Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kasvain pidetään heterogeeninen monimutkainen kolmiulotteinen ympäristö, joka on huuhdella patofysiologista ja biomekaaniset signaaleja. Cell-stroomavuorovaikutuksiin ohjata kehitystä ja sukupolven kasvaimia. Täällä me arvioida maksut normaalien fibroblastien syöpään.

Menetelmät /Principal Havainnot

coculturing normaalien fibroblastien yksikerrosviljelmiin of BGC-823 mahalaukun syöpäsolut, tuumorisolut satunnaisesti kehitetty lyhyt, kara -kuten morfologiset ominaisuudet ja osoitti parannettu leviämisen ja invasiivisia potentiaalia. Lisäksi transformoituja kasvainsoluja osoittanut laski kasvaimen muodostumisen ja lisääntynyt lymphomatic ja suoliston metastaattisen potentiaalia. Ei-transformoitujen BGC-823-solut, sen sijaan, osoitti ensisijaisen kasvaimen muodostumisen ja viivästynyt suoliston ja imusolmukkeiden invaasion. Havaitsimme myös E-kadheriinin menetys ja ylössäätelyyn vimentiinista ilmentymisen transformoituja kasvainsoluja, mikä viittasi siihen, että kasvu etäpesäkkeiden indusoitiin epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon.

Johtopäätös

Yhdessä , meidän tiedot osoittivat, että normaalien fibroblastien riittävän indusoi epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon syöpäsoluissa, mikä johtaa etäpesäkkeitä.

Citation: Xu W, Hu X, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et ai. (2014) normaalien fibroblastien Pakotettava E-kadheriinin Loss ja lisätä imusolmukemääritysmenetelmä Etäpesäke mahasyövän. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10,1371 /journal.pone.0097306

Editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Iso-Britannia

vastaanotettu: 10 joulukuu 2013; Hyväksytty: 16 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 20, 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Health Key Special Fund (https://program.most.gov.cn; No.200802112), National Science Fund komitean (https://www.nsfc.gov.cn; yleinen hanke nro .81372302 No.81272120), Health Department Fund (https://program.most.gov.cn; No.2007A093), Key Project Zhejiangin maakunnassa (https://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). Natural Science Fund of Zhejiang (https://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121, ja Z2080514), ja perinteinen kiinalainen lääketiede Bureau Fund (https://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäkkeitä ovat vastuussa jopa 90% syöpään liittyvien kuolleisuus. Monet potilaat, jotka osoittavat ole näyttöä etäpesäke on alustavan diagnoosin lopulta kehittyy etäpesäkkeitä. Vaikka etäpesäkkeet aiheuttavat eniten syöpäkuolemista, tämä prosessi on edelleen yksi arvoituksellinen näkökohtia tauti.

Metastaattinen kasvainsolut tulevat kudoksen kautta ekstravasaatio. Kudos, mutta läpikäy epäselvää prosesseja, joiden solut upotettu kudosmatriksin ja tulevat suoraan kosketukseen stroomasolut, joista useimmat ovat normaaleja fibroblasteja. Kasvainsolujen on kaikki mahdollisuudet kosketuksissa stroomasolut, mukaan lukien neoplastiset ja metastaattisen solut [1]. Tämä johtaa vastavuoroisen cross-talk normaali fibroblastien kudoksessa.

fibroblasteja runsain stroomasoluihin, ja ne stimuloivat microenvironment ja toimii runsaasti varten paracrine koulutusjakson aikana kasvaimen kehittymisen ja etenemisen. Vaikutukset normaalien fibroblastien kasvainsoluihin ovat kiistetty. On raportoitu, että normaalien fibroblastien tukahduttaa pahanlaatuinen muuntaminen ikuistettu eturauhasen epiteelin [2], kun taas rintojen kasvaimia, fibroblastien muuttaa duktaalikarsinooma osaksi invasiivisen kohdunkaulan [3].

Tämä ristiriita osoittaa, että vaikutus fibroblastien kasvainsoluihin on erilainen kuin valuuttalisiin (syöpään liittyvä fibroblasteja). Tätä tutkimusta varten me viljellään kasvainsolujen normaalien fibroblastien petrimaljoille, jotta jäljitellä kuinka kasvainsoluihin yhteyttä fibroblasteissa. Keskityimme osuus normaalien fibroblastien syöpään. Olemme viljeltiin normaalin fibroblastien muodostaa tiheän yksisolukerroksiin, jotka sitten levitetään kasvainsolujen jotta jäljitellä metastaattisen kasvainsoluja. Oletimme, että korkea suhde fibroblastien tuumorisoluihin voi jäljitellä kudoksiin, joissa metastasized kasvainsolujen oleskella. Näin ollen ihon fibroblastit terveistä yksilöistä käytettiin tuottamaan solun ympäristöön. Mahasyövän solulinja, BGC-823, käytettiin tässä, koska se on morfologisesti eroaa fibroblasteista.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen linjaus

Ensisijainen ihmisen ihon kudoksia saatiin lapsilta, jotka tehtiin ympärileikkaus saatuaan kirjallinen lupa niiden talonmiesten, jotka sisältyvät niiden potilastietoja. Tämä koe tarkasteli ja hyväksynyt Institutional Review Board of Second Affiliated sairaala Zhejiangin yliopistossa School of Medicine (eettisen arvioinnin koodi: Research 2013-047). Potilaat mukana tässä tutkimuksessa oli varustettu jäljennös kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja antoi luvan julkaista.

Kaikki kokeet tehtiin mukaan suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals neuvoston Science and Technology Kiinassa. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Animal Care ja käyttö komitean Zhejiangin yliopistossa.

reagenssit ja vasta-

G-penisilliiniä /streptomysiiniä, fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), Triton X-100, naudan seerumin albumiini, kollagenaasi tyyppi I, ja trypsiini ostettiin Jinuo (Kiina). High-glukoosi DMEM saatiin yhtiöstä Gibco (Kiina), ja naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Gibco (SA). Sisplatiini, 5-fluoriurasiili, puromysiini, ja I-tyyppistä kollageenia hankittiin Sigmalta (USA). Sisplatiini liuotettiin dimetyyliformamidiin (DMF), 5-fluorourasiili DMSO: ssa, ja puromysiinin PBS: ssä, jotta kantaliuoksia, jotka säilytettiin sitten -20 ° C: ssa. Kollageeni tyyppi I (5 mg /ml) laimennettiin 1 mg /ml. DAPI (4,6-diamino-2-fenyyli · HCl) PBS: ssä saatiin Roche, ja vuohen anti-hiiri ja kani-lgG, sekundaarinen vasta-aine-TIRTC, ja sekundaariset vasta-aineet on saatu ZSGB-Bio (Kiina). Antihumaani-E-kadheriinin kani (ab40772), anti-ihmis-vimentiinistä kani (ab92547), ja anti-ihmis-β-kateniinin kanin vasta-aineita (ab9274) saatiin Abcam (UK). Antihumaani-pan-CK hiiren vasta-aineen (C11) ja N-kadheriinin kani-vasta-aine (C4061) saatiin Cell Signaling Technology (Kiina), ja anti-ihmis-β-aktiini ja toisen vuohen anti-kani-vasta-aineet on saatu Boster (Kiina) . Vasta-aineet laimennettiin 5% FBS työskennellä pitoisuuksia ellei toisin mainita.

Cell Culture

vakiintuneesta solulinjasta, ihmisen mahasyövän BGC-823 soluja käytetään meidän kokeessa ostettiin solusta pankin Guangzhou instituutin biolääketieteen ja terveyden. Solut sulatettiin ja siirrostettiin 4-5 kertaa ja sitten käytettiin yhdessä viljelemisen kokeissa. Alkuperäisistä ihon fibroblasteista saatiin kirurgisista näytteistä lapsista oli tehty ympärileikkaus ja tarjotaan tietoon perustuvan suostumuksen. Fibroblasteja käytettiin jälkeen kolmas kanava (50 kohtia), viljeltiin korkean glukoosin DMEM, joka sisälsi 10% FBS, ja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa (5% CO

2) 37 ° C: ssa. Soluelatusainetta vaihdettiin joka toinen päivä.

sukupolven TBGCs, fibroblastit (FB) ja BGC-823-soluja viljeltiin yhdessä suhteessa 10:01 vielä 10 päivää sen jälkeen, kun viljeltyjä soluja saavutettu yhtymäkohta. Kupoli muodostuminen havaittiin yhdessä viljelemisen järjestelmä. Solun seos trypsinisaatiolla tuoretta fibroblasteissa (1 x 10

6 solua /ml). Toisella ja myöhempien kohtia, näennäinen doom muodostumista ja keskeytetty pyöreä solut näyttivät jolla oli erilaisia ​​morfologisia ominaisuuksia ja pitkittynyt kiinnityksen jälkeen kulkua. Viidennen kulkua sekoitetun keskeytetty solut ja tiheä normaalien fibroblastien, yhtenäinen, lyhyt, kara kaltaisia ​​soluja kutsutaan ”TBGCs” tuotettu eikä osoittanut morfologisia paluuta BGC-823-solujen vasta 10-15 kohtia.

proliferaatiotestillä

Eksponentiaalisesti kasvavat solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille vielä 6 päivää inkuboinnin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Solujen proliferaatio mitattiin viitenä päivittäin pipetoimalla 20 ui CellTiter 96 vesikerros Solution Reagent (Promega, USA) kuhunkin kuoppaan, jotka sisälsivät 100 ui korkean glukoosin DMEM, sitten soluja inkuboitiin vielä 2 tuntia, ennen kuin määritetään suhteellinen absorbanssi 490 nm käyttäen mikrotiitterilevyn lukijaa.

Drug inhibitiomääritys

Viisi päällekkäisyyksiä eksponentiaalisesti kasvavat solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 24 tuntia. 24 tunnin kuluttua väliaine korvattiin eri pitoisuuksilla lääkkeitä (0-80 uM) ja viljeltiin vielä 24 tuntia. Drug toksisuutta arvioitiin mittaamalla elinkykyisten solujen lukumäärä käyttäen lisääntymisen määritys edellä kuvatulla tavalla.

raapiminen Pitoisuus

Solut ympättiin 24-kuoppalevyille (5 x 10

4 solua /hyvin) ja viljeltiin konfluenssiin. Pipetinkärjet käytettiin tuottamaan naarmuja. PBS: ää käytettiin solujäänteiden poistamiseksi, sitten korvattiin FBS-alustassa. Kuvat saatiin 3 peräkkäisenä päivänä. Leveys tyhjästä mitattiin ImageJ 1,47 ohjelmisto Windows (https://rsb.info.nih.gov/ij/) ja piirrettiin naarmu etäisyyden päivässä.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

Cell motiliteettia määrityksiin suoritettiin käyttäen transwell-irto-(8 um huokoskoko) (Corning, USA). Solut-GFP (vihreä fluoresoiva proteiini) (1 x 10

5/500 ui) suspendoitiin FBS-alustassa, ja yläpuolella insertit kolmena kappaleena, ja 800 ui elatusaineeseen ladattu alla. Yön yli inkuboinnin jälkeen, uppo pestiin 3 x PBS: llä ja pyyhitään kostutetun moppi yläpuolella, jossa kiinnitettiin 4% PFA alla ja havaittu käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Olympus, Japani). Samaa menettelyä käytetään suorittamaan invaasiomääritys, mutta teriä, jotka esipäällystettiin Matrigel (BD, USA) käytettiin. Molemmat määritykset määrä määritetään solujen lukumäärä laskettiin 5 random kentät (200-kertainen suurennus).

Apoptosis Assay

Apoptoottiset solut mitattiin käyttämällä anneksiini V-FITC apoptoosin detektioreagenssipakkaus (Keygen, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut olivat joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin lääkkeitä 24 tunnin ajan, ja sitten talteen, pestiin kahdesti PBS: llä, suspendoitiin uudelleen sitoutumispuskuriin, joka sisälsi 5 ui FITC-anneksiini V: n ja 5 ui PE, ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Analyysi suoritettiin käyttämällä virtaussytometriaa (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA).

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Tumauutteet valmistettiin käyttäen RNeasy mini-kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhdistettu RNA-näytteet (1 ug) DEPC vettä käänteistranskriptoituneet käyttäen PrimeScript II ensimmäinen Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Kiina). RT-PCR ja monistus suoritettiin käyttäen SYBR Esiseos Ex Taq II -kittiä (Takara).

20 ui reaktioseosta, joka sisältää 1 ui laimennettua cDNA: ta näytettä, 10 ui SYBR Esiseos Ex Taq II (2 x), 0,4 ui ROX Viite Dye (50 x), 7 ui steriiliä kahdesti tislattua H

2O ja 1 ui eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita (katso materiaalit ja menetelmät S1) valmistettiin ja arvioitiin käyttäen sulamiskäyräanalyysi ja vertaileva kynnys (Ct) menetelmä. Seuraavat pyöräily olosuhteita käytettiin: 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 58 ° C: ssa 1 minuutti. GAPDH käytettiin kontrollina geenin.

Western blot -analyysi

Proteiinit uutettiin eksponentiaalisesti kasvavia soluja ja ensisijainen kudoksissa. Uutteet keitettiin latauspuskurissa, eroteltiin 10% Tris-HCl SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Millipore, USA) käyttäen standardimenetelmiä. Membraanit blokattiin käyttämällä 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween-20 (TBST) ja 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Membraanit pestiin TBST: llä ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden E-kadheriinin (1:5000), vimentiinistä (1:5000), β-kateniinin (1:5000), N-kadheriinin (1:1000), ja β-aktiini (1:1000). Pesun jälkeen 3 x TBST: llä, sekundaarinen vuohen anti-kani (1:1000) lisättiin ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Lopuksi immuuni komplekseja visualisoitiin kemiluminesenssin avulla ECL (Electro Chemical luminenssi) (Millipore). Proteiinipitoisuus normalisoidaan P-aktiini.

Histologinen ja immunohistokemiallinen analyysit

Näytteet pakastettiin nopeasti nestemäisessä typessä, säilytetään -80 ° C: ssa, kiinnitettiin 4% PFA, ja niin että voitiin jonka paksuus on 10 um (LEICA, Saksa).

hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäyksen parafiini objektilasit värjättiin hematoksyliinillä 15 minuuttia, pestiin 3 x PBS: llä, hapolla alkoholin 5 sekunnin ajan, sitten eosiini-5 minuuttia (Boster, Kiina).

immunohistokemiallisella värjäyksellä, objektilasit rehydratoitiin ja lämmön epitooppisup- haku suoritettiin sitraattipuskurissa käyttäen painekattilaa (20 minuuttia 80 pKA), blokattiin 3 % H

2O

2 15 minuuttia, ja sitten normaalia vuohen seerumia levitettiin (30 minuuttia huoneenlämmössä). Laseja inkuboitiin seuraavissa primaaristen vasta-aineiden: anti-E-kadheriini (1:250), anti-vimentiinistä (1:250), anti-β-kateniinin (1:250), ja anti-pan-CK (1:250 ). Näytteet inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, huuhdottiin kahdesti PBS: llä, ja niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa 2 tuntia 37 ° C: ssa. DAB Plus Kromogeeni Kit (Boster) käytettiin havaitsemaan kaikkia antigeenejä. Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu, ja asennettu peitinlasit neutraalilla balata. Molemmat analyysit erikseen suoritettiin patologit ja lääkärit, jotka olivat sokeita näytteen ryhmiin. Erimielisyydet ratkaistiin yhteisymmärryksessä.

Immunofluoresenssi- ja konfokaalimikroskopialla

Solut maljattiin kammion dioja, ja pakastetut leikkeet kiinnitettiin 4% PFA ja läpäiseviksi 0,5% Triton X-100. Objektilasit blokattiin normaalia vuohen seerumia 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, huuhdeltiin ja inkuboitiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa, siirrettiin sitten ja niitä inkuboitiin vuohen anti-hiiri ja anti-kani-TIRTC vasta-aineita 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Objektilasit pestiin käyttämällä glyseriiniä ja asennettu kansi luistaa. Tumat vastavärjättiin DAPI. Fluoresenssi havaittiin käyttämällä konfokaali laser-skannaus mikroskooppi (Olympus). Parafiini kryoleikkeet värjättiin DAPI ja analysoitiin immuunifluoresenssivasta mikroskooppia.

eläinmallissa

Kahdeksankymmentä neljän viikon ikäiset BALB /c-hiiret hankittiin Animal Research Center of Shanghai ja ylläpidetään at koe-eläimen keskellä Zhejiang Academy of Medical Science. Mukaan suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals neuvoston Science and Technology of China, kaikki eläimiä pidettiin aseptisissa steriileissä olosuhteissa ja annettiin autoklavoitiin ruokaa ja vettä noudattaen periaatteita Laboratory Animal Care Zhejiangin yliopistossa. Neljäkymmentä-neljä hiirtä käytettiin ihonalaisen mallissa, ja jaettiin tasaisesti ohjaus ja kokeiluryhmissä. BGC-GFPs käytettiin kontrolli missä TBGC-GFPs olivat käyttötarkoituksiin kuin kokeen. Kasvainsolut kerättiin kasvuvaiheessa, ja suspendoitiin FBS-väliaineessa (1 x 10

6 solua /ml). Solut pipetoitiin yksisoluiset suspensiot, ja kukin 500 ui liuosta ihonalaisesti siirrostettiin molemmin puolin rinnassa. Hiiret lopetettiin 2 viikon välein kunnes 10 viikkoa, ja patologisten tutkimusten tehtiin. Kaikki hiiret punnittiin joka 3 päivä. Kaikki leikkauksia tehtiin alle 1% natriumpentobarbitaalia, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Kolmekymmentäkuusi hiiriä käytettiin laskimoon injektiona ryhmässä arvioitaessa syövän jakelu (18 hiiret BGC-GFP kontrolliryhmään ja 18 hiiret TBGC-GFP koeryhmä). 500 ui solususpensiota (5 x 10

5 solua) injektoitiin häntälaskimoon nude-hiirten. Hiiret lopetettiin 2

nd, 5

th, 8

th ja 10

th viikkoa patologinen tutkimus.

Tilastollinen analyysi

Kokeelliset tiedot on kerätty ja tuli taulukoita. Normaaliuden testit suoritettiin ennen vertaamalla tietoja. Vertailut ryhmien välillä suoritettiin käyttäen Studentin

t

testiä. Yksisuuntainen varianssianalyysi käytettiin vertaamaan 3 ryhmää, ja Tukeyn menetelmää käytettiin

post hoc

vertailuja ryhmiä. Tässä tutkimuksessa

p

0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevä. SPSS 20,0 for Windows (IBM SPSS Statistics, https://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) käytettiin suorittaa kaikki tilastollisia analyysejä. R (ggplot2) (https://www.r-project.org/; https://www.r-project.org/) käytettiin tuottamaan kaikkia graafisia esityksiä.

Tulokset

1. Morfologiset muutokset BGC-823 solut jäljittelevät stroomassoluihin

fibroblastit (FB) ja BGC-823-soluja viljeltiin yhdessä suhteessa 10:01 vielä 10 päivää sen jälkeen, kun viljeltyjä soluja saavuttivat konfluenssin. Solun seos trypsinisaatiolla tuoretta fibroblasteissa (1 x 10

6 solua /ml) (kuvio 1.1). Dome muodostuminen BGC-823-solujen havaittiin ensimmäisen jälkeen kulkua. Toisella ja myöhempien kohtia, keskeytetty pyöreä solujen ilmestyi viljellyissä järjestelmään: jotkut yhdistetä klustereihin tai möhkäleitä ja löyhästi kytketty pintaan fibroblasteissa. Rinnakkaiset viljeltiin BGC-823-solut osoittivat vain muutama pyöreän muotoinen soluja tyvestä kun kulttuuri tuli liian täynnä. Sekoitettu keskeytettiin solut osoittivat erilaisia ​​morfologisia ominaisuuksia ja pitkäaikainen kiinnitys puhdistamisen jälkeen. Nämä solut osoittivat joko mukulakivi ulkonäkö samanlainen BGC-823-solut tai lyhyt kara kaltaisia ​​piirteitä. Uniform, lyhyt, Karan kaltaisia ​​soluja tuotettiin kulkua sekoitetun suspendoidut solut ja tiheä normaalien fibroblastien. Sen sijaan, läpikulun supernatantissa BGC-823-soluissa osoitettiin vain roskat 24 tunnin kuluttua viljelyn, jossa pieniä määriä solujen säilynyt muodostamiseksi mukulakivi kaltainen kloonien samanlainen vanhempien BGC-823-soluja (kuvio 1.3A-H).

Kuva 1.1. Kaavio kokeellisesta protokollaa. Kuva 1.2. Alkuperäinen supernatantti soluista. (A) GFP-leimatun BGC-823-solut (vihreä). (B) BGC-823 soluja, jotka viljeltiin yhdessä fibroblasteja (punainen). (C) BGC-823 solut kasvoivat ryhmiksi ja osoittivat pyöreitä muotoja suspensiossa. (D) TBGCs indusoitiin coculturing. Suurennus 100 x. Kuva 1.3. Muodonmuutos BGC-823 solujen TBGCs alle faasikontrastimikroskoopissa. (A-D) BGC-823 solujen tiheä kulttuuri järjestelmä voi muodostaa klustereita ja karistanut pois solujen suspensioon. (E-H) kuluminen keskeytetään syöpäsoluja. Kuva 1.4. Immunofluoresenssivärjäyksellä yleiseurooppalaisten CK (punainen), E-kadheriinin (punainen), vimentiinistä (punainen) ja N-kadheriinin (punainen). BGC-823-solut (edellä) ja TBGCs (alla) leimattiin GFP (vihreä). Tuma värjättiin DAPI (sininen). Kuva 1.5. Lämpö juoni geeniekspressioprofiilien analysoitiin fluoresenssi kvantitatiivinen RT-PCR. Syvyys väri osoittaa suhteellisen geeniekspression. Kuva 1.6. Western blot proteiineja. Kuva 1.7. Bar käyrä proteiinin ekspressio määritettiin käyttäen Western-blot-analyysi. Bars merkitsevät suhteellista ekspressiotasot mitattiin käyttämällä IOD. Pystysuorat viivat tarkoittavat standardin eroja. ** P 0,01.

Seuraavat kokeet suoritettiin sen määrittämiseksi, lähde suspendoitiin solujen Yhteisviljeltyjä järjestelmässä. BGC-823-solut ja fibroblastit transfektoitiin GFP-puro-kasetti ja RFP-puro kasetti, vastaavasti, ja nimettiin BGC-GFP ja FB-RFP, vastaavasti. Jälkeen coculturing, BGC-GFP kasvoi monikerrosrakenteet ja muodostivat kupumaisen rakenteen. Samaan aikaan pyöreä tai pallomainen soluja, jotka oli suspendoitu media siirrettiin soluviljelylevyille ja merkitty vihreän fluoresenssin, mikä osoittaa, että pitkäaikainen coculturing fibroblasteja indusoi BGC muutosta. Pyöreä ja sferoidi soluja, jotka suspendoitiin väliaineessa havaittiin myös käyttäen vihreän fluoresenssin ja voitaisiin siirrostettiin lisäämättä fibroblasteissa (kuvio 1.2A-D). Usean peräkkäiset coculturing, muunnettava BGC-823-solut (TBGCs) hankittiin joka ilmestyi yhtenäisempi, lyhyt, ja kara kaltainen. Nämä solut siirrostettiin lisäämättä fibroblasteissa. Mielenkiintoista, nämä solut olivat alttiimpia muodostaa pallomainen rakenteita kuin solut, jotka kasvoivat konfluenssiin eikä osoittanut morfologisia paluuta BGC-823-solujen vasta 10-15 kohtia.

Aiemmassa tutkimuksessa on todettu, että fibroblastit estävät kasvua muiden soluja viljellään

in vitro

mekanismilla kontakti-inhibition [4]. Meidän kokeissa kuitenkin normaalien fibroblastien ei ota-inhiboimaan BGC-823-soluja. Sen sijaan, FB-RFPs vähitellen tuhoutunut BGC-GFP leviämisen kun viljely oli pidennetään 10 päivään. Siksi peräkkäisen FB lisäravinteen vaadittiin kulkua ja ylläpitämään vakaata tuotantoa TBGCs. Havaitsimme myös, että kun pieni määrä TBGCs lisättiin konfluentteja fibroblastien arkki, kasvaimen solut, jotka kasvoivat ulkopuolella oli työntää pois fibroblastien. Keskellä kasvain pesäkkeen solut pyöreä, vain löysät liitetiedostoja pohjaan (Kuva 1.3A-H).

2. Epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä Siirtyminen BGC-823 Cell TBGC

Reaaliaikainen PCR käytettiin analysoimaan mRNA ilmaisun. Tulokset osoittavat, että E-kadheriinin ilmentyminen merkittävästi vaimentua yhdessä säätelyä vimentiinista in TBGCs. Samaan aikaan ilmauksia kierre, etana, etana, ja N-kadheriinin olivat kaikki voimistunut (Kuva 1.5). Immunofluoresenssivärjäyksen ja Western blot vahvista E-kadheriinin menetys ja lisääntyneen ilmentymisen vimentiinista, N-kadheriinin, ja β-kateniinin (Kuva 1.4), mikä vahvistaa, että pitkäaikainen epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) esiintyy TBGCs. E-kadheriinin on osoittautunut tunnusmerkki EMT ja ylläpitää solu-solu kiinnitys epiteelin. E-kadheriinin menetys voi johtaa kasvaimen leviämistä useamman solun pois kasvain massasta.

3. Leviäminen, Invasion, ja liikkuvuus TBGCs

TBGC leviämisen analysoitiin käyttäen MTS-määritystä. TBGCs osoitti nopeutetulla proliferaationopeus (

p

0,01) (Kuva 2.1). Virtaussytometria (katso materiaalit ja menetelmät S1) osoittaa, että 13% TBGCs oli säilytetty S-vaiheeseen, toisin kuin vain 7% BGC-823-soluja (kuvio S1.3). Raapimisliikkeistä määritys osoittaa, että TBGC liikkuvuus lisääntyi verrattuna isän BGC-823-solut (kuvio 2.2-2.3A-H). TBGC anastomosis vaaditaan 3 päivän kuluttua aloittamisesta naarmuja, kun taas 4 päivää tarvittiin BGC-823-solut (

p

0,05) (Kuva 2.2).

Kuva 2.1. viivadiagrammina leviämisen määrityksessä. Pystysuorat viivat tarkoittavat standardin eroja. ** P 0,01. Kuva 2.2. Rivi juoni naarmuuntumista määrityksen. Pystysuorat viivat tarkoittavat standardin eroja. ** P 0,01. Kuva 2.3. Naarmuttaminen määritys BGC-823-solut (edellä) ja TBGCs (alla) alle faasikontrastimikroskoopissa. (A-D, E-H) Aika alkuperäisestä 72 tuntia. Kuva 2.4. Rasiakuvaaja invasiivisen ja muuttoliike määrityksissä. Erot BGC-823-solut ja TGBCs ovat merkittäviä (p 0,01). Kuva 2.5. Top 2 Kuvissa tulokset invasiivisen modifioitu siirtokuoppaan määrityksessä Matrigel. Edustavat kuvat Transvvell- hyökkäyksen määritykset (A) BGC ja (B) TBGC. Solut tunkeutuvat alapintaan transwell-insertin on esitetty. Pohja 2 valokuvat ovat edustavat kuvat Transvvell- muuttoliikkeen määritykset (C) BGC ja (D) TBGC. Solut siirryttäessä alapintaan transwell-insertin on esitetty.

tulokset Matrigel hyökkäyksen määritykset osoittavat, että TBGCs ovat aggressiivisempia kuin BGC-823-soluja. Kaikkiaan 683,67 ± 170,83 TBGCs tunkeutunut Matrigel verrattuna 188,33 ± 58,62 BGC-823-soluja kontrolliryhmässä (

p

0,01) (kuvio 2.4, Kuvio 2.5A, B). Kuitenkin TBGCs osoitti merkittävää vähenemistä siirretty solut: 2-kertaa pienempi kuin BGC-823-solut mukaan transwell migraatiokokeessa (

p

0,01) (kuvio 2.4, Kuvio 2.5C, D). Suspendoituneen luonne TBGCs saattaisi selittää tätä vähennystä tarttuvuus oli vain 68.33 ± 10,41% vuonna TBGCs Matrigelillä taas 99,77% ± 6,25% vuonna BGC-823 soluja, osoitti hidasta kiinnitys Matrigel pintaan TBGCs (taulukko S1) .

paremmin matkivat

in vivo

kasvaimen käyttäytymisen, kollageenin tyypin I geeliä käytettiin selvittämään suhdetta fibroblastit ja invasiivisia valmiuksia BGC-823 soluja ja TBGCs. Kollageeni tyyppi I geeli laadittiin Transvvell- insertit fibroblasteja (katso materiaalit ja menetelmät S1). Fibroblasti-ladattu geelit viljeltiin 7 päivää, ja sitten GFP-leimatun syöpä-solut ympättiin geelistä ja viljeltiin seuraavien 7 päivää. Tarkastus korjattu geelien paljasti, että kasvainsolut olivat tunkeutuneet kollageenigeelien. Kun geelit olivat täynnä fibroblastien, TBGCs esiintyi enemmän parannettuja invasiivisia kapasiteettia kuin BGC-823-soluja, kuten on osoitettu useissa soluissa, jotka tunkeutui geelit (kuvio S1.2).

4. TBGCs näytteillä Sisplatiini Resistance

Seuraavaksi arvioimme herkkyys TBGCs standardin mahasyövän kemoterapeuttiset. Elinkelpoisten BGC-823-soluja ja TBGCs määritettiin 24 tunnin kuluttua altistumisesta sisplatiinin (0, 20, 40, 60, 80 uM) mittaamalla sisällyttämällä MTS. Tulokset osoittavat, että TBGCs osoitti merkittävää vastustuskykyä sisplatiini, kun taas muutama BGC-823-solujen selvisi, kun sisplatiinin konsentraatio nostettiin 40 uM (

p

0,001) (kuvio 3.1). Elinkelpoisten TBGCs voitaisiin jopa havaittu, kun sisplatiinin konsentraatio nostettiin 200 uM (tuloksia ei ole esitetty). Suoritimme solu-apoptoosin analyysillä käyttäen virtaussytometria vahvistamaan sisplatiinin vastarintaa. Tulokset osoittavat, että eloonjäämisaste TBGCs oli noin 42,40% verrattuna 13,80% for BGC-823-solujen käsittelyn jälkeen 40 uM sisplatiinia 24 tuntia (kuvio 3,3-3,4). Kuitenkin, kun käsiteltiin 5-FU, ei ollut merkittäviä eroja kasvaimen inhibitiota välillä TBGCs ja BGC-823-solut mukaan MTS-määritys (kuvio 3.2). Sekä kasvainsolujen osoitettu chemoresistance 5-FU (Kuva 3.2).

Kuva 3.1. Kaksikymmentäneljä tuntia viivadiagrammina Sisplatiini inhibitiotesti. ** P 0,01. Kuva 3.2. Kaksikymmentäneljä tuntia viivadiagrammina 5-FU inhibitiotesti. Kuva 3.3. Virtaussytometria käytettiin arvioimaan apoptoosin BGC ja TBGC solujen altistuksen jälkeen eri sisplatiinin (20, 40 uM) 24 tunnin ajan. Solut värjättiin anneksiini V-FITC (markkeri apoptoosin) ja propidiumjodidia (PI) (markkeri kuolleita soluja). Kuva 3.4. Bar juoni sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin BGC-823 soluja ja TBGCs. Pylväsdiagrammi, joka esittää prosenttiosuutta apoptoottisten solujen mukaan virtaussytometrialla. ** P 0,01 vs soluja dimetyylisulfoksidissa (DMSO) kontrolli kuoppiin.

5. TBGCs Exhibit

In vivo

imusolmukemääritysmenetelmä Taipumus

Voit selvittää

in vivo

jakelu TBGCs, 5 x 10

5 BGC-823-solut tai TBGCs ruiskutettiin häntälaskimoon BALB /c-hiirissä. Kahden viikon kuluttua injektion, varianssi apu- ja kaulan imusolmukkeet etäpesäke havaittiin molemmissa ryhmissä, kuten osoitetaan arviointi fluoresoivan merkkiaineen (Kuva 4.3A-F). GFP-positiiviset solut havaittiin apu- ja imusolmukkeet imusolmuke molemmissa ryhmissä (kuvio 4.3A, B, D, E). Kuitenkin, GFP-positiivisten solujen esiintyi vain keuhkot hiiristä BGC ryhmässä (kuvio 4.3C, F).

Kuva 4.1. Kumulatiivinen riski imusolmukkeiden etäpesäkkeiden eri ryhmiin, jotka saivat häntälaskimoon injektioita. Kuva 4.2. HE värjäys (10 viikkoa) elinten ryhmässä, joka sai vein injektioita. Positiivisuus havaittiin suolistossa molempien ryhmien ja keuhkoissa on BGC ryhmistä. Ei ilmeistä maksan tai munuaisten etäpesäkkeitä löytynyt. Kuva 4.3. Fluoresoiva jäljittäminen kasvainsolujen viikolla 2 ryhmissä, jotka saivat häntälaskimoon injektioita. Kasvaimen solut leimattiin vihreän fluoresenssin kuten keltaisella nuolenpäitä. Tuma värjättiin DAPI (sininen). Suurennus 100 x. Kuva 4.4. Immunohistokemiallinen värjäys E-kadheriinin ja β-kateniinin imusolmukkeisiin ryhmissä, jotka saivat häntälaskimoon injektion kunakin ajankohtana. Suurennus 200 ×. Kuva 4.5. Bar juoni suhteellisten ekspressiotasojen E-kadheriinin ja β-kateniinin imusolmukkeisiin ryhmissä, jotka saivat häntälaskimoon injektion kunakin ajankohtana. ** P 0,01; * P 0,05.

Tällä viikolla 5, lisäksi laaja invaasion imusolmukkeisiin, urut tunkeutuminen havaittiin myös. Enemmän imusolmuke invaasio havaittiin TBGC ryhmässä kuin BGC verrokkiryhmä kunakin ajankohtana (Kuva 4.1, Video S1). Nämä imusolmukkeet määritettiin olevan pan-CK positiivisia (kuvio S2.1). Havaitsimme myös eri TBGC ja BGC jakelu elimissä. TBGCs rajattiin gastroenteeriset kudoksiin, kun taas BGCs asettui keuhkoihin ja suolet (kuva 4.2a-H). Viikolla 5, suoliston etäpesäke havaittiin ensi 3/4 hiirillä, joihin injektoitiin TBGCs, kun taas vain 25% hiiristä osoitti näkyvää suoliston etäpesäkkeitä seuraavat BGC injektion (kuvio S2.3).

Kuten kasvaimia kehittyi, keskimääräinen määrä suoliston TBGC etäpesäkkeitä kasvoi (5,6 ± 3,911

vs

3,5 ± 1,914 BGCs viikolla 8, 6,33 ± 1,52

vs

5.6 ± 1,342 viikolla 10) (kuvio S4.2) . Mielenkiintoista, 3 5 hiiret TBGC ryhmässä osoitti megascopic kasvaimet vuonna Gästrum 10 viikon jälkeen, jota ei havaittu BGC ryhmässä. Megascopic keuhkometastaaseja havaittiin 3 4 BGC hiirillä viikolla 8. ei kuitenkaan näy TBGC keuhkometastaaseja havaittiin viikolla 10 (kuvio 4.2a-H). Mikroskooppinen tarkastus paljasti soluttautuminen TBGCs osaksi kohdunkaulan ja kainalon imusolmukkeiden jo 1 viikon kuluttua häntälaskimoinjektio, kun taas BGCs tarvitaan enemmän aikaa (3 viikkoa) ja syöttää nämä imusolmukkeet (Kuva 4.1). Viiden viikon kuluttua solujen injektion, keuhkoinfiltraatteja havaittiin BGC ryhmässä. Ei kuitenkaan TBGCs havaittu elimissä vasta 10 viikon kuluttua injektion (kuva 4.2b, F, kuva S2.3).

immunohistokemiallinen värjäys osoitti lisäämään vähitellen E-kadheriinin imusolmukkeissa on TBGC ryhmä , kun taas E-kadheriinin ilmentymisen hieman vähentynyt BGC ryhmässä (

p

0,01) (Kuva 4.4A-P). Erot olivat merkittäviä 8 ja 10 viikon ajan, kun E-kadheriinin ilmentyminen oli huomattavasti suurempi TBGC ryhmässä verrattuna BGC ryhmä (Kuva 4.5). Ilmaisu on β-kateniinin kasvoi myös ajan kuluessa TBGC ryhmässä, joka oli huipussaan 8 viikon ajan ja sitten laskivat hieman (Kuva 4.5). * P 0,05. ** P 0,01.