Krooninen sairaus

tiivistelmä

Meidän Edellisessä tutkimuksessa mikrovesikkeleitä (MV) vapautuu

ihmisen

Wharton hyytelöä mesenkymaaliset kantasolut (hWJ-MSC) hidastaa kasvua virtsarakon syöpäsoluja. Haluaisimme tietää, jos MV on samanlainen vaikutus

ihmisen

munuaissolukarsinooma (RCC). Käyttämällä soluviljelmässä ja BALB /c nu /nu

hiiret

ksenotransplantaatiolla siirteen mallissa, vaikutus MV kun kasvua ja aggressiivisuus RCC (786-0) arvioitiin. Cell laskenta kit-8 (CCK-8) analyysissä, ilmaantuvuus kasvain, kasvaimen kokoa, Ki-67 tai

TUNEL

värjäystä käytettiin arvioimaan kasvainsolujen kasvua

in vitro

tai

in vivo

. Virtaussytometria määritys (

in vitro

) tai tutkiminen sykliini D1 ilmentyminen (

in vivo

) suoritettiin määrittämään muuttamista solusyklin. Aggressiivisuus analysoitiin

haavan paraneminen Pitoisuus

(

in vitro

) tai MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun (

in vivo

). AKT /p-AKT, ERK1 /2 /p-ERK1 /2 tai HGF /c-MET ilmentymistä havaittiin reaaliaikaisella PCR: llä tai western blot. Tuloksemme osoittivat, että MV kasvun edistämiseksi ja aggressiivisuus RCC sekä

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi MV helpotti etenemistä solusyklin G

0/1 S. HGF ilmentyminen RCC suuresti aiheuttama MV: iden, jotka liittyvät aktivointi AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin. RNase esikäsittely kumottu kaikkia vaikutuksia MV. Yhteenvetona induktio HGF synteesin kautta RNA siirrettiin MV aktivoimalla AKT ja ERK1 /2 signalointi on yksi olennaisesti edistävän pro-kasvain vaikutus.

Citation: Du T, Ju G, Wu S, Cheng Z Cheng J, Zou X, et al. (2014) mikrovesikkeleille peräisin ihmisen Wharton Jelly mesenkyymikantasoluista edistää ihmisten Munuaisten syöpäsolujen kasvua ja aggressiivisuus kautta induktio hepatosyyttikasvutekijä. PLoS ONE 9 (5): e96836. doi: 10,1371 /journal.pone.0096836

Editor: Giovanni Camussi, University of Torino, Italia

vastaanotettu 26. tammikuuta 2014; Hyväksytty: 11 huhtikuu 2014; Julkaistu: 05 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Du et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee avustuksia tutkimusohjelma Science and Technology komissio Shanghai kunta (10411967200) ja Shanghai Song Jiang Health Bureau (2011PD06) ja National Natural Science Foundation of China (81170642) ja Shanghai Shen Kang Plat-muodossa Grant (SHDC12007206) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Vaikka kirjoittajat sai rahoitusta Shanghai Song Jiang Health Bureau, tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

kyky MSC: kotiin sivustoille kasvaimista on innostanut tutkimus näiden solujen mahdollisina kasvaimen vastainen välineet [ ,,,0],1], [2]. Kuitenkin on ollut keskustelua siitä, MSC: t käyttää anti-kasvain vaikutus asti. Melkoisesti tutkimuksia, MSC: t eivät edistää etenemistä kasvaimia. On dokumentoitu, että MSC: t eivät ole vain mukana muodostumista kasvaimen mikroympäris- mutta vuorovaikutuksessa syöpäsolujen edistää niiden kasvua ja etäpesäkkeiden [3] – [5]. Tarkkaa vaikutusmekanismia jää epäselväksi. Immunosuppressiivinen toiminta [6], [7], trans-eriyttäminen kohti suuntaan mesenkyymisolujen [8], [9] sekä erilaisia ​​bioaktiivisten tekijöiden erittyy MSC: t [10] on ehdotettu olevan potentiaalinen efektoreja.

on havaittu äskettäin, että MV vapautuu MSC: t on yksi keskeinen efektori teoistaan. MV on kuvattu uutena väylänä solujen välinen viestintä, joka voi ohjelmoida kohdesolut toimittamalla toiminnalliset mRNA ja microRNA sekvenssit [11], [12]. Koska MSC: t ovat runsas lähde MVS, on mahdollista, että niillä on keskeinen rooli kantasolujen n biologinen vaikutus [13]. Ymmärtäminen roolia MV vuonna sovittelu kasvainsolun käyttäytyminen ja toiminta voi auttaa edelleen paljastamatta tarkkaa mekanismia taustalla olevia MSC: t suo- tai antituumorivaikutuksen.

Meidän Edellisessä tutkimuksessa MV johdettu hWJ-MSC: heikennetty kasvua virtsarakon kasvainsolun (T24) avulla alas-säätely AKT aktivointi ja säätely ylöspäin pilkkoa kaspaasi-3 [14]. RCC on toinen yhteinen urologic kasvain. Meillä oli suurta kiinnostusta vaikutus MV sen kasvuun ja aggressiivisuus.

Human

munuaissyövän 786-0 soluja käytettiin tässä tutkimuksessa. Toisin kuin T24, 786-0 solut ilmentävät sekä HGF ja c-MET, joka edustaa syövän varhainen kantaisä solumarkkerigeenien [15]. Siksi paljon huomiota kiinnitetään vaikutus MV HGF /c-MET-signalointireitin.

in vivo

ja

in vitro

todisteet osoittavat, että MV julkaistiin by hWJ-MSC: t suosivat kasvua ja aggressiivisuus RCC. Anneta lisätietoja osaksi mekanismeista tätä vaikutusta. Tiedot osoittavat, että induktio HGF ilmaisun RCC kautta RNA tiedot siirtää MV on yksi merkittävimpiä aktivointi AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin jotka edistävät pro-kasvain vaikutus MV. Väliaine ehdollistettu hWJ-MSC: t on osoitettu aiheuttavan natiivi ja ulkomaisten HGF synteesi loukkaantunut munuaistiehyiden soluihin [16]. Tuoreessa tutkimuksessa, huomasimme, että

ihmisen

HGF-mRNA läsnä MV johdettu hWJ-MSC: t toimitetaan osaksi

rotan

tubulussoluihin altistetaan hypoksia /re-hapetuksen ja käännetään proteiiniin . Mielestämme toimitus

ihmisen

HGF mRNA

ihmisen

kasvainsoluihin voi olla yksi vaikutusmekanismeja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tässä tutkimuksessa kaikki tutkimukset, joissa ihmisen osallistujien hyväksyi Institutional Review board of Kiinan Academy of Medical Science and Medical School of Shanghai Jiao Tong University. Ihmisyksilöistä tässä tutkimuksessa antoi kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen tutkimukseen osallistumiseen ja antaa meille mahdollisuuden julkaista asian yksityiskohtia. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals Shanghai Jiao Tong University. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Shanghai Jiao Tong University. Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Soluviljely

Tämä koe hyväksynyt Research eettisen toimikunnan Shanghai Jiao Tong-yliopiston Affiliated Ensimmäinen Kansan sairaalan . hWJ-MSC: t eristettiin ja kasvatettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17].

Human

RCC linja (786-0) (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Shanghai, Kiina) viljeltiin RPMI-1640 (Gibco), johon 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco).

eristys ja karakterisointi MV

MV vapautuu hWJ-MSC: eristettiin ja karakterisoitiin, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Valmistamiseksi MV, hWJ-MSC: t viljeltiin vähän glukoosia DMEM vailla FBS: ää ja jota on täydennetty 0,5% naudan seerumin albumiinia (BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) yön yli. Supernatantit kerättiin ja sentrifugoitiin 2000 g: ssä 20 min jätteiden poistamiseksi. Soluvapaa supernatantit olivat erittäin sentrifugoitiin 100000 g (Beckman Coulter Optima L-80K -ultrasentrifugi; Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 1 tunti 4 ° C: ssa. Supernatantit hylättiin ja eristetyt MV suspendoitiin M199 (Sigma-Aldrich), joka sisälsi 25 mM HEPES (pH 7,4) ja toimitetaan toinen ultrasentrifugointi samoissa olosuhteissa. MV suspendoitiin uudelleen seerumittomassa M199. Valkuaispitoisuus MV kvantifioitiin

Bradfordin menetelmällä

kun

Limulus test

käytettiin jättää endotoksiinin tartuntoja MV. RNA uutetaan MV käyttämällä TRIZOL reagenssia analysoitiin spektrofotometrin. Virtaussytometriset analyysit MV osoitti, että läsnä on CD9, CD29, CD44, CD63, CD73 ja CD105, mutta ei CD34 ja CD45 (aineistoa ei esitetty). Valmistettua MV säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka.

Transmissioelektronimikroskopia

Suspensio kiinnitettiin 2,5% glutaraldehydillä PBS: ssä 2 tuntia. Huuhtelun jälkeen MV olivat ultrasentrifugoitiin ja suspensoitiin 100 ui PBS: ää. 20 ui pisara MV ladattiin formvar /hiilipinnoitteiset verkkoon, värjättiin negatiivisesti 3% vesipitoisella fosfori-volframihapon varten 1min ja noudatettava läpäisevällä elektronimikroskoopilla (HITACHI, H-7650, Tokio, Japani). Koko eristetty MV vaihteli 30 500 nm.

MV esikäsitelty RNaasi

Osa eristetty MV käsiteltiin 100 ug /ml RNaasi (Fermentas, Burlington, ON , Kanada) 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja reaktio pysäytettiin lisäämällä RNaasi-inhibiittoria (Fermentas). Sen jälkeen ultrasentrifugaatiolla 100000 g 1 tunti 4 ° C: ssa, MV keskeytettiin M199 ja sitten säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti (RNaasi-MV). Spektrofotometri analyysi paljasti, että suurin osa RNA: ta MV käyttämällä TRIZOL-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) pilkottiin RNaasi käsittely (MV: 1,8 ± 0,3 ug RNA: ta /mg proteiinia; RNaasi-MV: alle 0,15 ug RNA /mg proteiinia).

eläinmallijärjestelmiä

Kahdeksantoista BALB /c nu /nu -hiirten 4-6 vk vuotias (Laboratory Animal Center of Shanghai, Academy of Science, Shanghai, Kiina) jaettiin satunnaisesti 3 ryhmään (n = 6 kussakin ryhmässä). Kaikki hiiret saivat ihonalaisen injektion 1 x 10

7 786-0 soluissa lisäämällä MV (200 ug /ml proteiinia) (määränä MV vapautuu noin 1 x 10

6 hWJ-MSC: ssa yön yli), RNaasi-MV tai M199 (kontrolli). Eläimiä seurattiin 3 päivän välein. Aika-piste kasvaimen esiintyminen kirjattiin. Kasvaimen kasvu arvioitiin kasvaimen tilavuuden, joka on laskettu modifioitu ellipsoidin kaavasta: V = 1/2 (pituus x leveys) [18]. Pituus ja leveys syöpäkasvaimen mitattiin paksuus.

CCK-8 määritys

CCK-8 (Beyotime Biotekniikan instituutti, Jiangsu, Kiina) käytettiin määrittämään

in vitro

kasvainsolujen kasvua. 786-0-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (2000cells /kuoppa) ja inkuboitiin kosteutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut pestiin PBS: llä, ja sen jälkeen viljeltiin yhdessä MV (200 ug /ml proteiinia), RNaasi-MV M199 tai M199 (kontrolli) 24 tai 48 tunnin ajan. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin 100 ul: ssa RPMI-1640 (Gibco), joka sisälsi 10 ui CCK-8 reagenssi vielä 3 tuntia. Absorbanssi jokaisen kaivon 450 nm: ssä oli spectrophoto-metrisesti mitattuna käyttäen mikro-levyn ELISA-lukijaa (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Viljelyalusta (RPMI-1640) ilman soluja käytettiin nollakoe.

analyysi solusyklin ja haavan paraneminen Pitoisuus

786-0 soluja (5 x 10

4) inkuboitiin joissa MV (200 ug /ml) tai RNaasi-MV M199 tai M199 (kontrolli) 48 tunnin ajan. Hoidon jälkeen trypsiinillä, solut kerättiin ja pestiin kahdesti PBS: llä, sitten kiinnitetään 70% jääkylmää etanolia 24 tuntia. Kiinnitetyt solut värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia (PI) (Sigma) PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Triton X-100 (Sigma) ja 50 ug /ml RNaasi (Sigma), ja analysoitiin sitten G

0 /G

1, G

2 /M ja S-vaiheessa korkoa FACS Calibur virtaussytometrillä (Becton Dickinson FACS Calibur, Franklin Lake, NJ, USA).

haavan paraneminen Pitoisuus

suoritettiin myös arvioida solujen vaeltamiseen. 786-0 soluja (5 x 10

4) ympättiin 6-kuoppaisille levyille tuoreessa RPMI-1640 media (Gibco) 12 tuntia alkuperäisen kulttuurin, ja sitten jatkoi kulttuuriin vielä 12 ja 24 h lisäämällä MVS tai RNaasi-MV M199 tai M199 (kontrolli). Perusvaiheet sisältävät luoda ”haava” on yksisolukerros, syömällä kuvia alussa ja lopussa aikana solun siirtymisen sulkemaan haavan. Haava luotiin käsin kaapimalla yksisolukerros kanssa P200 pipetillä kärjestä. Alueen haavoittuneen alueen, josta puuttuu soluja kirjattiin arviointia varten.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin solusta tai kasvaimen näytteitä käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja sitten käänteisesti transkriptoitiin Moloney-hiiren leukemiaviruksen (M-MLV) käänteistranskriptaasi-Kit (Promega, Madison, WI, USA) ja Oligo-dT-alukkeita (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 60 minuuttia 42 ° C: ssa. Reaaliaikainen PCR suoritettiin TaqMan geeniekspression määrityksiä (Applied Bio-Systems, Foster City, CA, USA) havaitsemiseksi geenin ilmentymisen HGF, MMP-2, MMP-9 tai β-aktiini käyttäen seuraavia alukkeita:

HGF

: 5’CTCTGGTTCCCCTTCAATAG, 3’GATAGCCCCATTTCTGGATGTC;

MMP-2

: 5’CCCATTTTGATGACGATGA, 3’CAAGTTACCGTTCCTCATGTT;

MMP-9

: 5’CGAACTTTGACAGCGACAAGA, 3’GATACCAGGAGCGGGACTT;

β-aktiini

: 5’AAGGTGACAGCAGTCGGTT, 3’GGAGAGGGTTCAGGTGTGT;

kvantifiointiin kohdegeenin normalisoitiin β-aktiini, sisäinen kontrolli-geenin. Ct varten kohdegeenin ja β-aktiini määritettiin kullekin näytteelle. Koenäytteet ilmaistaan ​​n-kertainen ero suhteessa kontrolliin (M199-käsitelty solu tai kasvain näytettä). Suhteellinen ilmentyminen mRNA: n ilmentymisen on laskettu 2

-ΔΔCT. Triplikaatteina kunkin näytteen tehtiin.

Western blot-analyysi

Proteiiniekstraktit (30 ug kaistaa kohti) ajettiin elektroforeesissa ja siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridilla kalvo. Immunoblottaus suoritettiin inkuboimalla kukin kalvo anti-HGF (laimennus: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), c-MET (laimennus: 1:250; Abcam, Cambridge, UK), AKT (laimennus: 1 :1000; Abcam, Cambridge, UK), p-AKT (laimennus: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), ERK1 /2 (laimennus: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), p-ERK1 /2 ( laimennus: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), MMP-2 (laimennus: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), MMP-9 (laimennus: 1:500; Abcam, Cambridge, UK), sykliini D1 ( laimennus: 1:250; Abcam, Cambridge, UK), tai β-aktiini yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen PBS: llä, kussakin kalvoa inkuboitiin 1 h ja sekundäärinen vasta-aine konjugoitu peroksidaasilla huoneenlämpötilassa. Bändi on kehittänyt tiiviimmän kemiluminoinnilla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Tiheys kunkin kaistan määritettiin. Tulokset toistettiin kahdesti vahvistamaan toistettavuutta.

immunohistokemia

Lyhyesti, laseja inkuboitiin vasta-aineella ihmisen HGF (laimennus: 1:100; Abcam, Cambridge, UK) tai Ki 67 (laimennus: 1:200; Abcam, Cambridge, UK), jota seurasi HPR-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta käyttämällä DAB substraattina. Negatiivinen kontrolli suoritettiin korvaamalla primaaristen vasta-aineiden kanssa ei-immuuni immunoglobuliinin samaa iso-tyyppiä. Tumat vastavärjättiin Harris hematoksyliinillä. Apoptoosia arvioitiin päätelaitteen välittämällä dUTP nick-end merkinnät (TUNEL) määritys käyttämällä

In situ Cell Death Detection Kit

(Roche, Mannheim, Saksa). Kaikki osat tarkisti lääkärin sokkona tässä kokeessa.

Täydentävät kokeet

Kolmekymmentä BALB /c nu /nu -hiirten 4-6 vk vuotias arvottiin ihonalaisesti inokuloitiin 1 x 10

7 786-0 soluissa lisäämällä kunnostettua alustaa (CM) peräisin hWJ-MSC: t, MV eristetty CM tai kontrolloida väliaineen (M199 tai vähän glukoosia DMEM). Eläimiä seurattiin 3 päivän välein. Aika-pisteen kasvaimen esiintymistä ja kasvaimen koko tallennettiin.

In vitro

, 786-0 solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (2000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin kosteutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut pestiin PBS: llä, ja sen jälkeen viljeltiin yhdessä CM, MV eristetty CM tai ohjata väliaine 24 tai 48 tuntia. CCK-8-määritys suoritettiin sen määrittämiseksi solujen kasvua.

Toisessa täydentävän kokeessa, 786-0-soluja (5 x 10

4) ympättiin 6-kuoppaisille levyille tuoreessa RPMI-1640-media (Gibco ) 12 tuntia alkuperäisen kulttuurin, ja inkuboitiin sitten MV (200 ug /ml proteiinia), MV lisäten PF2341066 (Pfizer, 6 uM), PF2341066 tai valvoa väliaineen 48 tuntia. Yhteensä proteiinien solut eristettiin western blot-analyysi p-AKT ja p-ERK1 /2. Vaikutukset erilaisia ​​hoitoja solujen kasvuun arvioitiin myös CCK-8 Pitoisuus.

Tilastollinen

Tiedot ilmoitetaan keinona ± keskihajonta (SD). Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen

SPSS v19.0.

Tilastollista eroa tietojen avulla määritettiin 2-tailed

t-testiä

ja

varianssianalyysillä

(ANOVA) kuin tarkoituksenmukaista. Arvo

P 0,05

pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

MV helpottaa kasvua ja kulkeutumista 786-0 solujen in vitro

CCK-8 määritys paljasti, että MV edistää suuresti leviämisen 786-0 solujen 48 tunnin kuluttua inkuboinnin taas RNaasi esikäsittely kumottu tämän vaikutuksen (Fig. 1A). Analyysi solusyklin osoitti myös, että 786-0 solut käsiteltiin MV pääasiassa kertynyt S-vaiheessa verrattuna G

0 /G

1 vaihe RNaasi-MV tai kontrolliryhmään (Fig. 1 B ja 1 C). Näiden tulosten perusteella uskomme, että MV helpottaa etenemistä solusyklin kiihdyttäen siten leviämisen RCC. Lisäksi

haavan paraneminen Pitoisuus

käytettiin arvioimaan kykyä solumigraation. Tiedot osoittivat, että MV näkyvästi parantaa solujen vaeltamiseen (Fig. 1 D).

(A) CCK-8 Pitoisuus. Sen jälkeen 48-0 solua, MV suuresti edistänyt solun kasvua kun taas esikäsittely RNaasi kumotaan tätä vaikutusta. Soluja inkuboitiin M199 pidettiin ohjaus. *

P

0,01, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, RNaasi-MV vs. MV; (B) (C) Solusyklianalyysiä. 786-0 solut käsiteltiin MV pääasiassa kertynyt S-vaiheessa verrattuna G

0 /G

1 vaihe RNaasi-MV tai kontrolliryhmään. *

P

0,05, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, RNaasi-MV vs. MV; (D)

haavan paraneminen Pitoisuus

. Migraatio kyky 786-0 solujen merkittävästi monistettiin MV.

MV vauhdittaa ja etenemistä ympättiin kasvainten

läsnäollessa MV, kasvaimen kyhmyjä muodostettiin joissakin hiirten jo 6d istuttamisen jälkeen 786-0 solut (Fig. 2B). Vuoteen 18d, kasvaimen esiintymistiheys oli 100% (Fig. 2B). Sitä vastoin ei ollut muodostumista kasvaimen kyhmyjä hiirissä, joita käsiteltiin verrokkiravintoalusta kunnes 12d inokulaation jälkeen (Fig. 2B). Lopullinen kasvaimen esiintymistiheys oli vain 75% (Kuva. 2B). Lisäksi kasvaimen kasvu alle induktio MV oli nopeampaa kuin se, minkä indusoivat RNaasi-MV tai ajoneuvon kuten mittaamalla kasvaimen koko (Fig. 2A ja 2C). Lisäksi lisää Ki-67-positiivisia ja vähemmän TUNEL-positiivisia kasvainsoluja havaittiin kasvaimen osastoja hiirtä sai hoitoa MV (Fig. 2D). Kiinnostaa, sykliini D1-proteiinin ilmentymistä kasvainkudoksissa oli selvästi up-säännellään MV (Fig. 3A ja 3B). Sykliini D1, kriittiseksi välittäjänä, on mukana siirtyminen solusyklin G

1 S-vaiheeseen. Siksi kasvu sykliini D1 ilmentyminen helpottaa solusyklin etenemisen. Ekspression MMP-2 ja MMP-9 käytetään arvioimaan kykyä tuumorin aggressiivisuus. Avulla RT-PCR ja western blot, huomasimme, että MV johtaa merkittävään ylössäätöä niiden geenin ja proteiinin ilmentymisen (Fig. 3A-3C). Kaikki nämä todisteet osoittavat, että MV edistää kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen, kanssa tuloksiin

in vitro

kokeessa.

(A) Nude hiiret ympätty 786-0 soluihin. 786-0 soluja sekoitettuna MV tai RNaasi-MV M199 tai M199 (kontrolli) inokuloitiin subkutaanisesti nude-hiiriin lopetettiin 36d rokottamisen jälkeen; (B) Kasvaimen esiintyvyys. Oli korkeampi kasvaimen esiintymistiheys nude-hiirissä hoidettiin MV verrattuna RNaasi-MV tai valvontaa; (C) Kasvaimen tilavuus. Toisin kuin RNaasi-MV: iden tai valvontaa, MV johtanut kehitystä suuremman kasvain nude-hiirissä. *

P

0,05, MV vs. RNaasi-MV tai valvontaa; (D) Ki-67 ja TUNEL värjäys. Läsnäollessa MV oli enemmän Ki-67-positiivista värjäytymistä soluissa ja vähemmän positiivisiksi värjäytyneiden solujen TUNEL kasvaimen osissa.

(A) (B) Gel valokuvan ja densito-metrinen analyysi sykliini D1, MMP-2 ja MMP-9-proteiinin ekspressiota. MV johti merkittävään ylössäätöä sykliini D1, MMP-2 ja MMP-9-proteiinin ilmentymistä tuumorikudoksissa. RNase esikäsittely destructed näitä vaikutuksia. Tiheys kunkin kaistan määritettiin. Arvot kaaviossa ilmaistaan ​​densitometria suhteet sylinteririvin D1 /β-aktiini, MMP-2 /β-aktiini tai MMP-9 /β-aktiini kuten taittuu yli ohjaus (katkoviiva). Tiedot saatiin 3 eläintä kutakin koetta varten. *

P

0,05, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, RNaasi-MV vs. MV; (C), Gene MMP-2 ja MMP-9. Geeni MMP-2 tai MMP-9 oli selvästi säädeltiin MV. Ct (kynnys sykli) kullekin geenille määritettiin kullekin näytteelle. Kvantifiointia MMP-2 tai MMP-9 normalisoitiin β-aktiini. Geenin ilmentyminen kontrolliryhmän pidettiin kalibraattori (katkoviiva) kantavassa suhteellinen ekspressio kohdegeenin on laskettu 2

-ΔΔCt. *

P

0,05, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, RNaasi-MV vs. MV.

aktivointi AKT ja ERK1 /2 signalointi ympätty kasvaimissa nostatetaan MV

ottaen huomioon läheisen AKT: ja ERK1 /2 signalointi selviytymisen, kasvun ja migraatio RCC [19], [20], myös määritetty muutos näiden kahden signalointi aikaansaama MV

in vivo

kokeellinen asetus. Western blot -analyysi paljasti, että MV johti voimakkaaseen kasvuun fosforylaation tason AKT on ympätty kasvainten toisin RNaasi-MV tai kontrolli (Fig. 4A ja 4B). MV aiheutti myös verrattain heikompi mutta merkittävä kohoaminen p-ERK1 /2 tasoa (Fig. 4A ja 4B).

(A) (B) Gel valokuvan ja densito-metrinen analyysi AKT: n, p-AKT , ERK1 /2 ja p-EREK1 /2-proteiinin ilmentymistä inokuloiduissa kasvaimia. MV johtanut merkittävään fosforylaatioon kasvain AKT ja ERK1 /2-proteiineja. Tiheys kunkin kaistan määritettiin. Arvot kaaviossa ilmaistaan ​​densitometria suhteet p-AKT /β-aktiini, p-ERK1 /2 /β-aktiini, p-AKT /AKT tai p-ERK1 /2 /ERK1 /2, kun taittuu yli ohjaus (katkoviiva ). *

P

0,05, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, RNaasi-MV vs. MV.

MV indusoi HGF ilmentyminen RCC joko in vitro tai in vivo

on dokumentoitu, että HGF /c-MET osallistuvat syöpäsolujen lisääntymistä ja invaasiota [21], [22]. Lisäksi yli- tai mis-ilmentymisen HGF ja c-MET usein korreloi huonon ennusteen ja etäpesäkkeiden ihmisen RCC [23] – [26]. HGF /c-MET signalointi voi myös johtaa aktivoitumiseen sekä AKT ja ERK1 /2 signalointi. Siksi teimme lisätutkimisesta vaikutus MV kun HGF /c-MET ilmentyminen RCC.

48 tunnin kuluttua inkubaation MV: iden, HGF-proteiinin ilmentymistä 786-0 soluissa oli huomattavasti ajan säännelty osoitti western blot-analyysi ottaa huomioon, että c-MET ilmaisu ei suoriteta tällaisen muutoksen (Fig. 5A ja 5B). Samanlainen tulos saatiin tutkimalla HGF-mRNA: n ilmentymisen (Fig. 5C). Indusoivaa vaikutusta MV on HGF on myös tarkastettava

in vivo

kokeellinen asetus. Läsnäollessa MV, kasvoi selvästi tiivistämisen HGF värjäytymisen tuumorisektioiden (Fig. 5D). Western blot -analyysi paljasti myös, että lisäämällä MV johti huomattavaan kasvuun HGF-proteiinin ilmentymisen tuumorikudoksissa (Fig. 5E-5F). Kuten

in vitro

, c-MET-proteiinin ilmentymistä inokuloiduissa kasvaimia ei vaikuta MV (Kuva. 5E-5F). Esikäsittely RNaasi odotetusti turhautunut muutokset HGF ilmaisun joko

in vivo

tai

in vitro

, mikä ratkaisevaa asemaa RNA toimittamien tietojen MV HGF induktio. Koska HGF induktio on rinnakkain aktivointi AKT ja ERK1 /2, MV voi laukaisemaan AKT ja ERK 1/2 kautta HGF induktion, ainakin osittain.

(A) (B) Gel valokuva ja densitometrinen analyysi HGF ja c-MET-proteiinin ilmentymistä 786-0 soluissa. 48 h lisäyksen jälkeen MV, HGF-proteiinin ilmentymistä 786-0 soluissa oli näkyvästi sääteli taas c-MET ilmaisu tehtiin merkittäviä muutoksia. Esikäsittely RNaasi palamatta vaikutus MV. Tiheys kunkin kaistan määritettiin. Arvot kaaviossa ilmaistaan ​​densitometria suhteet HGF /β-aktiini tai c-MET /β-aktiini kuten taittuu yli ohjaus (katkoviiva). *

P

0,05, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, RNaasi-MV vs. MV; (C) HGF-geenin ilmentymistä 786-0 soluissa. 48 tunnin kuluttua inkubaation 786-0 solujen MV merkittävästi indusoi säätely ylöspäin HGF-geenin ilmentymisen, turhautunut RNaasi hoitoa. Ct (kynnys sykli) kullekin geenille määritettiin kullekin näytteelle. Kvantifiointi HGF normalisoitiin β-aktiini. HGF ilmentyminen kontrolliryhmän pidettiin calibrator (katkoviiva). Suhteellinen ilmentyminen kohdegeenin on laskettu 2

-ΔΔCt. *

P

0,05, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, RNaasi-MV vs. MV; (D) HGF värjäys kasvaimen osissa. Oli merkittävä tehostaminen HGF värjäytymisen tuumorisektioiden asettamisessa MV verrattuna RNaasi-MV tai valvontaa; (E) (F) Gel valokuva ja densitometrinen analyysi HGF ja c-MET-proteiinin ilmentymisen kasvainkudoksissa. MV suuresti aiheuttama HGF-proteiinin ilmentymistä tuumorikudoksissa. Kuten

in vitro

, esikäsittely RNAasi kumotaan indusoivaa vaikutusta. *

P

0,05, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, RNaasi-MV vs. MV.

In vitro

, c-Met estäjä kumoaa aktivoinnin AKT ja ERK1 /2 signalointi 786-0 soluissa ja solujen kasvua indusoi MV

in vivo

, MV johti merkittävään aktivointi AKT ja ERK1 /2 signalointi 786-0 soluissa jälkeen 48 tunnin inkuboinnin (Fig. 6A ja 6B). Tarkastusta yhdistyksen HGF induktion aktivointi AKT ja ERK1 /2, c-Met estäjää lisättiin estää HGF /c-Met signalointireitin. Kohteisiin, minkä lisäksi c-Met: n estäjä, aktivointi AKT ja ERK1 /2 signaloinnin aiheuttama MV oli oleellisesti tyhjäksi (Fig. 6A ja 6B), mikä osoittaa, että HGF induktio on yksi kriittinen osallistujista aktivointi AKT ja ERK1 /2 signalointi. Lisäksi c-Met: n estäjä hidasti merkittävästi tuumorisolujen kasvua stimuloidaan MV kuten on esitetty CCK-8 (Fig. 6C).

(A) (B) geeli valokuva ja densitometrinen analyysi p-AKT ja p- ERK1 /2-proteiinin ilmentymisen 786-0 soluissa. MV johti selvästi fosforylaatioon AKT ja ERK1 /2-proteiineja kuluttua 48 h inkubaation 786-0 soluihin, poistettiin c-Met estäjä. Tiheys kunkin kaistan määritettiin. Arvot kaaviossa ilmaistaan ​​densitometria suhteet p-AKT /β-aktiini, p-ERK1 /2 /β-aktiini kuten taittuu yli ohjaus (katkoviiva). *

P

0,05, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, MV + c-Met estäjä vs. MV;

×

P

0,05, c-Met estäjä vs. kontrolli; (C) CCK-8-määritys. 48 tunnin kuluttua inkubaation 786-0 soluja, lisäksi c-Met: n estäjä suuresti hidastaa solukasvua indusoi MV. *

P

0,01, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, MV + c-Met estäjä vs. MV;

×

P

0,05, c-Met estäjä vs. kontrolli.

Väliaine ehdollistettu hWJ-MSC: on samanlainen pro-kasvain vaikutus kuin MV molemmat

in vivo

ja

in vitro

toisin hallita, vakioitu väliaine (CM) on hWJ-MSC: johti aikaisemmin kasvain esiintyminen ja suurempi kasvaimen kokoa (Fig. 7A ja 7B). CCK-8-määritys paljasti myös, että CM suuresti vauhditti 786-0 solujen

in vivo

(Fig. 7C). On Näiden tulosten, voimme varmistaa, että MV ovat yksi keskeinen efektoreita hWJ-MSC:. Tutkitaan vaikutusmekanismit MVS voi auttaa paljastaa kuinka hWJ-MSC: t käyttää pro-kasvain vaikutus RCC.

(A) Tumor esiintyvyys. Oli korkeampi kasvaimen esiintymistiheys nude-hiirissä hoidettu CM tai MV verrattuna valvonta; (B) Kasvaimen tilavuus. Toisin kuin kontrolli, CM tai MV johtanut kehitystä suuremman kasvain nude-hiirissä. *

P

0,05, MV vs. kontrolli;

#

P

0,05, CM vs. kontrolli; (C) CCK-8-määritys. 48 tunnin kuluttua inkubaation 786-0 soluja, CM tai MV huomattavasti edistänyt kasvainsolujen kasvua. *

P

0,01, MV vs. kontrolli;

#

P

0,01, CM vs. kontrolli.

Keskustelu

Funktio MV uutena välittäjiä solu-solu viestintä on osoitettu useissa tutkimuksissa [27] – [29]. Vaakasuora siirto funktionaalisten mRNA: iden ja mi-RNA: t kautta MV on mukana geenivaihto solujen välillä [30] – [32]. Geneettinen informaatio siirretään MV on tärkein efek- toiminnallisten ja pheno-tyypilliset muutokset tapahtuvat vastaanottajan soluissa [27], [30], [33]. Eläinmalleissa munuaisen vamma, MV jäljittelevät edullinen vaikutus MSC:. Niinpä MVS vapauttaa MSC: voi olla yksi kriittinen tekijä niiden pro- tai anti-kasvain ominaisuuksia. Tutkia molekyylitasolla muutos tuumorisoluissa aikaansaama MV tekee hyväksi paljastumiseen ydin MSC: ”toimintaa.

Jotkut tutkijat ovat raportoineet, että MV on johdettu ihmisen MSC: käyttää anti-kasvain vaikutus

vuonna vivo

ja

in vitro

kokeellinen asetus [34], [35]. Edellisessä tutkimuksessa MV vapauttaa hWJ-MSC: t myös ehkäistä virtsarakon kasvainsolujen kasvua. RCC on toinen yhteinen urologic kasvain. Olimme hyvin uteliaita vaikutuksista MV tähän kasvain. In vitro ja in vivo kokeet suoritettiin tämän ongelman ratkaisemiseksi.

onnistuneesti eristetty MV peräisin hWJ-MSC: ”supernatantti ja tunnettu niitä. MV koostuivat hetero-geneous lipidi kaksikerroksinen vesikkeleitä vaihtelevat 30-500 nm ja ilmaistaan ​​CD9, CD29, CD44, CD63, CD73 ja CD105. MV oli runsaasti RNA (1,8 ± 0,3 mikrog RNA /mg proteiinia) ja RNase esikäsittely lähes täydellisesti ( 90%) tuhotaan RNA sisältöä.

Käyttämällä erilaisia ​​menetelmiä, teimme selväksi vaikutuksesta MV kun kasvu RCC.

In vitro

, MV edistää kasvua 786-0 osoituksena CCK-8-määrityksessä. Kun läsnä on MV: iden muodostuminen RCC kasvain oli nopeampaa, kun kasvaimen koko oli suurempi. Lisäksi, oli enemmän lisääntyvät kasvainsolut ja vähemmän soluja apoptoosin histologista tutkimusta. Muutos solusykliaktiivisuuden laukaisee MV määritettiin myös. MV johti kertymistä 786-0 solujen pääasiassa S-vaiheessa mieluummin kuin G0 /G1 vaiheeseen.

In vivo

, sykliini D1-proteiinin ilmentymistä kasvainkudoksissa oli myös huomattavasti sääteli. Sykliini D1, kriittiseksi välittäjänä, on mukana siirtyminen solusyklin G1: stä S-vaiheeseen [36]. On mahdollista, että MV edistää RCC kasvua helpottamalla kasvaimen solusyklin etenemisen. Samanlainen ilmiö havaitaan myös joissakin eläinmalleissa akuutti munuaisten tai maksavaurion. Anto MV vapautuu kantasoluista indusoi solusykliä paluu loukkaantunut epiteelisolujen aktivoimalla regeneratiivisen ohjelmia [37] – [40].

Toisaalta, huomasimme, että MV suosivat RCC hyökkäystä.