Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoitteena oli tunnistaa eturauhassyövän DNA hypermetylaation mikrosiru allekirjoitus (merkitty PHYMA), joka erottaa eturauhasen syövän eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH), korkea huonolaatuisesta ja tappava ei-tappavia syöpiä. Tämä on ei-satunnaistetussa retrospektiivinen tutkimus 111 paikallisen Aasian miesten (87 eturauhasen syöpiä ja 24 BPH) käsitelty 1995-2009 meidän laitokselle. Arkistointi eturauhasen epiteeli oli laser-capture microdissected ja genomista DNA: ta ja bisulfiitti-muunnetaan. Näytteitä profiloitu käyttäen Illumina GoldenGate Metylointi microarray, jossa raaka käsittelemiä tietoja GenomeStudio. Luokitus malli luotiin käyttäen tukivektorikone, joka koostuu 55-koetin-DNA metylaatio allekirjoitus 46 geenejä. Mallia itsenäisesti validoitu sisäisellä testaus aineisto, joka tuotti syövän havaitseminen herkkyys ja spesifisyys 95,3% ja 100%: lla, yleinen tarkkuus 96,4%. Toinen validointi toinen riippumaton Länsi kohortissa tuotti 89,8% herkkyys ja 66,7% spesifisyys, jossa yleinen tarkkuus 88,7%. PHYMA pisteet kehitettiin kunkin näytteen perusteella tilasta metylaatio PHYMA allekirjoitus. Lisääntyvä PHYMA tilanne oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan Gleason ja Gleason ensisijainen luokka. Men korkeammat PHYMA tulokset huonompi selviytyminen yhden muuttujan (p = 0,0038, riskisuhde = 3,89) ja monimuuttuja analyysit kun valvottuja (i) kliininen vaihe (p = 0,055, HR = 2,57), ja (ii) kliinisessä vaiheessa ja Gleason ( p = 0,043, HR = 2,61). Olemme edelleen suorittaa bisulfiitti genomista sekvensointia 2 suhteellisen tuntemattoman geenin osoittaa luotettavuutta analyysitulokset. PHYMA on siis allekirjoitus korkea herkkyys ja spesifisyys erotteleva kasvaimia BPH, ja on potentiaalinen rooli varhainen havaitseminen ja ennustamisessa selviytymistä.

Citation: Goh LK, Liem N, Vijayaraghavan A, Chen G, Lim PL, Tay KJ, et al. (2014) ja ennustavia Utility DNA hypermetyloitunut Gene Signature eturauhassyövässä. PLoS ONE 9 (3): e91666. doi: 10,1371 /journal.pone.0091666

Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 13 helmikuu 2014; Julkaistu: 13 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Goh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoittivat Singapore National Medical Research Council (NMRC NIG /0033/2008) ja HGS, Khoo Discovery palkinnot (KDP /2008/0002 ja KDP /2009/0006) ja Duke-NUS Signature -tutkimusohjelma Vaihe 1 rahoittaman viraston Science, Technology and Research (A * STAR), ja terveysministeriö, Singapore, jotta LKG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on eniten tapaus syöpä Yhdysvalloissa arviolta uusi 238590 diagnoosit (153 tapausta 100000 vuodessa). Koska kuolinsyy, se on arviolta vain 29720 tapauksessa (12%) [1]. Tämä ristiriita näkyy myös Singaporessa, Japanissa ja Koreassa, missä suhde esiintyvyys kuolleisuuteen on noin 0,2 [2] ja on suurelta osin johtuvan yli-diagnoosin kliinisesti merkityksetön eturauhasen syöpien seurauksena laajalle levinnyt eturauhasen antigeenin (PSA ) testaus.

kasvu varhaisten eturauhassyövän eivät ole mukana tarkka määrittäminen riskiä sairastuvuutta ja kuolleisuutta. Tämä on johtanut yli-hoitoon joillakin miehillä ja alle-hoitoa toisissa. Gleason luokittelua, pienitehoinen mikroskooppinen arviointi eturauhassyövän arkkitehtuurin kuvattu vuonna 1966 Donald Gleason, on pysynyt tukipilari eturauhassyövän ennustus [3], [4]. Kuitenkin pisteytysjärjestelmä, sovelletaan inter-tarkkailijan eroja ja puuttuu tarkkuus ennusteen arvioimiseksi varhaisessa vaiheessa eturauhasen syöpiä jotka yhä useammin diagnosoidaan [5], [6]. Tämä on osittain ratkaistu muutoksilla [7], sisällyttäminen tertiäärisen tulokset [8] ja käyttämällä kliinisiä nomogrammit [9]. Merkitty vaiheessa siirtymistä 80% eturauhasen syöpiä on diagnosoitu elimeen rajoittunut porras tasoitettiin tehoa näiden työkalujen paikassa diagnoosin. Aktiivinen valvonta, strategia selektiivisesti viivyttää radikaali hoito riski on erittäin pieni varhaisvaiheen eturauhassyöpä, liittyy usein seuranta ja vuotuinen eturauhasen koepaloja – lähde huomattavaa ahdistusta ja kustannuksia [10]. Vaikka muut veren ja kudosten biomarkkerit on ennustaa eturauhassyövän on kehitteillä, harvat niistä on validoitu laajasti eikä yksikään niistä ovat kliinisessä käytössä [11].

Epigeneettiset muutoksia, joihin sisältyy mekanismeja, jotka käynnistävät ja ylläpitää periytyvä kuviot geeniekspression muuttamatta sekvenssi genomin, on prosessi, jossa useita kerroksia monimutkaisuus [12]. Näitä ovat histonimodifikaation, kromatiinin remodeling, nukleosomi käyttöasteen ja DNA: n metylaatio. Näiden mekanismien, DNA: n metylaatio on kaikkein hyvin kuvattu ja tutkittu. Promoottori hypermetylaation ja seurauksena transkription hiljentäminen on havaittu olevan laajaa ja liittyy satojen geenien lähes kaikissa syövän tyypit ja on tullut tärkeä painopiste epigeneettisellä tutkimuksen [12], [13], [14]. Todisteet aikaisemmista tutkimuksista on liitetty promoottori hypermetylaatiota erityisten geenien synnyssä ja syövän etenemisen eturauhassyöpä, esim.

APC, RARβ

, ja

GSTP1

[15]. Nämä tutkimukset keskittyivät valittu denaturoidulla geenejä kuin maailmanlaajuista geenin metylaatio, jotka rajoittavat herkkyys ja spesifisyys diagnoosin ja ennusteen. Diagnostinen tai prognostisen allekirjoitus liittyy useita geenejä voi parantaa erottelukykyä. Vaikka molekyylitason allekirjoituksensa geenien ilmentymisen paneelit osoitti lupaavia herkkyys (93-97%) ja spesifisyys (87-100%) [16], [17], vakautta DNA materiaali tekee hypermetylaation allekirjoitus enemmän toteuttamiskelpoinen vaihtoehto, varsinkin arkistoidut parafiini- upotettu kudosnäytteitä. Vaikka useat tutkimukset ovat käyttäneet genomin laaja metylaatio paneelit [18], [19], [20], [21], [22], havainnot ovat edelleen vain kandidaattigeenejä lähestyä. Nopea edistyminen epigenetiikka on mahdollistanut kehittymistä suurikapasiteettisten tekniikoiden analysoida metylaation eturauhassyövän geenejä selvittämään molekyylitason allekirjoituksia, jotka voivat olla vastineena Gleason luokitusjärjestelmä.

Tavoitteena oli löytää ainutlaatuinen maailmanlaajuinen geeni hypermetylaation muutoksia, jotka olivat syöpää erityisiä ja syrjisi eri eturauhassyövän fenotyyppejä. Käytimme korkean suoritustehon DNA: n metylaation mikrosiruja ja analysoidaan useita geenilokusten ihmisen eturauhassyöpäkudoksille tavoitteiden kanssa tunnistaa diagnostisia DNA hypermetylaation allekirjoitus, joka erottaa eturauhasen liikakasvun (BPH), huono laatu ja korkealuokkaisesta eturauhasen syöpiä, jotta erottaa tappava ei-tappavia eturauhasen syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma ja Patient osallisuutta

hyväksyntä tämän tutkimuksen antamien SingHealth Keskitetty institutionaalisten Review Board B (Hyväksyntänumero CIRB # 32B /2007). Tarve suostumus oli luopunut tarkastelun hallituksen ottaen taannehtivuus tutkimuksen ja pitkän arkistointi ajan kudosten mukana.

Tämä on ei-satunnaistetussa retrospektiivinen tutkimus geenin hypermetylaation eturauhassyövässä ja hyvänlaatuisia eturauhasen liikakasvun (BPH). Tapaukset eturauhassyövän stratifioitiin perustuvat vaiheessa ja arvosana. Kliiniset ja patologiset lavastus suoritettiin käyttäen 2007 AJCC TNM lavastus ja histologista luokittelu perustui Gleason asteikon mukaan [7].

Parafiini upotettu arkistointiin kudosten paikallisen Aasian väestön saatiin yksi laitos (Singapore General Hospital) . Kudosten syöpätapausta saatiin potilailla, joiden on kliinisesti paikallinen eturauhassyöpä ja kehittyneet metastasoituneen eturauhasen syöpiä. Kudokset entisestä ryhmästä saatiin miehiä, joille tehtiin eturauhasen; kudokset jälkimmäiseen ryhmään saatiin miehet, jotka tehtiin höyläysleikkaus eturauhasen ja kahdenvälisiä orkiektomia samanaikaisesti. Alueellinen imusolmuke etäpesäke havaittiin vatsa-lantion CT ja MRI ja luinen etäpesäkkeitä vahvistettiin positiivinen Teknetium

99 luuston kuvauksissa. Potilaat, joille tehtiin säteilyä tai androgeenien puute hoitoa ennen höyläysleikkaus kuulumattomana. BPH tapausta saatiin höyläysleikkaus miehillä hyvänlaatuinen eturauhasen laajentumisen ja PSA 4 ng /ml ennen leikkausta ja hyvänlaatuisia asema vahvistettiin histologisesti. Ohjaus kudokset saatiin BPH, kuten BPH on yleinen kohortin miesten alttiita eturauhasen syöpä ja se on edelleen yleisin erotusdiagnosoinnissa nämä miehet. Emme käytä viereiseen normaaliin kudokseen miesten eturauhassyövän, jotta vältetään mahdolliset kentän muutos kirjataan [23].

Näytteenotto

laatu ja vaihe jokaisen näyte ensimmäinen vahvistettu alle hematoksyliinillä ja eosiiniväriä jonka patologi. Syöpä rikas alueet on leimattu ja eturauhasen epiteeli eristettiin laser kaapata Mikrodissektiomenetelmiä käyttäen Zeiss P.A.L.M. järjestelmä (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Saksa). Potilaan demografiset ja kasvaimen profiilin, kuten ikä, ennen leikkausta PSA, kliinisiä ja patologisia vaiheessa ja patologinen Gleason laatu saatiin. Kesto seurannan, ja aikaa biokemiallisten uusiutuminen ja syövän aiheuttamaa kuolleisuutta kirjattiin.

DNA Extraction ja Sample Profilointi

Genominen DNA uutettiin käyttämällä 300 ui hajotuspuskuria (50 mM Tris HCl: lla, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20: tä) ja 20 ui proteinaasi K (20 mg /ml, Qiagen, Valencia, CA). Näytteitä inkuboitiin 55 ° C: ssa 48 tuntia pyörivässä uunissa. Proteinaasi K inaktivoitiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu 94 ° C: ssa 10 minuutin ajan ja sentrifugoitiin lyhyesti 5 minuuttia 260

g

. Määrä uutettua DNA: ta määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä, kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Optimoida DNA muuntaminen ja vähentää vaihtelevuutta näytteiden välillä, 500 nanogrammaa genomista DNA oli bisulfiitti-muunnetaan EZ DNA Metylointi Kit (Zymo Research, Orange, CA) kohti valmistajan suositusten mukaisesti. Bisulfiittikonversio genomisen DNA johtaa metyloitumattoman sytosiinin muunnetaan urasiilin kun metyloidut sytosiinit säilyvät ennallaan. Sitten näytteet profiloitu on Illumina GoldenGate BeadArray mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, bisulfiitti-muunnettu DNA käy läpi hybridisaation alleelispesifistä oligonukleotidi ja lokuksen-oligonukleotidi, joka on riippuvainen C /T nukleotidin polymorfismi kussakin CpG. Fluoresenssileimattu PCR-alukkeita Cy3 käytettiin monistamaan metyloimatonta templaatti-DNA, kun taas Cy5 leimattuja alukkeita käytettiin monistamaan metyloitua templaatti-DNA. Intensiteetti 2 fluoresenssisignaalien analysoitiin Sentrix Array Matrix, ja taso metylaation CpG lokuksessa mitattiin β arvo jossa β = [max (Cy

5

, 0)] /( | Cy

3

| + | Cy

5

| +100). Β arvo oli keskimäärin useita mittauksia 30 rinnakkaisnäytettä tehtävä jokaisessa CpG loci ja tulokset vaihtelevat 0-1,0 jälkeen vähentämällä taustan tarjoamien valvonnasta kuuluu array matriisi [25]. Laadunvalvontaan, universaali metyloituja ja metyloimattomien näytteet otettiin mukaan kontrolleina profiloinnissa. Varmistaa tietojen laatu, näytteet korkea bisulfiittikonversion ≥20,000 olivat mukana tutkimuksessa.

bisulfiittimodifiointi Sequencing vahvistukseksi Novel Geenit

DNA: n eristämistä ja bisulfiittimodifikaatio DNA: ta edellä kuvatulla tavalla. Bisulfiitti genomista sekvensointia (BGS) analyysit

ALOX12

ja

PDGFRB

suoritettiin seuraavat alukesarjat: For

ALOX12

: BGS5: GGGAGGTTTAGGAAGGTTT; BGS6: AAAACTAACTATACCTCCTAATC. Sillä

PDGFRB

: BGS2: AATCTCCCTAAATACCATAACAA; BGS3: GGGATGTTTAGAAATTTTATAGTT. Kaikki Alukesarjat aikaisemmin testattiin ei vahvistamiseksi mitään unbisulfited DNA. Sillä BGS, kaikki PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen AmpliTaq Gold DNA-polymeraasia 40 sykliä ”hot start” (Applied Biosystems, CA, USA). PCR-tuotteet puhdistettiin geelissä, leikattiin ja TA-kloonattiin pCR2.1-TOPO-vektoriin (Invitrogen, CA, USA) ja 8-12 pesäkkeet valittiin satunnaisesti ja analysoitiin käyttäen dideoksinukleotidisekvensoinnilla.

Generation luokittelu Model

Raw tiedostot Illumina alustan käsiteltiin käyttäen Illumina GenomeStudio saamiseksi β arvo (0-1) kunkin anturin ja näytteen. Β on osoitus havaittu metylaation suhteen suurin mahdollinen metyloinnin kunkin koettimen. 111 näytettä (87 syöpiä, 24 BPH) onnistuneesti profiloitu, läpäissyt laadunvalvontaa (katso näyte profilointi), ja oli saatavilla analyysiä varten. Voit luoda luokitus malli, joka erottaa eturauhassyövän ja BPH ilman päälle sovittamalla data, 2-vaiheen suunnittelu koulutusta (discovery) ja testaus (validointi) käytettiin [26], [27]. 111 Näytteet satunnaisesti ositettu koulutukseen (Kasvaimen = 44, BPH = 12) ja testaus (Kasvaimen = 43, BPH = 12) aineistoja, säilyttäen alkuperäinen esiintyvyys vaiheessa määritelty Gleason molemmissa aineistoja. Tämä oli varmistaa sekä aineistoja on verrattavissa levinneisyys sairauden vaiheessa. Analyysi rajoittui hypermetyloitunut antureista, eli koettimet jossa keskiarvo β arvo kasvainten oli suurempi kuin keskimääräinen β arvo BPH [(μ

kasvaimeen μ

ohjaus) 0] koulutuksessa aineisto. Tämä johti 1013 koettimien mallintamiseen. Tukivektorikone (SVM, https://www.chibi.ubc.ca/gist/index.html) [28], [29] käytettiin synnyttämään luokittelumallin koulutusta aineisto käyttäen seuraavia parametreja: (i) rekursiivinen ominaisuus poistaminen anturien valintaan, (ii) radial perusteella ytimen toiminto σ = 1, (iii) vähentäminen antureista iterointia kohti = 10%, ja (iv) iteraatioiden = 40. tuloksena SVM malli sitten validoitu testaus aineisto, jossa suorituskyky arvioitiin herkkyys, spesifisyys, kokonaistarkkuus, ja vastaanotin käyttöominaisuudet (ROC), joka arvioi AUC suorituskykyä.

Independent Dataset

Independent validointi suoritettiin western kohortti saatu Oregon Health Science University (OHSU) [18]. Baseline ominaisuudet kohortti on koottu taulukkoon S1 File S1. Raakadata on käsitelty samalla tavalla, kuten on kuvattu menetelmät. 59 kasvaimet ja 3 normaalin (potilaat ilman histologiset eturauhassyöpä) eturauhasessa läpäissyt laadunvalvontaa (katso näyte profilointi) ja käytettiin vahvistettavaksi. Kliiniset tiedot kuten Gleason pisteet, vaihe, ja uusiutumisen olivat saatavilla ja arvioitu.

PHYMA Allekirjoitus ja Pisteet

hypermetyloitunut koettimet selvitetty päässä SVM mallinnus merkitään kuten PHYMA allekirjoitus – eli eturauhassyövän DNA hypermetylaation microarray allekirjoitus. Arvioida yhdistys PHYMA allekirjoituksen kanssa kliinis tekijät, olemme kääntäneet PHYMA allekirjoituksen yhdeksi indeksiin, joka merkitään kuin PHYMA pisteet laskemalla määrä koettimien PHYMA allekirjoitus kanssa β≥0.7. Tämä oli helpottaa kliinistä tulkinnan PHYMA allekirjoituksen kautta yhden ennustetekijä.

kynnys β≥0.7 määritettiin tarkastus universaali metyloitu ja metyloitumaton vertailukokeineen (ks laadunvalvonta protokolla näytteessä profilointi). Havaittiin, että β≥0.7 oli merkittävästi vahva erottamaan metyloitu ja metyloitumaton (p 2.2e-16, Fisherin eksakti testi), ja näin ollen käytetään laskemaan useita koettimia (pois 55), joka metyloitiin kunkin näyte. Toisessa tutkimuksessa DNA metylaatio luuydinsolujen [30], todettiin mediaani β varten hypermetylaation oli 0,75, mikä edelleen tukee rajaa käytetään tässä tutkimuksessa.

Data Analyysit

kliininen merkitys of PHYMA ottelun Gleason indeksit (ts Gleason ja Gleason ensisijainen laadut) arvioitiin käyttäen lineaarista regressiota. Analyysit PHYMA tulokset välillä kasvain ja BPH, matala (Gleason pisteet 6) ja korkea (Gleason pisteet 8-10) laadut suoritettiin Welchin t-testillä. Kokonaiselossaoloaika tai biokemiallisten uusiutumista elinaika analysoitiin Kaplan-Meier ja Coxin suhteellisen vaaran (Wald koe) yhden ja usean mallien lla, kliinisessä vaiheessa ja Gleason tulokset kovariantteja monimuuttujakalibrointiin malleissa. Eloonjäämisessä analyysit, näytteet ositettu matalan ja korkean PHYMA tulokset perustuvat mediaani PHYMA tulokset meidän aineisto (eli korkea PHYMA ryhmä: PHYMA pisteet 32, Low PHYMA ryhmä: PHYMA pisteet = 32). Kokonaiselossaoloaika laskettiin alkaen diagnoosi kuolinpäivä vuoksi taudin. Miehet, jotka olivat elossa tai kadonnut seuranta aikaan analyysin sensuroitiin ajankohtana viime seurannan. Tilastolliset analyysit lasketaan käyttäen R tilastollisten ja eloonjäämisen paketit (www.r-project.org). Pathway analyysi tehtiin käyttämällä Ingenuity Pathway Analysis ohjelmisto (kekseliäisyyttä, Kalifornia, USA). Metylointi aineisto on MIAME yhteensopiva ja on toimitettu Gene Expression Omnibus (GEO) verkkosivuilla, sarja hakunumero GSE39603. Linkin aineisto on https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=zzylboguukqgqpm acc=GSE39603.

Results

A yhteensä 111 parafinoidut arkistointia kudosnäytteitä saadaan 87 miesten eturauhassyövän ja 24 miehiä BPH leikkauksesta suoritetaan yhden laitoksen vuosina 1995 ja 2009 sekä 1013 hypermetyloitunut koettimia Illumina array käytettiin tässä tutkimuksessa. Lähes kolme neljäsosaa syöpätapauksista on kliinisesti elimeen rajoittunut syöpään (T1 42,5%, T2 25,3%) ja noin puolet oli korkea Gleason asteen tauti (Gleason pisteet ≥8 55,2%). Neljännes tapauksista oli metastasoitunut aikaan esityksen (M1 25,3%, M0 74,7%), joista yhdessä tapauksessa oli läpikäynyt säteilyn ja hormonihoidon ennen kudoksen hankintaa aikana kanava TURP (höyläysleikkaus eturauhasen). Taulukossa 1 esitetään yhteenveto lähtötilanteen ominaisuudet näiden syöpäpotilailla.

luokitusmalli eriyttäminen kasvaimet ja BPH

Classification malli luotiin käyttäen 2-vaiheen tutkimuksessa suunnittelu koulutusta ja testaus. Käyttämällä satunnaisotannalla, sekä koulutus ja testaus aineistot ovat verrattavissa jakelun suhteen otoskoot, vaihe ja laatu kasvainten ja BPH. SVM malli luotiin käyttäen allekirjoitusta, joka koostuu 55 antureista kohdistaminen CpG lokusten 46 geenien; hypermetylaation allekirjoitusta, joka merkitään nimellä ”PHYMA”. Kuvassa 1 vastaava lämpökarttoja koulutus- ja validointi aineistoja. Koulutuksessa aineisto, oli korkea herkkyys ja spesifisyys, 95,5% (42/44) ja 100%: lla (kuva 1a). Ensimmäinen validointi aineisto (eli testauksen aineisto) tuotti samanlaiset suorituskyky; 95,3% (41/43) herkkyys ja 100% tarkkuus (kuva 1b). Toinen validointi riippumattomaan OHSU aineisto osoitti 53/59 (89,8%) kasvain ja 2/3 normaalissa (66,67%) näytteet luokitellaan asianmukaisesti (kuva 1c). Koulutuksessa aineisto, 2 kasvaimia luokitellaan väärin antaa yleistä tarkkuutta 96,4%. Validointiin aineistoja, 2 kasvaimia luokitellaan väärin testaamiseksi aineisto ja 6 kasvaimia OHSU aineisto. Kaikki BPH näytteet luokiteltiin oikein koulutusta ja testaus aineistoja, kun taas 1 normaali näyte luokiteltu väärin vuonna OHSU. 2 validointi aineistot testaus- ja OHSU antoi yleinen tarkkuus 96,4% (ROC = 0,998) ja 88,7% (ROC = 0,927) vastaavasti. Tämä löysi tukea sitkeyden PHYMA allekirjoituksen ja luokitusmalli. Kyky allekirjoitus erottaa kasvainten BPH näytteistä validointi aineistoja osoittaa taustalla biologista merkitystä geenien PHYMA eturauhassyövässä. Taulukko S2 File S1 listaa 55 antureista ja sen vastaava paino SVM mallissa.

(a) koulutus aineisto paikallisten Aasian väestöstä. (B) Testauksen aineisto paikallisten Aasian väestöstä. (C) OHSU western kohortti aineisto. Kukin rivi edustaa metylaation koetin ja pylväs näyte. Taso metylaation vaihtelee vihreästä (alhainen β) punaiseen (korkea β). Kasvainnäytteet showedmore poikkeava DNA: n metylaatio verrattuna BPH kudokseen. Kaikki kasvain näytteet osoittivat suhteellisesti korkeampi DNA: n metylaatio verrattuna ei-kasvain näytteissä.

kliininen merkitys PHYMA

Oli ilmeistä kuviosta 1, että syöpä näytteitä on enemmän poikkeava DNA: n metylaatio verrattuna BPH. PHYMA allekirjoitus BPH näytteessä oli verrattain pienentää metylaation kautta antureista. Tämä on yhdenmukaiset kirjallisuuteen jotka syövät yleensä satama enemmän metylaatio verrattuna ei-syöpäkudokseen [31].

Käyttäen PHYMA pisteet kunkin näytteen, kliinistä merkitystä suhteessa Gleason tulokset ja yleistä eloonjäämistä arvioitiin. Kuvio 2 esittää yhdistys PHYMA kunkin kliinisen parametrin yhdistettyä koulutusta ja testaus aineisto. Kuten odotettua, syöpä näytteillä oli korkeampi PHYMA pisteet kuin BPH (p 2.2e-16, kuva 2a). Yleensä syöpiä Gleason ensisijainen luokka 3 on alhaisempi PHYMA tulokset, kun taas korkeammat Gleason ensisijainen laadut osoitti korkeampi PHYMA tulokset, mikä viittaa siihen, että poikkeava metylaatio näistä 55 antureista voi olla korvike histologista grade. Regressioanalyysillä kasvainnäytteestä osoitti PHYMA tulokset liittyivät positiivisesti Gleason (beta = 2,45, p = 0,007, kuva 2a), Gleason ensisijainen luokka (beta = 5,25, p = 0,002. Kuvio 2b), ja ero matalan ja korkean laadut (beta = 11,61, p = 3.9e-4, kuva 2c). Analyysi PHYMA tulokset osoittivat korkeaa Gleason asteen kasvaimet ovat korkeammat PHYMA pisteet kuin huono laatu kasvaimet (p = 1.59e-5, kuva 2c). Käyttämällä mediaani PHYMA tulokset 32 ​​kuin cut-off, kasvain tapausta jaettiin korkean ja matalan PHYMA tulokset ryhmiä. Kokonaiselossaoloaika univariate analyysi paljasti potilasta korkean PHYMA tulokset ryhmä on huonompi selviytyminen (p = 0,0038, Wald testi, HR = 3,89, kuva 2d taulukko 2 Malli 1). Monimuuttuja eloonjäämiseen analyysi kontrolloiden (i) kliininen vaihe (Malli 2: p = 0,055, HR = 2,57), (ii) kliinisessä vaiheessa ja Gleason tulokset (Malli 3: p = 0,043, HR = 2,61), osoitti korkea PHYMA tulokset ryhmä oli yhteydessä heikompaan selviytymisen tulokseen riippumatta Gleason tulokset (taulukko 2). Kliininen vaihe ja Gleason tulokset ovat tunnettuja ennustetekijöitä indikaattorit eturauhassyöpään. Tutkimuksemme osoitti siten, että PHYMA pisteet voi olla potentiaalinen riippumaton indikaattori ja voi täydentää ennuste ennustaminen tauti. Yhdessä nämä tulokset osoittivat merkittävän yhdistys PHYMA tulokset histologisia lajittelemaan ja PHYMA tulokset ehkä erottamaan tappavien ja ei-tappavien kasvainten riippumatta Gleason indeksien.

(a) Gleason pisteet, (b) Gleason ensisijainen luokka, (c) välinen ero matalan ja korkean asteen, ja (d) kokonaiseloonjääminen. Kasvain näytteillä on suurempi PHYMA tulokset verrattuna BPH ja liittyvät positiivisesti (a) Gleason pisteet, (b) Gleason ensisijainen laatu, ja (c) välinen ero korkean ja matalan laadut. (D) Kaplan Meier osoittaa näytteiden korkeampi PHYMA huonompi selviytyminen.

Evaluation of kliinistä merkitystä on OHSU näytteet osoittivat kasvaimia tähän Western kohortin ovat alhaisemmat PHYMA tulokset verrattuna Aasian kohortissa (Kuva S1a in File S1), todennäköisesti johtuu kohortti vaikutuksia, kuten koe- ja /tai etnisistä eroista. Samanlaisia ​​Aasian kohortin OHSU kasvaimet kanna korkeampi PHYMA pisteet normaalia näytettä. Regressio analyysejä PHYMA tulokset eivät osoittaneet merkitystä vaikka samanlainen myönteinen suuntaus oli peräisin Gleason pisteet 4-8 (beta = 2,28, p = 0,2). Mielenkiintoista, PHYMA pistemäärät Gleason pisteet 9 osoitti pulahtaa verrattuna Gleason pisteet 8, kuten meidän data. 6 virheellisesti luokiteltu kasvaimet, useimmat olivat alhaisemmat Gleason; 4 alkaen Gleason pisteet 6, 1 päässä Gleason pisteet 7, ja 1 päässä Gleason pisteet 8. Vain toistumisen tietoja saatavilla OHSU aineisto ja toistuminen analyysit paljastivat samansuuntaisesti kuin meidän eloonjäämiseen vaikka mitään merkitystä havaittu (p = 0,369); korkeampi PHYMA tulokset kasvaimet usein muita huonompi ennuste (kuva S1B File S1). On huomattava, että näyte koko uusiutumisen analyysi on pieni, n = 18.

biologinen merkitys PHYMA

Useat tutkimukset ovat käyttäneet korkean suoritustehon sirutekniikalla tunnistaa hypermetyloitunut geenien eturauhasen kasvaimia [18], [19], [20], [21], [22]. Huolimatta eri joukko alustoja, suurin osa geenien PHYMA allekirjoitus (42/46, 91,3%) on raportoitu näissä tutkimuksissa (taulukko S3 File S1). Jotkut geenit, kuten

GSTP1, GSTM2, APC, WR, TJP2, SEPT9,

ja

ADAMTS12

havaittiin raportoidaan enemmän kuin yksi edellä mainituista tutkimuksista. Tämä osoittaa luotettavuutta meidän tuloksia ja tukee edelleen toiminnallista roolia geenien PHYMA allekirjoitus.

Pathway analyysit osoittivat 46 geenien PHYMA olivat biologisesti merkityksellisiä syövän ja sukuelimiin sairaus, erityisesti toiminnallisten roolien kuten solujen liikkumisen , solu-solu–signaloinnin ja vuorovaikutus, ja tulehduksellinen vaste. Suurin osa geeneistä aiemmin osallisena eturauhassyövän, kuten:

ALOX12, APC, CDKN1B, EPHA2, GSTP1, KIT, MMP7 MMP9, PDGFRB, PYCARD, RARA, WR, RARRES1

, ja

TIMP1

[32], [33], [34]. Useat ovat tunnettuja biomarkkereita diagnoosi ja ennuste eturauhasen syöpä (

APC, GSTP1, KIT, PYCARD, PGDGRB, WR, RARRES1

, ja

TIMP1

) [35], [36], [ ,,,0],37], [38], [39], [40] ja jotkut muttei biomarkkereita, todettiin väärin säädellystä taudin (

CDKN1B, MMP7

, ja

MMP-9

) [41 ].

metylaatiostatuksen ALOX12 ja PDGFRB

Niistä 46 geenit PHYMA, valitsimme

ALOX12

ja

PDGFRB

; 2 geeniä, jotka olivat mukana, mutta vielä suhteellisen uusi eturauhassyövässä, toiminnallinen validointi. Tavoitteena oli selvittää, β arvot koordinoida array CpG on GoldenGate metylaatiomääritystä (GGMA) on tyypillinen metyloitua tilassa. BGS tehtiin

ALOX12

ja

PDGFRB

5 eturauhasen kasvaimia ja 2 BPH näytettä (kuva 3). On hyvä välistä yhdenmukaisuutta prosentin metylaatio näytteissä käyttämällä GGMA ja BGS, samaa luokkaa kuin [25]. Kaikki eturauhasen kasvaimia havaittiin hypermetyloitunut sekä

ALOX12

ja

PDGFRB

, kun taas 2 BPH näytteet pysyivät metyloimatonta (Spearman kerroin 0,67 ja 0,78 vastaavasti) (kuvio 3).

5 eturauhasen kasvaimia ja 2 BPH kudokset validoitu. Yläpalkki näyttää genomiikka Geenin sijainti ja kohdealueen sekvensointiin (nuolet). Jokainen rasti baarissa osoittaa CpG sivuston. Pohja näyttää tason metylaation kussakin paikassa. BGS oli hyvä yhteensopivuutta β arvot GoldenGate (GGMA) määritys;

ALOX12

(Spearman kerroin: 0,67),

PDGFRB

(Spearman kerroin: 0,78).

Keskustelu

Gleason luokitusjärjestelmä oli ensimmäinen kannatti vuonna 1966, koska yhdistelmä ensisijaisen ja toissijaisen laadut eturauhassyövän saatiin parempi korrelaatio selviytymisen tuloksia kuin yksittäinen histologista luokitusta. Viime aikoina raportointi tertiääristä Gleason luokan neuvottiin niin tapauksissa alhainen Gleason ensisijainen ja toissijainen laadut pienemmillä kolmannen pesäkkeitä korkeamman Gleason asteen syöpien osoitti huonommat tulokset kuin puhtaalla alhaiset Gleason syöpiä [8], [42]. Inter-tarkkailija eroja ja kokemusta eturauhassyövän histologisia arviointi ovat myös tekijöitä, jotka vaikuttavat lopullisen Gleason luokittelu. Näitä kysymyksiä subjektiivisuuden ja epätarkkuuksia voidaan vähentää paremmalla molekyyligenetiikan tekniikoita arvioida aggressiivisuus syövän.

Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet uuden PHYMA allekirjoitus, joka on kyky eturauhassyövän erottamisessa BPH ja syrjiä korkealaatuista syövät alkaen huono laatu niistä. Toisin kuin Gleason pisteytysjärjestelmä, PHYMA ei kuulu välisiä tarkkailija eroja tulkinnassa metylointituloksia ja arkistointia kudoksia, jolle testi suoritetaan helposti saadaan leikkauksen jälkeen tai koepalan ilman huolta materiaalia hajoamisen tai valmistelevat olosuhteissa. Hypermetyloitunut allekirjoitus oli tarkkuus 96,4% (testaus aineisto) ja 88,7% (OHSU aineisto) Aasian ja Länsi kohortteja vastaavasti. Vahvistukset 2 aineistot osoittivat luotettavuutta allekirjoituksen ja luokitusmalli sekä biologista merkitystä geenien PHYMA eturauhassyövässä. Meidän aineisto, romaani PHYMA pisteet osoittivat paitsi merkittäviä yhteyksiä kliinisiin parametreihin kuten Gleason ensisijainen, tulokset, ja laatu, mutta myös merkittäviä eloonjäämiseen ennusteen jälkeen ohjaamalla vaiheessa ja Gleason indeksit. Vuonna OHSU aineisto, vaikkakin alhaisempi PHYMA pisteet havaittiin, suurin osa näytteistä luokiteltiin oikein (55/62). Samanlaisia ​​suuntauksia havaittiin kannalta suurempi PHYMA pisteet yhä Gleason laadut ja aikaisempien biokemiallisten uusiutuminen vaikka merkitys ei havaittu, mikä saattaa johtua pienempi otoskoko. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että PHYMA voisi mahdollisesti erottaa tappava ei-tappavia eturauhassyövän ja voi olla arvokas molekyyli väline kliinisen päätöksenteon eturauhassyövän hallintaan.

Tutkimus on erityisen tärkeää nykyajan eturauhassyövän hallintaan, koska se voidaan mahdollisesti kehittynyt hoitopaikassa testin avulla kudoksia koepaloja. Tämä on tärkeää, koska enemmän invasiivisia Ablatiivi menettelyjä kehitetään jotka mahdollistavat potilaiden välttää eturauhasen ja riskeineen voimattomuuden ja virtsankarkailu. Aktiivinen valvonta selektiivisten viivästetty interventio käytetään myös joillakin potilailla, joilla on erittäin vähäinen riski eturauhasen syöpiä. Nämä hoidot ovat yleensä kannattanut valittu alhaisen riskin yksipesäkkeistä eturauhasen syöpiä ja niiden valintaan ovat voimakkaasti riippuvaisia ​​biopsia Gleason pisteet. Kuitenkin undergrading Näiden koepalojen esiintyy 20-30%: ssa tapauksista, ja se voidaan minimoida paremmin molekyyli- kuulustelutekniikoita kuten metylointi allekirjoituksen kuten PHYMA [43].

Vaikka geeniekspression tutkimukset ovat tuottaneet useita geenejä ja geeni allekirjoitukset ennustaa selviytymisen tuloksia eturauhassyövässä [16], [17], nämä tutkimukset vaativat tuore kudosten tiukoin laboratorio-olosuhteissa, joita on vaikea saavuttaa toistamiseen kiireinen leikkaussalissa asetuksia. Epävakaus RNA voi olla puute standardointia muutosten havaitsemiseksi RNA ekspressiotasot mikrosirulähestymistavassa ilme tutkimuksissa [44].