta ja etäpesäke ovat tunnusmerkkejä useiden syöpätyyppien kuten virtsarakon syöpä. Yksi mekanismeista mukana näissä prosesseissa on yhdistetty indoleamine 2,3-dioksigenaasin (IDO). Vaikka IDO on perinteisesti tunnustettu sen immunomodulaarisia omaisuutta, se on esittänyt nonimmunological vaikutuksia joissakin kasvaimissa. TGF-β1 uskotaan edistää kohdunkaulan kehitystä moduloimalla immunosuppressiivista molekyylejä, mukaan lukien IDO. Lisäksi TGF-β1 indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka on kriittinen vaihe kasvaimen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden. Olemme tutkineet rooli MT ja IDO modulaatio induktioon EMT TGF-β1 in T24 ihmisen virtsarakon syöpä soluja. Kun T24 soluja inkuboitiin IDO estäjän (MT, 1-metyyli-D-tryptofaani), jossa on TGF-β1, ja MT + TGF-β1, merkittävä lasku IDO ilmaisun ja aktiivisuutta havaittiin. Lisäksi, downregulation E-kadheriinin ja ylössäätely n-kadheriinin ja EMT transkriptiotekijöiden indusoitiin hoitoja, vahvistaa induktio EMT. siRNA-välitteisen knockdovvn IDO vähentynyt sähköisen kadheriiniekspressiota, mutta ei vaikuttanut EMT transkriptiotekijät. Vuonna scratch-haavan määrityksessä kohonnut siirtoprosessi tiivistyi, kun soluja inkuboitiin MT + TGF-β1. Nämä vaikutukset liittyivät vankka esto Akt aktivointia. Siirrostuksen jälkeen ja T24-solujen munuaiskotelon alle Balb /c-nude-solut olivat positiivisia IDO on keskellä soluinfiltraatin, on negatiivinen periferiassa, jossa EMT on korkea. Lopuksi esto IDO TGF-β1 ja MT liittyy EMT T24 ihmisen virtsarakon syöpä soluja. MT on tehostava vaikutus TGF-β1 aiheuttama EMT riippumatta IDO. Tämä nonimmunological vaikutus MT olisi harkittava, jos IDO on tavoite välttää immuuni paeta virtsarakon syöpään.

Citation: Brito RBO, Maltan CS, Souza DM, Matheus LHG, Matos YST, Silva CS, et al. (2015) 1-metyyli-D-tryptofaani Voimistaa TGF-β-indusoidun Epithelial-mesenkymaalitransitioon in T24 ihmisen virtsarakon syövän soluissa. PLoS ONE 10 (8): e0134858. doi: 10,1371 /journal.pone.0134858

Editor: Michael Platten Yliopistosairaalassa Heidelberg, Saksa

vastaanotettu: 28 tammikuu 2015; Hyväksytty: 14 heinäkuu 2015; Julkaistu: 12 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Brito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat São Paulo Research Foundation (FAPESP) myöntää 2012 /04423-0, https://www.fapesp.br/.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

virtsarakon syöpä on yleisin maligniteetti virtsateiden [1]. Vaikka yleisin ihmisen virtsarakon syöpä on ei-lihaksen invasiivisia (70%: sta 80%), 30%: sta 50% näistä tapauksista edistystä lihas-invasiivisia muodossa toistuvan asemointia, joka lopulta johtaa syöpään erityisiä kuoleman ja etäpesäkkeiden [2].

Useita mekanismeja on liitetty kasvainten invasiivisuus ja etäpesäkkeiden, mukaan lukien epiteeli- mesenkymaalitransitioon (EMT). Tässä menetelmässä, joka on polarisoitunut epiteelisolujen oletetaan mesenkymaalisten fenotyyppi, joka johtaa menetykseen soluadheesion tyvikalvon, aktivointi liikkuvuutta ja invasiivisuus, ja tuotanto ekstrasellulaarisen matriisin hajottavien entsyymien [3]. Useita molekyylejä harjoittavat aloittamisesta EMT, kuten TGF-β-superperheen proteiineista. TGF-β1 on tärkeä induktori EMT useissa eri kasvaimissa [4], mukaan lukien virtsarakon syöpä [5]. Tietyt geneettiset variaatiot ja suurentaa plasman TGF-β ovat voimakkaita ennustavat virtsarakon syövän riskiä [6,7].

indoleamine 2,3-dioksigenaasin (IDO) on entsyymi, joka katalysoi hajoamista aminohapon tryptofaani, mikä johtaa kertyminen tryptofaanin metaboliittien, kuten kynureniini. Kuten kuvattu Munn et al., IDO on rooli äidistä käyttöliittymä ja toiminnot suojaamaan alkioita vastaan ​​äidin immuunijärjestelmä [8]. Myöhemmin IDO on tutkittu käytettäväksi tehokkaana immunomodulaattorimolekyylina. Koska IDO valmistetaan monia solutyyppejä immuunijärjestelmän, mukaan lukien dendriittisolut, makrofagit, ja säätelijä-T-solujen, IDO on liitetty immuunivälitteisiä häiriöitä, kuten siirteen hylkimistä [9], autoimmuunisairaudet [10] ja paeta kasvainten vastainen immuniteetti syöpää [11]. Mitä syöpä, IDO aktiivisuus on läsnä monissa ihmisen kasvainten tyyppejä sekä kasvaimeen tyhjennys imusolmukkeet [11]; kuitenkin, rooli IDO kasvaimen kasvussa on edelleen huonosti ymmärretty. Vaikka IDO ilmentyminen korreloi epäedullisempaan ennuste monien syöpien mukaan lukien peräsuolen [12], kohdun kohdunkaulan [13], kohdun limakalvon [14], rintojen [15], melanooma [16], munasarjojen [17], ja keuhkosyöpä [18], IDO ilmentyminen liittyy myös uusiutumista elinaika hepatosellulaaristen potilaista [19] ja pitkän aikavälin eloonjäämistä munuaisten syöpä [20]. Vaikka on olemassa kiistaa siitä roolista IDO syövässä, molekyylejä, jotka voivat moduloida IDO-välitteistä väyliä on pidetty lupaava syövän hoitoon. Tässä yhteydessä, 1-metyyli-D-tryptofaani, kilpaileva estäjä IDO, on tutkittu intensiivisesti kuin syöpälääke. Tällä hetkellä yhdistys 1-metyyli-D-tryptofaani (MT) doketakseliin käytettiin vaiheen I kliinisen tutkimuksen Metastasoivassa kiinteä kasvain [21]. Kuitenkin, tämä molekyyli voi toimia itsenäisesti IDO toimintaa [22], sekä, kuten tryptofaania säädellä mTOR reitti [23].

IDO ilmentyminen on havaittu ei ainoastaan ​​kasvain-infiltroivien immuunisolujen ja kasvaimen tyhjennys imusolmukkeisiin, mutta myös neoplastisten solujen. Virtsarakon syöpä, T24 ihmisen siirtymäkauden masolulinjassa tuottaa IDO konstitutiivisesti viljelmässä [24], vaikka ei osallistu immuunijärjestelmän, mikä johtaa olettamukseen, että IDO voi olla rooli ei-immuuni prosesseja. Levina et ai., Osoittivat, että säätelyä IDO rintasyöpäsoluissa lisääntynyt solujen proliferaatiota ja vähentynyttä apoptoosia tavalla, joka on riippumaton immunologisia vaikutuksia IDO [25].

Mielenkiintoista, TGF-β indusoi tolerogeenisen fenotyypin immunogeeninen dendriittisoluissa, ja tämä vaikutus välittyy IDO aktivaation kautta PI3K /Akt-reitillä [26]. Koska TGF-β indusoi EMT in T24 rakkosyöpä- soluihin [27, 28], me arveltu, että modulaatio IDO voi liittyä TGF-β induktioon EMT in T24 karsinoomasoluja. Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet vaikutuksia MT ja siRNA-välitteinen knockdovvn IDO koealuerahastoon-β aiheuttama EMT in T24 rakkosyöpä- soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen virtsarakon syöpä T24 soluja (HTB-4; American Type Culture Collection-ATCC, Manassas, VA, USA) hankittiin solusta pankin Federal University of Rio de Janeiro. T24-soluja viljeltiin McCoyn 5A-Medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia ja penisilliiniä-streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2.

vaikutuksen analysoimiseksi TGF-β1 on IDO ilmaisun, T24-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille (1×10

5 solua kuoppaa kohti). Soluja inkuboitiin 1 ng /ml, 5 ng /ml tai 10 ng /ml TGF-β1 (R alustaa, joka sisälsi 1 mM metyyli-tryptofaani (MT, 1-metyyli-D-tryptofaani, cat 452483, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); väliaineessa, joka sisältää TGF-β1 (5 ng /ml); ja alustaa, joka sisälsi MT plus TGF-β1. Lopussa 48 h, supernatantit kerättiin kynurenine mittaus, ja solujen yksisolukerrokset trypsinoitiin RNA. Tämä koe toistettiin proteiinien eristämiseksi.

Sirna (siRNA) transfektion

Jotta pudotus endogeenisen IDO, T24-soluja transfektoitiin siRNA IDO (Äänenvaimennin Valitse inventoitu 4392420, Ambion, Carlsbad, CA) tai ei-kohdistuksen ohjaus siRNA transfektioon ohjaus (Äänenvaimennin Valitse Negative Control inventoitu 4390843, Ambion, Carlsbad, CA) käyttäen Lipofectamine 3000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Lyhyesti, soluja viljeltiin 6 kuoppalevyillä, ja sitten pidettiin seerumittomassa McCoy alustassa, joka sisälsi (per kuoppa) 1 ug siRNA, 5 ui P3000 reagenssia, ja 5 ui Lipofectamine 3000 Reagent, aikana 24 h. Transfektion jälkeen väliaine poistettiin ja soluja viljeltiin 24 h McCoyn 5A Medium täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Tämän jälkeen toipumisaika, soluja inkuboitiin TGF-β1 (5 ng /ml, 48 h, seerumittomassa McCoy väliaineessa), aivan kuten aiemmin on kuvattu. Seuraavat neljä edellytystä kolmena kappaleena tehtiin: T24 soluja aiemmin transfektoitu ohjaus siRNA (si-Control), ilman TGF-β 1; T24 soluja aiemmin transfektoitu IDO siRNA inkuboitiin ilman TGF-β 1 (siIDO); T24 soluja aiemmin transfektoitu ohjaus siRNA inkuboitiin TGF-β 1 (TGF-β); ja T24-solujen on aiemmin transfektoitu IDO siRNA inkuboitiin TGF-β1 (siIDO + TGF-β).

RT-qPCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen PureLink RNA Mini Kit (Ambion Inc, Carlsbad , CA), mukaisesti valmistajan ohjeiden ja ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin M-MLV (Promega, Madison, WI) jälkeen DNaasikäsittely (Promega, Madison, WI). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Virta SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA). Spesifisiä alukkeita TBP (

TATA sitovan proteiinin

; välittämään 5′-TTCGGAGAGTTCTGGGATTGTA-3 ’ja reverse 5′-TGGACTGTTCTTCACTCTTGGC-3′; hakunumero NM003194), IDO (eteenpäin 5’-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3 ’ja reverse 5’- ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 ’; hakunumero NM002164), E-cad (eteenpäin 5′- GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3′ ja reverse 5’- ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 ’; hakunumero Z18923), N-cad (eteenpäin 5’- TGCCCGGTTTCATTTAGGGG -3 ’ja reverse 5′- TCCCTCAGGAACTGTCCCAT-3′; hakunumero X57548), TWIST (eteenpäin 5’- AGAGATGCAACTAAGCCCTCT-3 ’ja reverse 5′- AAGCAGCTACTGACAGGCAC-3′; hakunumero Y11177), etana (eteenpäin 5’- ACCACTATGCCGCGCTCTT -3 ’ja reverse 5′-GGTCGTAGGGCTGCTGGAA-3′; hakunumero NM005985), ja Slug (eteenpäin 5’-TGTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3 ’ja reverse 5′-GACCCTGGTTGCTTCAAGGA-3’; hakunumero NM003068) käytettiin. Kolmena kappaleena kustakin näytteestä kuumennettiin 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja käsiteltiin sitten 40 sykliä denaturointi 95 ° C 15 sekuntia, pariutuminen 60 ° C: ssa 60 sekunnin ajan ja laajentamisesta 60 ° C: ssa 60 sekuntia. Nämä reaktiot suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Ca, USA). Sen jälkeen kun reaaliaikainen PCR-syklin kynnys (C

t) määritettiin taloudenhoito geeni (TBP) sekä kohdegeenien automaattisella lähtötilanteen ja automaattisen kynnyksen olosuhteissa. Normalisoitu geenien ilmentyminen tietoja käyttämällä ΔΔC

t (ACk

t viite- ACk

t tavoite) ja kaava 2

-ΔΔCt, käytettiin lisäanalyysiä.

Western blot

Western blot -analyysi suoritettiin analysoida IDO ilmaisun ja Akt /Pakt signalointireitin aktivaatio. Lyhyesti, kokonais-proteiini uutettiin T24 solujen hajotuspuskuria (50 mM Tris-Base, 1 mm EDTA, 0,5 uM PMSF, 0,001% Triton X-100, 0,1 mM AEBSF, 0,08 uM aprotiniinin, 4 uM bestatiinia, 1,4 uM E- 64, 2,0 uM leupeptiiniä ja 1,5 uM pepstatiini). Sata mikrogrammaa kokonais-proteiinin denaturoitiin ja ladattiin 12% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) -polyacrylamide elektroforeesilla geelillä ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle puolikuiva elektroblottaus (Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Sen jälkeen, kun esto ei-rasvattoman maidon, kalvoja inkuboitiin 1: 250 hiiren anti-humaani IDO (MAB5412; Merck Millipore, Billerica, MA) tai 1: 1000 kanin anti-humaani-fosfo-Akt (MAB 2965, Cell Signaling Technology Inc ., Danvers, MA). Havaitsemisen jälkeen tehostetulla kemiluminesenssilla (ECL-havaitsemisjärjestelmä; Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ), anti-IDO ja anti-fosfo-Akt-kalvot stripattiin strippaus-puskuria (62,5 mM Tris-HCl: ää, 2% SDS: ää, 0 , 1 M 2-merkaptoetanolia), ja inkuboitiin 1: 5000 hiiren anti-humaani-β-aktiini (A1978, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja 1: 1000 kanin anti-humaani-Akt (MAB 4685, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), vastaavasti. Havaitsemiseen, 1: 5000 vuohen anti-kani IgG HRP-konjugoitua (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja 1: 5000 vuohen anti-hiiri-IgG HRP-konjugoitu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) sekundääriset vasta-aineet käytettiin.

kynureniini mittaus

HPLC suoritettiin mittaamaan kynurenine soluviljelmässä supernatanteista. Näytteet poistettiin proteiinit sentrifugoimalla 5000 g (15 min 4 ° C: ssa), jossa 10% trikloorietikkahappoa (1: 1, v /v). Samanaikaisesti, standardikäyrän rakennettiin seuraavat pitoisuudet: 0,5 uM, 1,0 uM, 2,0 uM, 4,0 uM, 8,0 uM, ja 16,0 uM. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantit ja standardit suodatetaan 0,22 um: n ruiskun ladattu suodata ja ratkaista liikkuvana faasina asetonitriilin ja natriumasetaattipuskuria (4:96, v /v), pH 4,7. Esikolonni on 12.5X4.6 mm ja sarakkeessa 250X4.6 mm (5 um; Agilent Hypesil ODS, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) käytettiin. Huippu edustavat kynurenine havaittiin kanssa ChemStation Agilent ohjelmisto (G2170AA, Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

Scratch-haavan muuttoliike ja siirtokuoppaan invaasio määritykset

scratch-haavan määrityksissä, T24 solut siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille (5×10

4 kuoppaa kohden) ja niitä viljeltiin, kunnes saavutettiin 80% konfluenssiin (24-30 h). Soluja pidettiin seerumivapaassa McCoyn 5A Medium 24 tuntia ja käsiteltiin sitten seuraavasti (kolmena kappaleena): MT (1 mM), TGF-β1 (5 ng /ml), ja TGF-β1 + MT. Soluja ylläpidettiin seerumittomassa väliaineessa edusti kontrolli. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 24 tuntia käsittelyn kanssa, supernatantit poistettiin ja lisättiin tuoretta väliainetta (10% FBS). Yksi naarmu kuoppaa kohti suoritettiin käyttäen 200 ui pipetin kärki ja neljä kuvaa kuoppaa kohti otettiin 40X suurennoksella alle käännettyä mikroskooppia (Ti-S; Nikon Corp., Tokio, Japani). Kolmen tunnin kuluttua, lisäkuvia hankittu. Jokainen scratch-haavan alue laskettiin käyttäen ImageProPlus 6.0 -ohjelman (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD).

TranswellTM invaasio määritykset suoritettiin myös. Siirtoaltaat oli varustettu kalvoilla (6,5 mm: n halkaisija, 8,0 mm: n huokoskoon, Corning Inc., NY), päällystetty BD Matrigelillä tyvikalvon Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA), jonka pitoisuus on 3 mg /ml, ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Soluja käsiteltiin kuten on kuvattu alusta-haavan määrityksessä, ja ympätään sitten päälle Matrigel pinnoite seerumia (kolmena kappaleena). Solujen annettiin kulkeutua 6 h ja 24 h kohti kammioon, joka sisältää McCoyn väliaineessa, jota täydensi 20% naudan sikiön seerumia. Inkuboinnin jälkeen kalvot kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin hematoksyliinillä. Lukumäärä siirtynyt solujen määritettiin mikroskoopilla suurennuksella (400X).

eläinmallissa invaasio analyysiä

Kaikki eläinkokeiden hyväksyttiin Nove de Julho University Institutional Animal Care ja Käytä komitea.

kolme BALB /c-nude-hiiriä (5-6 viikkoa vanhoja) käytettiin. Hiiriä pidettiin yksittäin ilmanvaihto häkeissä suodatettua ilmaa (Alesco, Capivari, Sao Paulo, Brasilia) on vapaa pääsy veden ja ruoan. Vatsaonteloon ketamiinia (100 mg /kg; Ketamin-S, Sao Paulo, Brasilia) ja ksylatsiinilla (10 mg /kg; Rompun®, Bayer, Leverkusen, Saksa) käytettiin saavuttaa yleisanestesiaa. 10 mm lannerangan viilto suoritettiin käyttää vasen munuainen. T24-soluja (1×10

6) resuspendoitiin 10 ui PBS: ää, ja ympättiin munuaiskotelon alle käyttäen 21 G-neula on kiinnitetty 100 ul-Hamilton ruisku (Hamilton Company, Reno, Nevada). Huolellisen rokotus, kapsulaarinen viilto myöhemmin cauterized. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin 28 päivää. On 28

päivänä, hiiret nukutettiin ketamiini /ksylatsiinilla, jonka jälkeen laparotomy ja thoracotomy tarkistaa etäpesäkkeitä. Kunkin hiiri, midcoronal osa vasen munuainen kiinnitettiin Duboscq-Brasiliassa ratkaisu 60 minuuttia sen jälkeen postitse-fiksaatio puskuroidussa 10% formaldehydiliuosta kunnes parafiiniupotusta. Osiot (3 pm paksu) värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja sitten käytetään immunohistokemiallisesti. Histologista analyysiä käytettiin läsnäolon toteamiseksi T24-solujen subkapsulaariseen tilaan ja munuaisten parenchyma.

immunohistokemia

Parafiinisektioista alistettiin mikroaaltosäteilytyksen sitraattipuskurissa parantaa antigeenin haku. Biotiini Blocking (X0590, Dako Co, Tanska) ja rasvattoman maidon esto käytettiin ennen primaarisen vasta-aineen inkubointi. Hiiren anti-humaani IDO (MAB5412; Merck Millipore, Billerica, MA) (01:25) käytettiin primaarisena vasta-aineena analysointia varten IDO ilmaisua. Viimeistele voileipä, leikkeitä inkuboitiin LSAB + System-HRP reagenssit (K0690, Dako Co, Tanska). Lopuksi, DAB substraatti-kromogeeni käytettiin reaktion loppuun saattamiseksi (K346811; Dako Co, Tanska).

Tilastollinen analyysi

Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. Parametristen data, yksisuuntainen varianssianalyysi kanssa pairwise vertailu suoritettiin mukaan Newman-Keuls muotoilua. Ei-parametrinen data, Kruskal-Wallis tai Wilcoxonin sovellettiin. P-arvo on alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

TGF-β1 ja MT estävät IDO ilmaisu

inkubointi T24-solujen TGF-β1 merkittävästi vähentynyt IDO ilme (kuvio 1), kaikkien testattujen pitoisuuksien. Kuten kuviossa 2A, hoidon MT ja MT + TGF-β1 vähensi merkittävästi ilmentymistä IDO in T24-soluissa (suhteellinen ekspressio 0,16 ± 0,18 vs. 1,00 ± 0,01). Tämä vaikutus havaittiin myös tuloksia Western blotting varten IDO proteiinin (kuvio 2B). Arvioida IDO aktiivisuus, kynureniini mitattiin supernatantissa T24-soluissa käyttäen HPLC: tä. Pitoisuus kynurenine oli merkittävästi vähentynyt inkubaation jälkeen MT, TGF-β1 ja MT + TGF-β1 (0,59 ± 0,12 uM, 0,29 ± 0,02 uM, ja 0,38 ± 0,06 uM vastaavasti vs. 3,45 ± 0,16 uM Control ; p 0,0001) (kuvio 2C).

IDO ilmentyminen säädeltiin vähentävästi TGF-β in T24-soluissa.

(A) IDO ilmentyminen reaaliaikaisella PCR, (B ) Western blotting IDO, ja (C) IDO aktiivisuus arvioitiin kynurenine mittaus supernatantissa.

MT voimistaa EMT geeniekspressiota

merkittävä väheneminen havaittiin Ecad ilmaisutapoja MT ja TGF-β1 hoitoja (kuvio 3A). Sen sijaan, Ncad ilmentyminen merkitsevästi lisääntynyt TGF-β1 jälkeen (kuvio 3B), vaikutus, joka oli voimistua yhdistelmä TGF-β1 MT (yli 8-kertaiseksi verrattuna TGF-β1 yksin). Lisäksi, ekspression EMT liittyvien transkriptiotekijöiden (Twist, Snail ja Slug) lisättiin TGF-β1, ja käsittely TGF-β1 yhdessä MT tehostetun tämän vaikutuksen (kuvio 3C, 3D ja 3E).

Suhteellinen mRNA tasoja (A) E-kadheriinin (epiteelin merkki), (B) N-kadheriinin (mesenkymaalisten merkki), ja (CE) EMT-liittyvä transkriptiotekijöitä (Twist, etana ja Slug). Association of MT ja TGF-β1 voimisti EMT in T24-soluissa, vähentämällä E-kadheriinin ilmentymisen ja upregulating kelan geenit EMT. * P 0,05 vs. kontrolli;

# p 0,05 vs. MT;

† p 0,05 vs. TGF-β.

siRNA-välitteisen knockdovvn IDO ja ilmentymisen EMT merkkiaineiden

käyttö siRNA oli tehokkuuden äänenvaimennusjärjestelmissä IDO geeniekspression . Kuten osoitetaan kuviossa 4, siIDO merkittävästi vähentynyt ilmentyminen IDO in T24-soluissa. Merkittävä väheneminen IDO ilmaisun jälkeen havaittiin ärsyke TGF-β1, joiden mukaan tehostettiin yhdistyessään siIDO (kuvio 4). Mitä EMT markkereita, siIDO vähensi Ecad ilmaisun, ja sen yhteydessä TGF-β1 potensoi tätä vaikutusta ei kuitenkaan tilastollista merkittävyyttä havaittiin (kuvio 5A). Vaikka siIDO osoittivat vaikutusta Ecad ilmaisun, siIDO ollut vaikutusta ilmaus N-kadheriinin ja EMT transkriptiotekijöitä (Twist, Etana, ja Slug) (kuvio 5).

Negatiivinen kontrolli-siRNA käytettiin Si-ohjaus ja TGF-β olosuhteissa. Merkittävä väheneminen IDO ilmentymistä havaittiin siIDO soluissa, ja TGF-β-stimuloiduista soluista. Yhdistyksen siIDO ja TGF-β indusoi selvempi vähentäminen IDO ilmaisun.

Suhteellinen mRNA tasoja (A) E-kadheriinin (epiteelin merkki), (B) N-kadheriinin (mesenkymaaliset merkki), ja (CE) EMT-liittyvä transkriptiotekijöitä (Twist, etana ja Slug). siRNA-välitteisen knockdovvn IDO vähensi tehokkaasti E-cad ilmaisun, ja sen yhteydessä TGF-β voimisti tätä vaikutusta. Kuitenkin knockdovvn IDO yksinään ei ollut vaikutusta in N-cad ilmaisua, sekä ilmentymistä EMT-transkriptiotekijöiden. Vain TGF-β toiminut asiakkuutta ilmaus N-cad ja EMT-transkriptiotekijöiden, ja sen yhteys siIDO ei muuttanut tätä vaikutusta. * P 0,05 vs. kontrolli;

# p 0,05 vs. MT.

Scratch-haava ja siirtokuoppaan invaasio määritykset

scratch-haavan määritys, migraation kapasiteetti T24 soluja arvioitiin mittaamalla pinta-ala vaeltavien solujen. Kuten osoitettu kuviossa 6, 3 tunnin kuluttua käyttöönoton naarmuuntumista haavan, MT ja TGF-β1 indusoi nopeamman siirtymisen on T24 soluja verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Tämä nosti siirtoprosessi tiivistyi, kun soluja inkuboitiin TGF-β1 plus MT (kuvio 6A ja 6B).

(A) Kuvat otettiin 40X suurennoksella alle käännettyä mikroskooppia, kolmen tunnin kuluttua alusta muodostumisen. (B) haavan sulkeminen oli merkittävästi nopeampaa MT + TGF-β verrattuna Ohjaus.

T24 soluinvaasiota tutkittiin rekonstruoitu Matrigel sisään Transvvell- kammioissa. 6 tunnin kuluttua inkuboinnin, kohonneen invaasio vaikutus havaittiin, kun soluja inkuboitiin TGF-β1 plus MT, mutta tulos ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 7). 24 tunnin inkubaation, ei havaittavaa eroa ei havaittu eri ryhmien (Kuva 7).

Vaikka suuremman tason invasiivisen kapasiteetin havaittiin T24-soluissa 6 tunnin TGF-β ja MT + TGF- β hoito, ei tilastollista merkittävyyttä ei havaittu. Jälkeen muuttoliike 24 tunnin ajan, mitään eroa ei havaittu.

Akt aktivointi

analysoimiseksi Akt-reitin aktivaatio, Western blottaus suoritettiin kokeita. Kuten osoitettu kuviossa 8, inkubointi T24 soluja MT, TGF-β1 tai MT + TGF-β1 edistänyt vankka estyminen Akt aktivoinnin.

PI3K /Akt-reitin aktivaatio määritettiin Western blotting varten Akt ja fosforia Akt in T24 solulysaateista. 48 tunnin kuluttua inkubaation MT, TGF-β, ja MT + TGF-β, alentunut taso fosfo-Akt havaittiin. Esto PI3K /Akt-reitin liittyy EMT in T24-soluissa.

In vivo

analyysi

analysoimiseksi IDO ilmaisun

in vivo

, T24-soluja ympättiin munuaiskotelon alle nude-hiiriin. Neljä viikkoa siirrostuksen jälkeen tunnistimme T24-soluissa munuaiskotelon alle. Lisäksi T24 solujen havaittiin tunkeutuu munuaisperuskudoksen kohti munuaisydinkalvonäyte (S1 Kuva). Immunohistokemiallinen analyysi IDO ilmaisun paljasti, että subkapsulaarista ja soluttautuminen T24 solut olivat positiivisia IDO. Ilmaisulla IDO sijaitsi spesifisesti keskelle solun infiltraatiota (kuvio 9).

IDO-positiivisia soluja havaittiin suodoksesta keskustassa (nuoli), mutta IDO-negatiivisia soluja esiintyy lähinnä kehän infiltraatiota (nuolenkärki). IDO immunovärjäyksellä ei havaittu munuaisten parenchyma (tähti).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet ei-immunologinen rooli MT ja IDO syövän etenemiseen ja levittäminen etenkin EMT. Virtsarakon karsinooma T24-solut ekspressoivat konstitutiivisesti IDO, jopa ilman immuunijärjestelmää. Pystyimme aiheuttaa EMT in T24-solujen TGF-β1, ja tämä vaikutus korreloi downregulation IDO. Kun käytämme MT tai IDO siRNA, EMT voimistivat, erityisesti MT.

EMT on prosessi, jossa epiteelisolujen hankkia invasiivisen fenotyyppi, aiheuttavat systeemisen leviämisen pahanlaatuisia soluja. Aikana EMT, geenit ilmentyvät jotka lopulta toimivat vapauttaa solunsisäisiä biokemiallisia reittejä, joka edistää sellaisen pahanlaatuisen fenotyypin. Tutkimuksessamme olemme arvioitiin prosessi, vähentyneen ilmentämisen E-kadheriinin jälkeen kasvavat N-kadheriinin ilmentymisen, prosessin, jota kutsutaan ”kadheriinin kytkentä” kuvaamaan EMT T24-soluissa [29]. EMT on tärkeä rooli virtsarakon syövän, joissa liikkuvuus, invaasio, ja anti-apoptoottiset mekanismit tarvitaan etäpesäkkeiden [30].

TGF-β1 indusoi EMT tietyntyyppisten kudosten, kuten virtsarakon syöpä. T24-solut ekspressoivat TGF-β-reseptorin 1 ja siRNA-pohjainen inhibition TGF-β-reseptorin 1 estää motiliteettia ja invasiivisuus näiden solujen [27]. Tutkimuksessamme T24 soluja hankittu mesenkymaaliset ominaisuuksia, kuten mesenkymaalisten merkki ilmaisun ja liikkuvuuteen, sen jälkeen TGF-β1 ärsyke. Mielenkiintoista, TGF-β1 indusoi EMT ja esti IDO ilmentymistä T24-soluissa. Lisäksi, MT, joka on myös vähentynyt IDO ilmaisu, tehostettu TGF-β-driven EMT.

siRNA-välitteinen pudotus IDO vähensi merkittävästi E-kadheriinin ilmentymisen, mutta mesenkymaaliset markkereita ei ole muutettu. Koska MT lisäsi merkittävästi ekspressiota mesenkymaalisten markkereita, nämä tulokset osoittavat, että IDO polku mahdollisesti osallistuu EMT T24-soluissa, mutta MT on vaikutusta voimistavan TGF-β1-indusoidun EMT riippumatta IDO. Metz et ai osoittivat, että MT: llä on vaikutusta dendriittisoluissa riippumatta IDO asiakkuutta mTOR-reitin (Metz). On tärkeää huomata, että mTOR liittyy vahvasti EMT virtsarakon syöpä [31]. On mahdollista, että MT välittää mTOR väylän T24-soluissa, mutta tämä mekanismi ei ole tutkittu tutkimuksessamme.

tutkimus on ensimmäinen tutkia suhdetta TGF-β1 ja IDO in T24-soluissa. Kuitenkin, on olemassa tutkimuksia, jotka osoittavat, että TGF-β1 voi moduloida IDO ilmentymisen tietyntyyppisten solujen. Yuan et al. osoittivat, että vaikka IDO ilmaisua voidaan indusoida fibroblastien stimulaation jälkeen INF-gamma, TGF-β1 kumoaa tämän vaikutuksen vaikuttamatta INF-gamma ilmaisun [32]. Sitä vastoin TGF-β1 indusoidun IDO ilmentymisen dendriittisoluissa kautta PI3K /Akt ja noncanonical NFK-β reittejä, jotka johtavat tolerogeenisen fenotyypin [26]. Mekanismeja yhdistää TGF-β ja IDO ei ole täysin selvitetty, mutta hieman uskottava mekanismi on kuvattu Pallotta ja Grohmann [33]. Heidän tutkimukset tukevat teoriaa, että TGF-β annetaan sääntelyn vaikutuksia IDO synteesiin. Lisäksi IDO voi aiheuttaa sen vaikutuksia mekanismilla, joka on riippumaton sen entsyymin aktiivisuus [33].

Tutkimuksessamme arvioimme PI3K /Akt-reitin aktivaatio käyttämällä Western blotting for Akt /fosfo-Akt. Hoidon MT: n ja TGF-β1 merkittävästi vähentynyt fosfo-Akt tasoja, mikä osoittaa, että TGF-β-ajettu EMT T24-soluissa liittyy downregulation tämän reitin. Monissa solutyypeissä, TGF-β-indusoidun EMT liittyy PI3K /Akt-reitin säätelyä; kuitenkin T24-soluissa on epäselvää. Al-Azayzih et ai. analysoidaan fosfo-Akt in T24-soluissa inkuboinnin jälkeen TGF-β1 (kuten käytetty meidän kokeita, 5 ng /ml), ja ne eivät ole voineet määrittää ero fosfo-Akt tasolla [34]. Koska vaikutus fosfo-Akt-tasojen voi johtua pituus TGF-β1 hoitoon. Vaikka ne käytetään itämisajan 24 tuntia, käytimme 48 tuntia. Lisäksi Iliopoulos et ai. käytetyt Akt – /- soluja, jotka osoittavat, että Akt1 pudotus edistää TGF-β-indusoidun EMT MCF10A soluissa. Tämä vaikutus osoitettiin olevan riippuvainen spesifisten MikroRNA [35]. Tässä yhteydessä roolia Akt EMT voivat vaihdella mallista riippuen järjestelmään.

Lisäksi kadheriinin kytkentä ja merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen EMT liittyvien transkriptiotekijöiden (Twist, Etana, ja Slug), T24-soluissa käsitelty TGF-β plus MT havaittu olevan vaeltavia kapasiteettia ja invasiivisuus. Sen lisäksi, että

in vitro

kokeissa T24-soluja ympättiin munuaisissa subkapsulaariseen tilaan Balb /c-nude-hiirissä. Sen jälkeen, kun 4 viikkoa, T24-solujen havaittiin munuaisten parenchyma kohti ydin. Immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että T24-soluissa keskellä suodoksesta oli positiivinen IDO, kun taas reuna-soluja IDO-negatiivinen. On mahdollista, että reuna-solujen infiltraatiota menetti IDO ilmaisu hankkia invasiivisen fenotyypin. Lisätutkimukset ovat tarpeen selventää tätä mekanismia.

Yhteenvetona MT ja downregulation IDO liittyy EMT in T24 ihmisen virtsarakon syöpä soluja, ja tämä vaikutus voidaan käynnistää TGF-β1. Vaikka IDO estäminen on houkutteleva syövän hoitoon, koska IDO suvaitsevaisuutta kasvaimiin, The nonimmunological vaikutukset välittyvät MT ja muut IDO modulaattorit ansaitsevat huomiota virtsarakon syöpään. Kuten näkökulmasta inhibiittorit IDO on yhdistettävä muihin luokkiin huumeiden syövän hoitoon minimoida mahdolliset aiheutuvat haitalliset vaikutukset näillä aineilla.

tukeminen Information

S1 Kuva. Histologia munuaisten kudoksen jälkeen subkapsulaarista siirrostuksen T24 soluja.

Analysoimiseksi T24 soluinvaasiota

in vivo

, me ympätty 1×10

6 solua munuaiskotelon alle. Histologia (hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäytyminen) arvioitiin 28 päivää istutuksen jälkeen. (A) T24 soluja munuaisten kapseli (nuolenkärki), ja (B) T24-solut tunkeutuu munuaisperuskudoksen kohti munuaisydinkalvonäyte (nuoli). Munuaisten parenchyma on merkitty tähdellä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0134858.s001

(TIF) B

Kiitokset

Olemme vilpittömästi kiitollisia Angela Batista Gomes dos Santos ja Samara niiden teknistä apua.