Krooninen sairaus

tiivistelmä

tyrosiinikinaasiestäjiksi kuten erlotinibi käytetään yleisesti terapeuttisena aineena syövän johtuen sen suhteellisen alhaisen sivuvaikutusprofiili ja ajoittain parempaa tehoa. Kuitenkin erlotinibi vastus (ER) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä on tunnustettu suuri ongelma. Siksi ymmärtäminen mekanismia taustalla ER ja kehittää tehokkaita hoito tarvitaan. Autophagy rooli syövän on kiistanalainen ja epäselvä. Tässä tutkimuksessa selvitimme tehokkuutta pieniannoksisen erlotinibin-sisplatiiniyhdistelmähoidon in erlotinibin resistenttien keuhkoadenokarsinooma (ERPC9) solut ja rooli autophagy ER. ERPC9 solut perustetaan erlotinibin herkkien PC9 soluja. Asianmukaiset käsittelyt tehtiin kahden päivän ja solujen eloonjäämistä määrä määritettiin Alamar Blue määrityksessä. LC3II ja sääntelyn proteiinit autophagy mitattiin western blot. Sirna (siRNA) käytettiin estämään käännös kiinnostavan proteiinin. Vuonna ERPC9 soluissa yhdistelmä indusoi synergistisiä solukuolemaa ja merkittävä väheneminen autophagy. Lähtötilanteessa ERPC9 solut oli huomattavasti korkeampi LC3II ja alempi p-mTOR tasot verrattuna PC9 soluihin. Lisääminen Rapamysiinin vastustus lisääntyy ja 3-metyyliadeniinin herkistyneet ERPC9 soluihin, mikä osoittaa autophagy voidaan toimii suojamekanismi. Lisätutkimuksia paljasti, että ERPC9 solut tunsivat korkean perustason Atg3 tasolla. Korkea pohjapinta Atg3 on kohdennettu merkittävästi alensi yhdistelmähoidon. siRNA transfektointi Atg3 johti käänteinen ER; 42,0% enemmän soluja kuoli erlotinibin-alone hoidon transfektion verrattuna ei-transfektoitujen ERPC9 soluissa. Me paljastaa uusi rooli Atg3 edistämisessä ER estyminen Atg3 käännöksen pystyi johtaa uudelleen herkistymisestä ERPC9 solujen erlotinibille-alone hoitoa. Lisäksi osoitamme, että yhdistelmä erlotinibi-sisplatiinin on tehokas hoito vastaan ​​erlotinibin resistenttejä syöpää kohdistamalla (alas säätelevä) Atg3 välittämä autophagy ja induktioon apoptoottisen solukuoleman.

Citation: Lee JG, Wu R (2012) yhdistelmä Erlotinibi-Sisplatiini ja Atg3 välittämä Autophagy in Erlotinibi Kestää Lung Cancer. PLoS ONE 7 (10): e48532. doi: 10,1371 /journal.pone.0048532

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 27 syyskuu 2012; Julkaistu: 31 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Lee, Wu. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Jasmine G . Lee oli rahoittaa osaksi National Institutes of Health (NIH) T32 HL07013. Hanke osarahoitteinen NIH apurahoja HL077902 ja HL096373. Kirjoittajat raportoivat ole taloudellisia eturistiriitoja koskeva tutkimus kuten materiaalit ja menetelmät, tai havainnot määritelty tässä asiakirjassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syöpään liittyvien kuolemien ja on yksi alhaisimmista eloonjäämisluvut kaikista syövistä, joiden raportoitu viiden vuoden eloonjääminen 13% [1]. Keuhkosyöpä voidaan karkeasti jakaa kahteen pääryhmään prognostisiin ja hoito tarkoituksiin: pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Kaikista keuhkosyövässä, 85% ovat NSCLC [2] ja on edelleen jakaa kolmeen ryhmään niiden histologista ominaisuudet: okasolusyöpä, suuri karsinooma, ja adenokarsinooma [2] – [4]. NSCLC yleensä vähemmän herkkiä kemoterapiaa kuin SCLC, ja vaikka kirurginen resektio alkuvaiheessa ensisijainen kasvaimia, jopa 50%: lla potilaista osoittaa toistumisen ensisijaisen syöpien [4], [5]. Tämän vuoksi tehokas kemoterapiahoitojen tarvitaan ja ajoittain, systeeminen kemoterapia on ainoa vaihtoehto paikallisesti edennyt kasvaimia ja /tai etäpesäkkeitä.

Platinum perustuu kemoterapeuttiset aineet, kuten

Cis

-diamminedichloroplatinum (II) (sisplatiini) ovat olleet perinteisesti tärkein hoitoon käytetyt aineet NSCLC ja on todettu parantavan potilaan selviytymistä [6]. Kuitenkin sisplatiini kuljettaa merkittäviä myrkyllisiä sivuvaikutuksia, erityisesti suurilla annoksilla, kuten pahoinvointi, oksentelu, munuaisten vajaatoiminta, ototoksisuudesta ja neurotoksisuus johtuu sen ei-solumyrkkyvaikutukset molemmilla syövän ja normaalien solujen [7], [8].

äskettäin on käynnissä kiinnostusta tutkimukseen, kehittämiseen ja tuotantoon syöpälääkkeet että kohdistaa tiettyihin patologinen reittejä, jolloin tällaiset aineet olla vähemmän myrkyllisiä profiilit ja pienempi riski haittavaikutuksia. Yksi tällainen Food and Drug Administration (FDA) hyväksyi ainetta käytetään keuhkoadenokarsinooma on erlotinibi. Erlotinibi on tyrosiinikinaasiestäjä (TKI), joka estää kasvutekijän reseptorin (EGFR) kautta estää kilpailevasti ATP-sitoutumiskohta tyrosiinikinaasidomeeniin [9], ja sen jälkeen vähentää loppupään proliferatiivinen signalointipolkujen [10]. EGFR on liian ilmaistu monissa syövissä, mukaan lukien 40-80% NSCLC [11], [12]. Liittyviä mutaatioita EGFR, kuten mutaatiot johtavat yli-ilmentymisen EGFR, pidetään kriittistä mekanismia kasvaimien synnyn, koska EGFR on mukana useissa sääntelyyn kasvuprosesseihin lukien proliferaatiota, apoptoosin, tarttuvuus, invaasio, ja muuttoliike [2], [10], [13 ]. Erlotinibi on osoitettu olevan tehokas hoito NSCLC kätkeminen EGFR mutaatioita [14]. Kuitenkin noin 10 14 kuukauden kuluttua hoidon aloittamisesta, joissakin keuhkosyövässä kehittää erlotinibi vastus (ER), joka johtaa uusiutumiseen [15], [16]. On ollut muutamia tutkimuksia mekanismeja ja mukana reitit kehittynyt resistenssi TKI, mutta tämä aihe on edelleen kiistanalainen ja melko epäselvä oikeuttavat edelleen selvittää sellaisten mahdollisten resistenssin molekyylimekanismeihin [17].

Autophagy on ollut perinteisesti ymmärretään mekanismi solun proteiinien homeostaasiin ja hajoamista loukkaantuneiden solujen komponenttien ja /tai soluelimiin [18], [19]. Sen tehtävä on kriittinen, koska alentunut autophagy liittyy erilaisiin ihmisen sairauksia kuten syöpää [19], [20]. Autophagy on myös kuvattu, joka toimii ”toinen” reitillä ohjelmoidun solukuoleman (toinen on apoptoosin) ja päinvastoin suojaava mekanismi solujen eheyden [20], [21]. Kuitenkin sen rooli syövän ja syövän kestävyys jää epäselväksi: ei autophagy toimii mekanismi edistää syövän kestävyys tai edistää syöpäsolun kuoleman [22], [23]? Siksi määritetään ja ymmärtää roolia autophagy ER on tärkeää.

Jotta hoidon parantamiseksi NSCLC, on tärkeää ymmärtää molekyylimekanismin taustalla ER ja löytää hoito, jotka ovat tehokkaita hoidettaessa erlotinibi resistenttien syöpien . Näin ollen tässä tutkimuksessa selvitimme tehokkuutta pieniannoksisen erlotinibi-sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito erlotinibin kestävä keuhkoadenokarsinooma ja merkityksen määrittämiseksi autophagy ER. Olemme myös tunnistaa keskeinen sääntelyn proteiini autophagy reitillä, joka kykenee moduloimaan ER.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Cell Culture

erlotinibin herkkä PC9 solulinja , ihmisen keuhkojen adenokarsinooman yliekspressioon EGFR, oli ystävällisesti lahjakas tri Halmos (Columbia University) [24]. Se pidettiin RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja antibiootti-Anti-sieni (Invitrogen, Carlsbad, CA). ERPC9 solulinja perustettiin viljelemällä PC9 soluja 5% FBS elatusaineet sisältävien erlotinibi. Soluja aluksi pide- tään erlotinibin pitoisuutena 33 nM (IC50), ja annosta nostetaan vähitellen ajan 12 viikkoa, kunnes lopullinen konsentraatio erlotinibin oli 10 uM. Sitten, käyttämällä yksisoluiset kloonaustekniikoiden jossa vain aktiivisesti jakautuvia soluja valittiin (osoittaen vastus), ERPC9 solut vahvistettu. Sitten, ERPC9 soluja pidettiin 10% FBS RPMI 1640, joka sisälsi lopullinen perustettu erlotinibin 10 uM.

* Solujen elävyys kvantitoitiin käyttäen Alamar Blue Assay. Kontrolliryhmä toimi standardin solujen elinkelpoisuuden ja solukuolemaa. (EN) ERPC9 soluissa yhdistelmä indusoi huomattavasti enemmän solukuolema kuin yhden lääkehoitoon (p 0,0001). Erlotinibi-alone johti 96,6% eloonjääneitä, sisplatiinia 89,3%, ja yhdistelmä 61,1%; tämä vaikutus oli synergistinen (CI 0,12). (B) Kun vanhempien PC9 solujen yhdistelmä indusoi huomattavasti enemmän solukuolema kuin yhden lääkehoitoon (p 0,0001) erlotinibille-alone johti 79,6% eloonjääneitä, sisplatiini 76,1%, ja yhdistelmä 49,6%; tämä vaikutus oli synergistinen (CI 0,45). (C) In NHBE soluissa, erlotinibi yksin, sisplatiinia yksinään, ja yhdistelmä hoito osoittivat minimaalista solukuoleman tai muutos elinkelpoisuutta joukossa neljään ryhmään (p = 0,958), mikä osoittaa vähäistä myrkyllisyyttä yhdistelmähoidon.

Normal ihmisen keuhkoputken epiteelikudoksissa saatiin National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA) [25] – [27]. Kudokset ei kerätty potilailta diagnosoitu keuhkosairauksia. Proteaasi-liukenevat keuhkoputken epiteelisolujen maljattiin transwell kammioiden (Corning; 24 mm) 5 x 10

4 solua /cm

2 keuhkoputken epiteelin kasvualustaan ​​(Lonza). 4-7 päivän kuluttua vedenalaiseen viljelyolosuhdetta tai kun viljelmät saavuttivat konfluenssin, solut siirrettiin ilma-neste rajapinta (ALI) kulttuuri ehto on Hamin F12 /DMEM (01:01), johon on lisätty seuraavat kahdeksan tekijät: transferriiniä (5 ug /ml), insuliinia (4 ug /ml), koleratoksiinia (20 ng /ml), epidermaalista kasvutekijää (10 ng /ml), deksametasonia (0,1 uM), naudan hypotalamuksesta uutetta (15 ug /ml) BSA (0,5 mg /ml), ja all

trans

retinoiinihappo (30 nM), mikä helpotti polarisaatio ja mucociliary erilaistumista. NHBE-soluja viljeltiin 7 päivää siirron jälkeen ja ALI. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO 2.

* (A) Autophagy tasot arvioitiin western blot varten LC3II ja p62. (B) ERPC9 solut oli merkittävästi korkeampi LC3II kuin PC9 solujen (p = 0,030) ja merkittävästi alempia p62 kuin PC9 soluissa (p 0,0001); mikä osoittaa korkeampi lähtötilanteessa autophagy tasot erlotinibin vastus soluissa. Yhtäpitävästi, voidaan nähdä, että on olemassa huomattavasti vähemmän LC3I in ERPC9 soluissa verrattuna PC9 solujen (p = 0,008).

Drugs: IC50-arvot ja hoito ryhmät

sisplatiini , rapamysiini ja 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), ja erlotinibin ostettiin Selleck Chemicals (Huston, TX, USA). 3-MA liuotettiin veteen, ja kaikki muut lääkkeet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), jolloin muodostuu varastossa sisplatiinin 10 mM, erlotinibi 10 uM, rapamysiini 27,4 mM, ja 3-MA 100 mM. 3-MA valmistettiin tuoreena joka kerta ja muiden huumeiden pidettiin -20 ° C: ssa ja kaikki laimennettiin sopivaan konsentraatioon ennen käyttöä. Hoidon pituus kaikissa kokeissa koostui kaksi päivää. Solut ensin päällystetty ja viljeltiin 10% FBS RPMI 1640 median 24 tuntia ennen hoidon aloittamista, jotta solujen kiinnittyä levyyn. Seuraavana päivänä elatusaine korvattiin 0,1% FBS: RPMI 1640, joka sisältää sopivia lääkeainepitoisuudet kaksi päivää. Määritettäessä IC-arvot, 96-kuoppaisia ​​levyjä käytettiin, ja annosvasteet suoritettiin käyttämällä herkkien PC9 solujen käsittelemällä solut järjestysnumero eri lääkeainepitoisuuksien kullekin lääkkeelle (erlotinibi tai sisplatiini). Virallinen hoitoryhmissä koostui 2 x 2 factorial kokeellinen suunnittelu [28]: kontrolli (0,1% DMSO), erlotinibi (10 nM), sisplatiinia (3 uM), ja yhdistelmä erlotinibin ja sisplatiinin (10 nM + 3 uM). Virallinen lääkehoitojen suoritettiin 6-kuoppaisille levyille. Sekä PC9 ja ERPC9 solulinjat tehtiin lääkehoitoon. Kokeet velvoitetaan käyttämään rapamysiinin ja 3-MA koki samaa protokollaa.

* Autophagy mitattiin kautta Western blot varten LC3II. (A C) Vuonna ERPC9 soluissa, oli merkittävä väheneminen LC3II yhdistelmähoidon verrattuna muihin ryhmiin (p = 0,011). Lasku LC3II oli synergistinen yhdistelmähoidon, peilaus sama synergistinen suuntaus solukuolemaan. (B) ei ollut merkittäviä eroja LC3II tasoilla NHBE soluissa (p = 0,958). (D) Huomattavasti suurempi LC3II (vihreä) fluoresenssi havaittiin ERPC9 soluissa verrattuna PC9 soluihin (p 0,0001). Vuonna ERPC9 solut, jotka kävivät yhdistelmä hoito, merkittävä lasku vihreän fluoresenssin nähtiin verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin (p 0,0001). Vihreä = LC3 ja sininen = DAPI.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elävyys kvantitoitiin käyttäen Alamar Blue Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Toteuduttua lääkehoidon, alkuperäinen media korvattiin jotka sisälsivät 10% Alamar Blue väriaine ja inkuboitiin 1 h 37 ° C kostutetussa inkubaattorissa 5% CO2. Solujen elinkelpoisuus ja kuolema mitattiin sitten 530 nm: n virityksellä aallonpituudella ja 590 nm: n emissio käyttäen Packard fluorocount. Suhde solujen elinkykyisyys laskettiin yhtälöllä seuraavasti: (absorbanssi hoitoryhmässä) /(absorbanssi kontrolliryhmässä) x 100.

* Rapamysiini ja 3-MA arviointiin käytettiin rooli autophagy ja sen yhdessä erlotinibin vastarintaa. Sopivat ryhmät hoidettiin joko (A) 10 nM rapamysiiniä tai (B) 5 uM 3-MA yhdistelmällä lääkehoitoa. Vuonna ERPC9 solut, solujen eloonjääminen lisääntyi 16,5%, kun rapamysiiniä lisättiin yhdistelmä hoitoon (p = 0,004). Verrattuna 3-MA käsiteltyjen ERPC9 soluja, oli 10,5%: n lasku solujen selviytymistä yhdessä hoitoryhmässä ja 9,1% lasku 3-MA yhdistelmähoidon (p = 0,032 ja p = 0,037, tässä järjestyksessä). (C) Kun 3-MA lisättiin erlotinibille-alone (p 0,0001) ja sisplatiini-alone (p 0,0001) käsittely oli 39,2% ja 31,0% suurempi solukuolema, vastaavasti, verrattuna hoitoon yhdellä pelkkään lääkehoitoon .

Western blot -analyysi

Solut hajotettiin jääkylmässä RIPA-puskuria (Millipore, Billerica, MA), joka sisältää yhdistelmän proteaasi-inhibiittorin ja fosfataasinestäjällä cocktailit (Sigma-Aldrich) . Lysated proteiinit sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 14000 rpm 4 ° C: ssa, ja supernatantit määrällisesti proteiinipitoisuus käyttäen Bio-Rad DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA), ja spektrofotometriä mitattuna 650 nM. Sitten proteiinit erotetaan 4~20% gradientti SDS /PAGE-geelillä (Thermo Fisher Scientific, Newington, NH) ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) (Bio-Rad). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 0,05% Tween 20: tä (TBST) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT), ja sen jälkeen tutkittiin anti-p62 (1:1000, Millipore) , -LC3, -Beclin 1, -P-Akt, -Akt, p-mTOR, -mTOR, -Atg3, -Atg7, -Atg5-12 monimutkainen (1:1000, Soluviestintä, Boston, MA), un-lohkaista ja -cleaved Caspase 3, un-halkaistut -cleaved PARP (1:500, Soluviestintä), 2,5% rasvatonta maitoa TBST yön yli 4 ° C: ssa. Sitten kalvot pestiin 30 minuuttia (x3) TBST: llä, ja koettimena piparjuuren peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:2000, Cell signalointi) 2,5% rasvatonta maitoa TBST 1 tunnin ajan RT: ssä. Jotta voidaan määrittää yhtä suuri kuin lastaus- ja yhtenäistää proteiinin määrä ladattu, jälkeen blotit stripattiin ja uudelleen blotattiin hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini (Sigma-Aldrich), ja suhde kaistan intensiteetti (koko x tiheys) mielenkiinnon siihen liittyvän β-aktiini otettiin. Bändit oli kuvattu käyttäen Fuji 4000 ohjelmiston kautta tai elokuva.

* (A) Western blot p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin-1, Atg5-12, Atg7, ja Atg3 näkyvät . (B) oli merkittävästi korkeampi Atg3 tasot ERPC9 soluissa verrattuna PC9 solujen (p = 0,018) ja (C) huomattavasti pienempi p-mTOR tasolla (p = 0,021) lisäksi validointi, että autophagy tasot ovat korkeampia ERPC9 soluissa.

Knock Down of Atg3 siRNA transfektio

sirna (siRNA) erityisesti suunnattu ihmisen Atg3 saatiin Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA). ERPC9 ja PC9 solut maljattiin 12-kuoppalevyille (6 x 10

4 solua kuoppaa kohti) ja transfektoitu Atg3 siRNA 24 tuntia antibiootin vapaa kasvualustojen; käyttämällä siRNA Lipofectamine RNAiMAX ja OPTI-MEM I-vähennetty seerumiväliaineessa (Invitrogen). Toimenpiteet suoritettiin seuraavat valmistajan protokollaa.

* (A) p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin 1, Atg5-12, Atg7, ja Atg3 mitattiin kautta western blot-analyysi. (B) kanssa erlotinibille-sisplatiiniyhdistelmähoidon hoidon, oli merkittävä muutos vain Atg3; Atg3 taso oli merkittävästi vähentynyt verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin (p = 0,028). Tämä viittaa siihen, että yhdistelmähoito voi kohdistaa perustason yliekspressio Atg3 on ERPC9 soluissa.

Immunosytokemia

Solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut pestään uudelleen kahdesti PBS: llä, inkuboitiin PBS: ssä, joka sisälsi 0,2% Trinol X 5 min huoneenlämpötilassa, ja pysäytettiin estopuskurilla (PBS, jossa on 3% BSA) 5 minuutin ajan RT: ssä. Soluja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen, anti-LC3 (1:200, Cell signalointi) yön yli 4 ° C: ssa pimeässä huoneessa, pestään 3 kertaa seuraavana päivänä, ja inkuboitiin vuohen anti-kani-IgG Alexa Jauhot 488-vasta-ainetta (1:1000 , Invitrogen) 1 tunnin ajan RT: ssä pimeässä huoneessa. Sitten solut pestiin PBS: llä ja 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (Dapi, Vector laboratories, Burlingame, CA) lisättiin värjää tumat. Zeiss LSM700 confocal (Carl Zeiss, Saksa) käytettiin kaapata kuvia, ja kaikki kuvat oli otettu sama asetus toiminnan johdonmukaisuuden. Kuva-analyysi tehtiin sokkona.

* (A) Esto Atg3 käännös ja autophagy kanssa Atg3 siRNA transfektion ERPC9 soluissa varmistettiin western blot-analyysi. (B) Kun ERPC9 solut transfektoitiin Atg3 siRNA, solut tuli huomattavasti herkempiä erlotinibi (p = 0,043) ja yhdistelmä (p = 0,002) lääkehoitoon verrattuna ERPC9 solujen ei-spesifisiä siRNA transfektiota. Ei ollut merkittävää eroa sisplatiinin käsiteltyjen näytteiden, kuitenkin, (p = 0,924). (C) Atg3 siRNA transfektion pystyi tuottamaan merkittävän kasvun herkkyyttä yhden lääkehoitojen vanhempien PC9 solulinjan samoin.

Farmakologiset ja Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi ja todetaan huomattavia eroja ryhmien tehtiin käyttämällä kaksisuuntaisella Studentin t-testi ja varianssianalyysi (ANOVA) tarvittaessa. Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä prisman ohjelmisto (La Jolla, CA). P-arvo on alle 0,05 katsottiin merkitseväksi tässä tutkimuksessa. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa itsenäisesti.

* Apoptoosi mitattiin western blot lohkaistun kaspaasi 3 ja pilkottiin PARP. (A 0,0001 ja p = 0,0004, vastaavasti).

Lisäksi Chou-Talalayn menetelmän [29] käytettiin saamiseksi yhdistelmä indeksi (CI) arvioida ja synergian, additiivisten tai antagonismi yhdistelmähoito erlotinibin ja sisplatiinin (erittäin epätehokkaalla, epätehokkaalla, kohtalainen synergismiksi vähäinen synergia, lisäaine, ja antagonismi määriteltiin CI 0,3, 0,3 CI 0,7, 0,7 CI 0,85, 0,85 CI 1, CI = 1, ja CI 1, vastaavasti).

tulokset

IC50 arvot PC9 ja ERPC9 Cells

estävä pitoisuus (IC) 50 arvoja erlotinibin ja sisplatiinin luomisen jälkeen vuonna PC9 soluissa ennen vaikutusten tutkimisesta yhdistämällä kaksi ainetta yhdistelmänä hoito erlotinibin resistenttejä PC9 (ERPC9) soluja. Määritetyt IC50 erlotinibi oli 33 nM PC9 soluissa ja 878 nM ERPC9 soluissa (noin 26 kertaa suurempi kuin PC9 soluissa) (tuloksia ei ole esitetty); Tämä vahvistaa, että ERPC9 solut perustettiin siten, että sallitaan se tulee vastustuskykyisiä ja mahdollisesti matkivat mitä nähdään kliinisesti. Sisplatiini IC50 oli 18 uM PC9 soluissa ja 40 uM ERPC9 soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Koska sisplatiini IC 50 ei noussut merkittävästi, tämä tukee edelleen, että ERPC9 solut osoittivat ominaisvastus erlotinibille.

Erlotinibi-sisplatiinin yhdistelmän käyttöä ERPC9, PC9, ja normaaleihin ihmisen Keuhkoputken epiteelisolujen

Kuva 1A ja kuvio 1B esittävät prosenttiosuutta ERPC9 ja PC9 solujen selviytymistä joille on tehty kahden päivän lääkehoitoon. Kun soluja käsiteltiin erlotinibin-sisplatiiniyhdistelmähoidon, 61,1% ja ERPC9 soluista säilyi; tämä on huomattavasti pienempi verrattuna soluihin käsitelty erlotinibin-alone (96,6%) ja sisplatiini-alone (89,3%). Toisin sanoen, yhdistelmähoito tappoi huomattavasti suurempi määrä soluja (38,9%) verrattuna erlotinibille-alone (0,4%, p = 0,001), sisplatiini-alone (10,7%, p = 0,0002) ja ohjaamaan muita kuin käsiteltyjen solujen (0,0 %, p 0,0001). Lisäksi yhdistelmä indusoi voimakkaan synergistisen solukuoleman huolimatta ERPC9 solujen vastustuskyky erlotinibille (CI = 0,12 laskettuna kautta Chou-Talalayn menetelmä [29]). Samanlainen suuntaus synergistinen solukuolemaa havaittiin vanhempien PC9 solujen yhdistelmällä erlotinibin-sisplatiinihoitoon; solujen selviytymisen jälkeen erlotinibi-alone hoito oli 79,6%, sisplatiini oli 76,1%, ja yhdistelmä oli 49,6% (p 0,0001) (CI = 0,45). Nämä havainnot viittaavat siihen, että lisäys sisplatiinin erlotinibille voi olla tehokas hoito tappamaan erlotinibin kestävä keuhkosyöpäsoluissa pieninäkin annoksina käytettyinä yhdistelmänä.

Normaalit ihmisen keuhkoputken epiteelin (NHBE) soluja käytettiin arvioimaan myrkyllisyyttä erlotinibin-sisplatiiniyhdistelmähoidon hoitoa. Kahden päivän hoito erlotinibin-alone, sisplatiini-yksin, ja erlotinibi-sisplatiiniyhdistelmähoidon osoitti minimaalinen solukuoleman eikä merkittäviä eroja solukuoleman ja elinkelpoisuuden joukossa neljään ryhmään (p = 0,958), mikä osoittaa turvallinen terapeuttinen indeksi nykyisen annostelun ei-syöpäsolujen (kuvio 1 C).

Perustaso Autophagy tasot ERPC9 solut

Autophagy rooli syövän on kiistanalainen ja ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti [30]. Tutkia autophagy rooli ER, vertailun lähtötasolle of autophagy välillä ERPC9 ja PC9 solut mitattiin western blot-analyysi LC3II [31] ja P62. Kuten kuviossa 2 on esitetty, LC3II tasot olivat merkittävästi korkeampia ERPC9 soluissa verrattuna PC9 solujen (p = 0,030). Lisäksi p62-tasot olivat huomattavasti matalammat ERPC9 soluja kuin PC9 solut (p 0,0001). Molemmat tulokset viittaavat siihen, että ERPC9 solut satama lähtötilanteessa korkeampi autophagy tasolla kuin erlotinibin herkkä PC9 soluja.

Yhdistelmä Erlotinibi-sisplatiinihoitoon ja LC3II

lisätutkimukset yhdistelmän käyttöä ERPC9 soluissa paljasti huomattavasti vähemmän ja LC3II verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmiin, kuten nähdään kuviossa 3A ja 3C (p = 0,011). Väheneminen LC3II tasoilla western blot analyysi oli synergistinen, peilaus sama synergistinen suuntaus nähdään solukuoleman yhdistelmähoidon. Tämä viittaa siihen, että autophagy voi olla liittyvä mekanismi ER, ja erlotinibi-sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito voi toimia kohdistamalla autophagy. Mielenkiintoista kyllä, ei ollut merkittäviä muutoksia LC3II vuonna NHBE soluissa (kuvio 3B).

Samat muutokset LC3II myös visualisoitu immunofluoresenssilla (kuvio 3D). Oli merkittävä väheneminen LC3II fluoresenssin erlotinibin-sisplatiiniyhdistelmähoidon käsitellyissä soluissa verrattuna muihin hoitoryhmiin (p 0,0001).

modulaatio Autophagy Alters Herkkyys Hoito

Sen määrittämiseksi onko autophagy on olennainen selviytymismekanismi taustalla ER, autophagy indusoiva aine, rapamysiini, ja estävää ainetta, 3-MA, käytettiin. Jos autophagy tehtävänä on edistää kestävyys ja selviytymistä vastaan ​​hoito, on odotettavissa, että ne lisäävät solun selviytymisen induktion autophagy ja keskustella vähentää solujen eloonjääminen autophagy estyy kun niitä yhdistelmähoito. Hypoteesin, kuten kuvassa 4A, rapamysiinin erlotinibi-sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito verrokkeja useammin solujen selviytymisen ja kannattavuuden (16,5%) verrattuna soluihin, jotka saivat erlotinibia-sisplatiiniyhdistelmähoidon ilman rapamysiini (p = 0,0004). Käänteisesti, kun 3-MA lisättiin erlotinibin-sisplatiiniyhdistelmähoidon, solujen eloonjääminen oli merkitsevästi pienempi (9,1%) verrattuna soluihin käsiteltiin vain erlotinibin-sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito yksinään (p = 0,037) (kuvio 4B). Lisäksi yhdistelmä 3-MA, erlotinibi ja sisplatiinin pystyi tappamaan merkittävästi enemmän soluja kuin 3-MA yksinään (44,6% ja 34,1% solukuolema, vastaavasti) (p = 0,032). Kuten kuviossa 4B on osoitettu, että estämällä autophagy 3-MA pystyi herkistää soluja yhdistelmähoito, kuvio 4C esittää tuloksia 3-MA käsiteltiin ERPC9 solujen erlotinibin-alone ja sisplatiinin yksin. Kun 3-MA lisättiin erlotinibille-alone (p 0,0001) ja sisplatiini-alone (p 0,0001) käsittely oli 39,2% ja 31,0% suurempi solukuolema, vastaavasti, verrattuna hoitoon yhdellä huumehoidon ilman 3-MA . Nämä liittyvät havainnot tukevat edelleen, että autophagy voi olla suojaava mekanismi mahdollistaa suuremman selviytymistä ERPC9 soluissa.

Atg3 ja p-mTOR in ERPC9 Solut

Kuvio 5 esittää tulokset western blot-analyysi avaimen sääntelyn proteiinit autophagy polku: p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin-1, Atg5-12 monimutkainen, Atg7 ja Atg3. Ei ollut merkittäviä eroja p-Akt, Akt, mTOR, Beclin-1, Atg5-12 monimutkainen, ja Atg7 välillä ERPC9 ja PC9 soluja (kuvio 5A). Kuitenkin lähtötilanteessa, p-mTOR oli merkitsevästi pienempi ERPC9 soluissa verrattuna PC9 soluihin (p = 0,021) (kuvio 5C). Lisäksi, oli merkittävästi korkeampi lähtötasolla Atg3 in ERPC9 soluissa verrattuna PC9 solujen (p = 0,018) (kuvio 5B). Yksi tärkeimmistä tehtävistä Atg3 on muuntaa LC3I on LC3II edistää autophagy [32] ja sen mukaisesti oli merkittävästi alhaisempi LC3I vuonna ERPC9 soluja kuin PC9 soluja (lisää LC3I muutettiin) (p = 0,008) (kuvio 2A) . Alemmalla tasolla p-mTOR edelleen tukee havainto korkeampien pohjapinta tasoilla autophagy in ERPC9 soluissa. Vaikka ylimääräinen korkea Atg3 voi edustaa kriittinen osa annetaan ja edistää korkeamman pohjapinta tasoilla autophagy ja edistäminen ER.

Yhdistelmä hoitotavoitteita Atg3

Jotta edelleen arvioida miten yhdistelmä hoitoon down-regulation autophagy erityisesti ERPC9 soluissa, western blot-analyysi muutosten sääntelyn autophagy proteiinien suoritettiin. Kuten kuviossa 6A, ei ollut merkittäviä muutoksia p-Akt, Akt, mTOR, p-mTOR, Beclin-1, Atg5-12 monimutkainen, ja Atg7 usein kaikissa hoitoryhmissä. Oli kuitenkin huomattavasti alhaisempi Atg3 hoidetuilla erlotinibin-sisplatiiniyhdistelmähoidon verrattuna peruskontrolli- tasolla (p = 0,005) (kuvio 6B). Tämä havainto voi ehdottaa, että erlotinibin-sisplatiiniyhdistelmähoidon hoito saattaa jotenkin kohdistaa yli-ilmentyminen tai käännös Atg3 nähdään ERPC9 soluissa. Lisäksi nämä havainnot tukevat joka Atg3 on kriittinen osa annetaan ER ja selviytymistä.

siRNA esto Atg3 Kääntää Erlotinibi Resistance

tutkimiseksi edelleen roolin korkea lähtötasolle of Atg3 nähty in ERPC9 soluissa, ERPC9 soluja transfektoitiin Atg3 siRNA ja hoitaa asianmukaisesti. siRNA transfektio oli onnistunut estämään Atg3 käännös ja autophagy aktiivisuus (asiamiehet matala LC3II ja korkean p62 tasot suhteellisen soluja ilman Atg3 siRNA) kuten kuvassa 7A. Ei ollut mitään merkittävää eroa solujen eloonjääminen kontrolliryhmässä ja ERPC9 transfektoitujen solujen epäspesifisiä siRNA (NS siRNA) verrattuna ERPC9 soluja ilman transfektiota (p = 0,445). Kuitenkin Atg3 siRNA transfektion ERPC9 solut uudelleen herkistyneet erlotinibille-alone hoitoa ja oli siihen liittyvä merkittävä kasvu solukuolema 32,0% verrattuna erlotinibille-alone käsiteltyjen ERPC9 solujen NS siRNA transfektiolla (p = 0,043). ERPC9 solut tuli huomattavasti herkempiä yhdistelmähoidon jälkeen Atg3 siRNA transfektion verrattuna NS siRNA transfektoitujen solujen; 10,3% enemmän solukuolemaa ei havaittu (p = 0,002) (kuvio 7B). Kuitenkin tämä ilmiö ei todettu sisplatiinin käsiteltiin ERPC9 transfektoitujen solujen Atg3 siRNA; ei ollut merkittävää eroa sisplatiinilla käsitelty Atg3 siRNA ja NS siRNA (70,2% vs. 70,8%, tässä järjestyksessä) (p = 0,924). Nämä tiedot viittaavat siihen ja tukee että perustason säätely ylöspäin Atg3 on kiinteästi mukana ER ja solujen eloonjäämistä ja estämällä kääntäminen Atg3 in ERPC9 soluissa pystyy vaihtamaan ER ja antaa uudelleen herkkyys erlotinibille hoitoja. Lisäksi estää Atg3 ei anneta kasvu herkkä sisplatiinin lääkehoitoa, mikä viittaa siihen, että inhibitio Atg3 on spesifinen ER.

Atg3 siRNA transfektion pystyi tuottamaan merkittävän kasvun herkkyyttä yhdessä hoitoja vanhempien PC9 solulinjassa. Erlotinibin kanssa Atg3 siRNA kykeni indusoimaan 11,5% enemmän solukuolemaa verrattuna NS siRNA erlotinibi hoitoon (p 0,0001) ja sisplatiinin kanssa Atg3 siRNA pystyi indusoimaan 9,7% enemmän solukuolemaa verrattuna NS siRNA sisplatiinihoitoon (p 0,0001). Ero solukuoleman välillä yhdistettynä käsiteltyjen solujen Atg3 siRNA verrattuna yhdistelmä hoidon NS siRNA oli pieni (4,5%); vaikka tämä ero oli merkitsevä (p = 0,002).

Apoptosis

Apoptoosi mitattiin western blot-analyysi pilkotun kaspaasi 3 ja halkaistut PARP. Oli huomattavasti vähemmän katkaistun PARP (p = 0,004), ja pilkottiin kaspaasi 3 (p 0,0001) in ERPC9 soluissa verrattuna PC9 soluihin (kuvio 8B ja 8C, vastaavasti).