Krooninen sairaus

tiivistelmä

kofeiinihappoa fenetyyliesteri (KAP) käsittely tukahdutetaan leviämisen, pesäkkeiden muodostumista, ja solusyklin etenemisen PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. KAP vähentynyt proteiinin ilmentyminen sykliini D1, sykliini E, SKP2, c-Myc, Akt1, Akt2, Akt3, yhteensä Akt, mTOR, Bcl-2, Rb, sekä fosforylaation Rb, ERK1 /2, Akt, mTOR, GSK3α , GSK3p, PDK1; mutta lisääntynyt proteiinin ilmentymistä KLF6 ja p21

CIP1. Microarray-analyysi osoitti, että reittejä mukana solujen liikkumista, solukuoleman, lisääntymistä, ja solusyklin vaikuttivat CAPE. Co-hoito Cape kemoterapeuttisten lääkkeiden vinblastiini, Paclitaxol, ja estramustiinista osoitti synergistisen dutusvaikutus. CAPE hallinto voi toimia mahdollisena adjuvanttiterapiana eturauhassyöpään.

Citation: Lin HP, Jiang SS, Chuu CP (2012) kofeiinihappoa fenetyyliesteri Syyt p21

CIP1 induktio, Akt Signaling Reduction, ja kasvu esto in PC-3 Human syöpäsolujen. PLoS ONE 7 (2): e31286. doi: 10,1371 /journal.pone.0031286

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 elokuu 2011; Hyväksytty: 05 tammikuu 2012; Julkaistu: 07 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CS-100-PP-12 (National Health Research Institutes) ja NSC 99-2320-B-400-015-MY3 (National Science Council, NSC) Taiwan CPC, sekä DOH100-TD-C- 111-014 (Department of Health) varten SSJ ja CPC. Kiitämme tukea Protein Chemistry Core Facility Core Instrument Center NHRI ja Taiwanissa bioinformatiikan instituutin Core Facility National Core Facility Program for Biotechnology NSC (NSC100-2319-B-400-001). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmistä ei-ihon karsinooma miesten länsimaissa. Yli 80% potilaista kuoli eturauhassyöpään kehitetty luun etäpesäkkeitä [1] – [3]. Vuonna 1941 Charles Huggins huomasi, että riisto androgeenin aiheuttamien regression hormonin vastanneilla metastaattinen eturauhassyöpä [4]. Sittemmin androgeeniablaatio hoito on tullut ensisijainen hoito metastaattisen eturauhassyövän. Kuitenkin useimmat saavat eturauhassyöpäpotilaat androgeeniablaatio hoito lopulta kehittää toistuvia, kastraatio vastustuskykyisten kasvainten kuluessa 12-33 kuukautta hoidon jälkeen. Keskimääräinen eloonjäämisaika 1-2 vuotta kasvaimen uusiutumisen [5], [6]. Kemoterapia yleensä haetaan metastaattisen hormonia tulenkestävä eturauhassyöpä [7].

Yleisesti käytetty kemoterapiaa huumeita metastasoituneen eturauhassyövän sisältävät eoposide, Paclitaxol, vinblastiini, mitoksantroni, ja estramustiini. Etoposide ja mitoksantronilla ovat tyypin II topoisomeraasiestäjä [7], [8]. Estramustiini on johdannainen estrogeenin kanssa typpisinappi-karbamaatti esteriosan [7]. Vinblastiini sitoo tubuliinia ja estää kokoonpano mikrotubulusten [7]. Paklitakseli häiritsee sukkularihmaston kokoonpano, kromosomi erottelu, ja solunjakautumisen. Paklitakseli myös stabiloi mikrotubulusten polymeerin ja siten suojaa sitä purkaminen [7]. Hoito näillä kemoterapiaa huumeiden laski prostataspesifisen antigeenin (PSA) ja radiologisesti vasteen sekä parantaa kipua ja virtsateiden oireita sub-potilasryhmässä. Kuitenkin ne osoittivat vain vähän vaikutusta pitkittää selviytymistä. Toivottuja sivuvaikutuksia näistä kemoterapeuttisista aineista ovat myrkyllisiä kuolemia, aivohalvauksia, tromboosi, neutropenia, turvotus, hengenahdistus, pahoinvointi, väsymys [7]. Co-hoito kemoterapiaa huumeiden luonnon yhdisteiden kanssa syövän vastaisen aktiivisuuden voi vähentää annosta kemoterapiaa huumeita tarvitaan.

kofeiinihappoa fenetyyliesteri (CAPE), bioaktiivinen komponentti uutetaan mehiläisen pesää propolis, on vahva antioksidantti [9] , [10]. CAPE hoito rinta-, eturauhas-, ja leukemiasoluja syöpäsoluja aiheuttaa NF-KB: n aktiivisuuden [11], [12], induktio Bax [11], [13], aktivointi c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) [ ,,,0],11] ja p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (p38 MAPK) [11]. CAPE indusoi apoptoosin aktivoimalla kaspaasiaktiivisuus [11], [13] ja alas-säätely Bcl-2, CIAP-1, CIAP-2, ja XIAP [12], [13] ja rinta-, eturauhas-, ja leukemiasoluja syöpäsolujen . Lisäksi CAPE aiheuttaa solusyklin pysähtymisen läpi tukahduttaminen sykliini D1 [14], [15], sykliini E [14], ja c-Myc ilmaisun [15], sekä kasvattaa ilmentymisen sykliiniriippuvaiset estäjät p21

CIP1 [14], p27

Kip1 [14], ja p16

INK4a [14] paksusuolen ja gliooma syöpäsolujen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että KAP on potentiaalinen terapeuttinen aine syöpiä.

PC-3 on yksi yleisimmin käytetty eturauhassyövän solulinjoissa perustetaan luusta peräisin etäpesäkkeitä. PC-3-solut eivät ilmennä androgeenireseptorin (AR) [16]. Mitoksantroni, estramustiini, vinblastiini, etoposidi, ja paklitakselin on osoitettu indusoivan proliferaatiota inhibitio, apoptoosi, ja solusyklin pysähtymisen PC-3-solujen

in vitro

[17] – [21], samoin kuin hidastamaan PC-3 ksenograftien kasvua kateenkorvattomissa nude-hiirissä [8], [21], [22]. Hoidon 88-176 uM KAP indusoiman apoptoosin PC-3-soluja estämällä NF-KB: n, CIAP-1, CIAP-2, ja XIAP [12]. Kuitenkin saavutettavissa olevaa CAPE ihmisen seerumissa on noin 5,0 mikrog /ml (17 pM) [23]. Meillä on siis tutkittava jos alhainen pitoisuus (0-20 uM) CAPE voi estää leviämisen PC-3-solut. Olemme myös päättäneet, jos yhteistyössä hoitoon kemoterapiaa huumeita Kap osoittavat synergististä inhibitiota vaikutuksen leviämisen PC-3-solut.

Tulokset

CAPE hoito estää leviämisen ja pesäkkeiden muodostumista PC-3-solujen

trypaanisini värjäys osoitti, että CAPE annosriippuvaisesti esti leviämisen PC-3-solujen EY

50 noin 20,4 uM (Fig. 1A). Hoescht väripohjaisilla 96 kuopan lisääntymisen määrityksessä osoitti, että kasvua estävää vaikutusta CAPE tapahtunut 24 tunnin kuluessa Kap hoitoa konsentraatio oli niin alhainen kuin 2,5 uM (Fig. 1 B). EY

50 kasvun inhibitioon PC-3-soluissa oli 51,4 uM, 30,7 uM, ja 23,1 uM 24, 48, ja 72 h KAP hoitoa, vastaavasti, mikä osoittaa, että estävä vaikutus ja KAP voidaan kerätä. Pesäkemuodostusta paljasti, että hoito 10 uM ja 20 uM KAP tehokkaasti inhiboi PC-3 pesäkkeitä pehmeässä agarissa (Fig. 1 C).

leviämisen PC-3 käsitelty solu konsentraation kasvaessa viitta määräytyy trypaanisini värjäyksen jälkeen 72 h hoidon (A) tai mittaamalla DNA: n kokonaismäärä per kuoppa käyttämällä Hoechst 33258 fluoresenssia 96-proliferaatioanalyysi jälkeen 24, 48 ja 72 h hoito (B). Suhteellinen solujen määrä normalisoitiin solujen keskimääräinen lukumäärä kontrolli (ei KAP käsittely) kunkin solulinjan kussakin kokeessa. Pylväät edustavat keskiarvoa 18 rinnakkaista; palkit kuvaavat keskihajontaa. Tähdellä (*) tarkoittaa solujen määrä on tilastollisesti merkittävästi erilainen (

p

0,05) verrattuna kontrolliin. Pylväät edustavat keskiarvoa 5 biologisten rinnakkaista; palkit kuvaavat keskihajontaa. (C) Anticancer vaikutus KAP määritettiin pesäkemuodostusta PC-3-solut, joita käsiteltiin 0, 10, 20 uM 14 päivää. Kuva on edustava seurausta kolmen biologisen rinnakkaisnäytettä.

Koska CAPE on aikaisemmin raportoitu NF-KB-inhibiittori [10], päätimme onko alhainen dasage CAPE voi estää NF-KB-aktiivisuus käyttämällä plasmidia -pohjainen lusiferaasireportterigeenin määritys. Vaikka CAPE käsittely 40 uM inhiboi NF-KB: n aktiivisuuden, hoidon CAPE pitoisuus- pienempi kuin 40 uM ei ollut vaikutusta NF-KB-aktiivisuutta (kuvio. 2A). Tämä havainto viittasi siihen, että muut mekanismit ovat vastuussa KAP: n estävä vaikutus alhaisella annoksella.

(A) PC-3-solut transfektoitiin 4X NF-KB-lusiferaasireportteriplasmidi ssa 24 tunnin ajan, käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla Kap vielä 24 h. Suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus määritettiin verrata vaikutusta CAPE NF-KB: n transkriptionaalisen aktiivisuuden. (B) PC-3-soluja käsiteltiin KAP 24, 48 tai 72 h, otettiin talteen ja värjättiin propidiumjodidilla väriaine virtaussytometria-analyysi solusyklin jakeluun. (*) Edustaa tilastollisesti merkitsevää eroa (

p

0,05) kahden soluryhmän vertailtujen.

CAPE hoito häiritsee solusyklin etenemisen

propidiumväriä jodidi (PI) värjäys virtaussytometria-analyysi paljasti, että hoito 10-20 uM KAP laski solupopulaation G1 vaiheeseen ja lisätä solupopulaation sub-G1-vaiheessa 24 tunnin kuluessa PC-3-soluja. Vaikutus oli dramaattinen 72 tunnin seuraavat CAPE hoidon (Fig. 2B-2D). Kuitenkin, anneksiini V: värjäys virtaussytometria analyysi osoitti, että 10-20 uM KAP ei aiheuttanut apoptoosia PC-3-soluja (tietoja ei esitetty). Hoito 20 uM CAPE 72 tunnin johti kasvu solusykliä estävän proteiinien p21

CIP1 ja väheneminen S-vaiheen kinaasi liittyvä proteiini 2 (SKP2), fosforylaatio seriinillä 807/811 on retinoblastooma (Rb), cycin D1 sykliini E, c-Myc, ja fosforylaatiota treoniini 202 /tyrosiini 204 ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi 1/2 (ERK1 /2) (Fig. 3). Ei muutosta p27

Kip1 yhteensä ERK1 /2, tai β-tubuliinia havaittiin. Verrattuna 24 tunnin ja 48 tunnin hoito, 72 h hoito yleensä aiheuttanut enemmän muutoksen ekspressiotaso paitsi sykliini D1. Tämä saattaa selittää suuremman kasvun aiheuttama esto KAP 72 tuntia. Sykliini D1 lisääntyi 24 tunnin ja 48 tunnin hoitoa, mutta laski 72 tunnin jälkeen hoidon.

Proteiinin ilmentyminen c-Myc, sykliini D1, sykliini E, SKP2, phosho-Rb (S807 /811), P27

Kip1, p21

CIP1, ERK1 /2, pERK1 /2 Thr202 /Tyr204, β-tubuliinia, ja β-aktiini PC-3-soluja käsiteltiin 20 uM KAP 24, 48, ja 5, 10, 20 uM CAPE 72 h analysoitiin Western-blottauksella.

CAPE hoito estää runsaus ja aktiivisuus proteiinien AKT-signalointireitistä

Akt näyttelee tärkeä rooli selviytymisen ja leviämisen eturauhasen syöpä soluihin [24]. Meillä on siis määrittää, jos CAPE hoito estää Akt signalointireitin. 72 h kuluttua 20 uM KAP käsittely laski runsaasti koko Akt, Akt1, Akt2, ja Akt3 (kuvio 4). CAPE hoito 24-72 h vähensi fosforylaation Akt seriinin 473 ja treoniinin 308 ,. KAP ei muuttanut yhteensä runsaasti fosfoinositidi riippuvaisen kinaasin 1 (PDK1) (Fig. 4), mutta, fosforylaatio seriinillä 241 PDK1 väheni KAP hoitoon. CAPE hoito aiheutti myös laskua yhteensä nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) ja supistuu hieman fosforylaatio seriinillä 2448 ja 2481 mTOR. KAP hoito ei muutu koko runsaasti GSK3α ja GSK3p (Fig. 4). Kuitenkin phosphosphorylation on GSK3α S21 ja GSK3p S9 lisättiin 24 tunnin jälkeen ja 48 h 20 uM KAP hoitoa, mutta laski 72 h 20 uM CAPE hoitoon (Fig. 4). Bcl-2 on anti-apoptoosin tekijä alavirtaan Akt signalointia. Yliekspressio Bcl-2 on aiemmin raportoitu resistenssi lääkkeelle eturauhassyövissä [5]. KAP hieman vähentynyt ilmentyminen Bcl-2.

Proteiinin ilmentymisen Akt, Akt1, Akt2, Akt3, yhteensä Akt, fosfo-Akt: S473, fosfo-Akt: n T308, mTOR, fosfo-mTOR Ser2448 ja Ser2481, GSK3α, GSK3p, phopho-GSK3α S21, fosfo-GSK3p S9, PDK1, fosfo-PDK1 Ser241, Bcl-2, KLF6, β-tubuliinia, ja β-aktiini PC-3-soluja käsiteltiin 20 uM KAP 24, 48, ja 5 , 10, 20 uM CAPE 72 h analysoitiin Western-blottauksella.

CAPE hoito vaikuttaa säätelevien geenien lisääntymistä, eloonjääntiä, ja kuolema PC-3-solujen

lisäksi tutkineet kattava muutos geenien ilmentyminen PC-3-soluja käsiteltiin 20 uM KAP 24 h tai 72 h microarray. Geenit kanssa ilme kertaluokkamuutos 1,5 ja

P

0,05 katsottiin geenit vaikuttaa merkittävästi CAPE hoitoa. CAPE vaikutti ilmentymistä 69 ainutlaatuisia geenien kuluttua 24 h hoidon (taulukko S1). 53 geenejä säädellään ylöspäin ja 16 geenit alassäädetty. Hoito CAPE 72 tuntia muuttunut ilmentyminen 147 ainutlaatuisia geenejä (taulukko S2). 122 geenejä säädellään ylöspäin samalla kun 25 geeniä alassäädetty. 25 geenit olivat yleisesti muuttuu sekä 24 tunnin ja 72 tunnin hoito (kuvio 5, taulukko S3). Niistä 25 geenit, 3 geenit olivat alassäädetty (CYP1B1, SCG5, PADI4) ja 22 geenien säädelty (LY96, LOC728285, TM4SF19, RGS2, PI3, AKR1C2, GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, RND3, KRT34, HIST2H2AA3, AKR1C4, Klf4, DUSP5, marraskuu, GK, CDKN1A, CXCL2, DUSP1, ja HIST1H4H) (Fig. 5). Analyysi kaikista 191 Geenikoettimia vaikuttaa CAPE hoitoa joko 24 h tai 72 h käyttämällä Ingenuity Pathway Analysis (IPA) paljasti, että CAPE hoito vaikuttaa osallistuvien geenien säätelyyn solukuoleman lisääntymistä, ja selviytymistä. Niistä geenit vaikuttavat Cape hoito, 52 osallistuvat geenit soluproliferaatioon asetuksessa (

p-arvo

= 9.82 x 10

-11), 41 geenit osallistuvat solujen kasvun säätelyssä (

p-arvo

= 1,40 x 10

-10), 68 osallistuvat geenit solukuolemaan asetuksessa (

p-arvo

= 1,40 x 10

-12), ja 27 geenit osallistuvat solujen eloonjäämisen asetuksessa (

p

= 3.43 x 10

-6). Täydellinen geenien koettimia mukana näissä signalointireiteissä esitetty taulukossa S4.

Genes yleisesti vaikuttavat sekä ajankohtina ovat punaisena, kun taas erityisesti kohdistuu joko ajankohtana ovat mustia. IPA analyysi ainutlaatuinen geenien (n = 191) geenien muuttunut joko 24 h tai 72 h KAP kohtelu, ilmaisi ryhmä säätelevien geenien useiden solujen toimintoja, kuten solujen lisääntymisen (p-arvo 9,82 x 10

-11, 52 geenejä ), solujen kasvuun (p-arvo 1,40 x 10

-10, 41 geenejä), solukuolemaa (p-arvo 1,40 x 10

-12, 68 geenejä), ja solujen eloonjääminen (p-arvo 1,40 x 10

-6, 27 geenejä).

validoitu joitakin geenejä vaikuttanut CAPE käsittelemällä kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR). 17 ulos 18 geenien (GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, RND3, Klf4 DUSP5, marraskuu, CDKN1A, CXCL2, DUSP1, KLF6, TOP2A, PPP1R15A, CAV2, S100P, ja GADD45A) testattiin qRT-PCR osoitti samanlaista muutos rakenteessa seuraavat 24 h tai 72 h KAP kohtelun kuin geeni microarray. Ainoa poikkeus on TUBA1A. Emme havainneet mitään muutosta TUBA1A geenin CAPE hoitoa qRT-PCR (Kuva. 6). Western blotting-määritys osoitti, että proteiini taso KLF6 kasvattivat CAPE hoito (Fig. 4).

Geenien ilmentyminen tasolla GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, RND3, Klf4 DUSP5, marraskuu, CDKN1A, CXCL2, DUSP1, KLF6, TOP2A, PPP1R15A, CAV2, S100P, GADD45A, ja TUBA1A PC käsitelty 0 tai 20 uM CAPE 24 h tai 72 h määritettiin qRT-PCR.

Co-hoitoa CAPE kanssa kemoterapeuttisten tukahdutti leviämisen PC-3-solujen

Lopuksi tutkimme mikäli co-hoitoon CAPE seerumin-saatavilla olevalla annoksella (0-20 uM) kanssa yleisesti käytetty kemoterapiaa huumeiden (etoposidi, Paclitaxol, vinblastiini , mitoksantroni, ja estramustiini) voi estää kasvua PC-3-solut tehokkaammin kuin hoidon kemoterapiaa huumeita yksin. EY

50 CAPE, etoposidi, Paclitaxol, vinblastiini, mitoksantroni, ja estramustiini ja proliferaation estossa PC-3-soluissa oli 18,3 uM, 1,7 uM, 3,0 nM, 2,1 nM, 5,9 nM, ja 13,0 uM. Treatment 20 uM CAPE kasvun estyminen PC-3-soluja tehokkaammin kuin hoidon 1,0 uM etoposidin, 2,5 nM Paclitaxol, 5 nM mitoksantroni, 2 nM vinblastiini, tai 10 uM estramustiinin (kuvio 7). Kun co-hoito 20 uM CAPE, 0,5pM etoposidi, 1 nM Paclitaxol, 1 nM vinblastiini, 2,5 nM mitoksantronia, ja 8 uM extramustine aiheutti kasvun estämistä samanlainen korkein annos testasimme (kuva 7). Synergistinen vaikutus tarkoittaa estävä vaikutus kahden lääkkeen hoitoa yhdessä on suurempi kuin summa niiden erilliset estävää vaikutusta samoina annoksina, kun taas antagonistisia vaikutuksia tarkoitetaan estävä vaikutus kahden lääkkeen on pienempi kuin summa vaikutus kahden kemikaalien ottanut erikseen. Määritelmän mukaan, co-hoito CAPE osoitti synergistisen vaikutuksen vinblastiiniin, estramustiinista tai Paclitaxol, ja antagonistinen vaikutus etoposidin tai mitoksantronilla (kuva 7).

leviämisen PC-3-solut käsiteltiin lisäämällä annosta ( 0, 5, 10, 20 uM) KAP yhdessä konsentraation kasvaessa etoposidi (A), Paclitaxol (B), vinblastiini (C), mitoksantroni (D), ja estramustiini (E) 72 tuntia määritettiin 96- hyvin lisääntymisen määritys. Oikeus osa kuvion osoittavat suhde odotettua solujen määrä /havaittujen solujen määrä. Esimerkiksi käsittelemällä 5 uM KAP tai 1 nM vinblastiinin vähentää solujen määrä PC-3-80,9% ja 88,7%, vastaavasti, verrattuna kontrolliin (ei käsittelyä). Odotettu solujen määrä hoidon yhdistäminen 5 uM CAPE ja 1 nM vinblastiinin on 0,809 * 0,887 = 71,8%. Havaittu solujen määrä on 48,8% kontrolliin verrattuna. Joten suhde on 0,718 /0,488 = 1,5. Suhde suurempi kuin yksi edustaa synergiaa kasvun estäminen, kun taas suhde pienempi kuin yksi edustaa antagonistista vaikutusta.

mukaan havaintomme, p21

CIP1 näyttelee tärkeä rooli sääntelyä kasvun eston aiheuttama CAPE hoito . Tämän varmistamiseksi me pudotti p21

CIP1 PC-3 ja määrittää, jos nämä PC-3-solujen entistä vastustuskykyisiä CAPE hoitoon. Kuten odotettua, seuraavat 24 h CAPE hoidon, PC-3-solujen vähemmän p21

CIP1 proteiinin ilmentyminen olivat resistenttejä kasvun estäminen aiheuttamaa CAPE hoito (Fig. 8).

Proteiini tasojen villityypin PC-3, PC-3-solujen transfektoimiseksi, joissa hajotus- ohjaus (20 nM), ja PC-3-soluja transfektoitiin p21

CIP1 siRNA (20 nM) määritettiin Western blotting-määritys. Leviämisen nämä PC-3-solut käsitellään 20 uM CAPE 24 tunnin määritettiin 96-kuoppalevylle lisääntymisen määrityksessä kuvatulla Materiaalit ja menetelmät.

Keskustelu

havainto viittasi että kofeiinihappoa fenetyyliesteri (KAP) voi estää proliferaatiota ja pesäkkeiden muodostuminen PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen pitoisuus 10-20 uM. Nämä havainnot viittaavat siihen, että saavutettavissa olevaa CAPE ihmisen seerumissa, (17 uM) [23], on mahdollisesti aiheuttavan kasvun estäminen eturauhasen kasvaimia potilailla.

sykliiniriippuvaisen estäjä p21

CIP1 sitoutuu ja estää kinaasiaktiivisuudet Cdk2 /sykliini A, Cdk2 /sykliini E, Cdk4 /sykliini D, ja Cdk6 /sykliini D kompleksit [25]. p21

CIP1 olla vuorovaikutuksessa proliferating solun tuma-antigeenin (PCNA), DNA-polymeraasin lisälaite tekijä, ja sillä on säätelevä rooli S-vaiheessa DNA-replikaatioon ja DNA-vaurioiden korjaamiseen [26]. SKP2 kuuluu F-box-proteiinin perheen. SKP2 on yksi neljästä alayksikön ubikitiinipromoottori proteiinin ligaasia monimutkainen kutsutaan SCF (SKP, Cullin, F-laatikko, jossa kompleksi), joka toimii fosforylaatiosta riippuvaisia ​​ubikitinaation. SKP2 on olennainen osa sykliini A-Cdk2- S-vaiheen kinaasi [27]. Väheneminen fosforylaatioon Rb rajoittaa solujen lisääntymistä estämällä E2F toimintaa [28]. ERK1 ja ERK2 osallistuvat valvontaan monia perusteellisia soluprosesseja myös solujen jakautumista, selviytyminen, erilaistuminen, apoptoosi, liikkuvuuteen ja aineenvaihduntaa. ERK1 /2 tärkeä asema kanoninen MAPK (mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi) signalointireitin ja ovat kriittisiä säätelijöitä kasvua ja elossa [29]. CAPE aiheuttama p21

CIP1 ja vähentää sykliini D, sykliini E, SKP2, ja fosforylaatiota Rb ja ERK1 /2 (Fig. 3). KAP voidaan siten tukahduttaa kasvua PC-3-solujen kautta, nämä proteiinit [30].

Akt on seriini /treoniini proteiinikinaasi säätelevä apoptoosin estämiseen ja solujen lisääntymisen stimuloituminen. Up-regulation PI3K /Akt aktiivisuus liittyy huono kliininen tulos eturauhassyövän [31]. On olemassa kolme nisäkkään isoformia tämän entsyymin, Akt1, Akt2, ja Akt3 [32], [33]. Proteiini runsaus ja aktiivisuus Akt3 on aikaisemmin ehdotettu edistää aggressiivisempia kliininen fenotyyppi androgeenireseptorin ei-reagoiva eturauhas- ja rintasyövistä [34]. Akt3 entsyymiaktiivisuus oli noin 20-60 kertaa suurempi AR-negatiivisten PC-3 ja DU-145-soluissa verrattuna AR-positiivisten LNCaP eturauhassyövän solut [34], [35]. Havaitsimme, että KAP tukahdutettu Akt signalointi-sukuiset proteiinit, mukaan lukien Akt1, Akt2, Akt3, yhteensä Akt, mTOR, Bcl-2, Pakt Ser 473, Pakt Thr 308, pmTOR Ser 2448/2481, pGSK3α Ser21, pGSK3β Ser9, ja pPDK1 Ser241 . KAP raportoitiin äskettäin tukahduttaa fosforylaation Akt muihin ihmisen soluihin, kuten CD4 + T-solujen [36], sepelvaltimon sileälihassolujen [37], ja A549 keuhkosyövän soluja [38]. Fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) proteiini toimii fosfataasi defosforyloivan fosfatidyyli (3,4,5) -trisphosphate. PTEN negatiivisesti ohjaa fosfoinositidi 3-kinaasi /Akt signalointireitille [39]. PC-3-solujen hankkia homotsygoottinen deleetio PTEN, mikä Akt jatkuvasti aktiivinen. On kaksi fosforylaatio sivustoja Akt, treoniini 308 ja seriini 473. fosforylaatio Thr308 on Akt aktivoidaan PDK1 [40]. Fosforylaatio seriinillä 473 aktivoidaan mTOR-kinaasin, sen liittyvän proteiinin rehtori, ja sin1 /MIP1 [41], [42]. CAPE fosforylaatio seriinillä 241 PDK1 ja vaimennetaan fosforylaation seriinin 2448 ja 2481 on mTOR (Fig. 4). Vähentäminen PDK1 ja mTOR toiminta voi siis osaltaan edistää väheneminen phsphorylation on Akt. Toiminta glykogeenisyntaasikinaasi 3-alfa (GSK3α ja GSK3p tiedetään estää Akt-välitteisen fosforylaation Ser21 ja Ser9 vastaavasti, jotka rajoittavat niiden kykyä fosforyloida solusyklin säännellään proteiineja, kuten sykliini D1 ja p21

CIP1 [43 ], [44]. Phosphosphorylation on GSK3α S21 ja GSK3p S9 lisättiin 24 tunnin jälkeen ja 48 h 20 uM KAP hoitoa, mutta laski 72 h 20 uM CAPE hoitoon (Fig. 4). lisääntynyt fosforylaatio GSK3α S21 ja GSK3p S9 voi edistää kasvua p21

CIP1 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua CAPE hoidon. GSK3p-riippuvainen fosforylaatio sykliini D1 välittämän tumasta ja nopea hajoaminen sytoplasmassa sykliini D1 [45]. vähentäminen GSK3βactivity kohonneiden fosforylaation (Fig. 4), johti vähemmän fosforylaatioon sykliini D1 ja siksi kertyminen sykliini D1 24 tunnin ja 48 tunnin (Fig. 3). lisäys GSK3βactivity vuoksi lasku fosforylaation (Fig. 4) näin ollen pienentää runsaasti sykliini D1 72 h (Fig. 3). Vähentynyt fosforylaatio GSK3α ja GSK3p 72 h olivat yhdenmukaisia ​​vähentynyt fosforylaatio Akt. Vastustamisesta Akt opastinjärjestelmillä CAPE voivat edistää eston selviytymisen ja kasvun PC-3-solut.

Olemme huomanneet, että geenit vaikuttavat KAP 24 tunnin ja 72 tunnin kuluttua hoidon kohtalaisen korreloi (

r =

0,56, Fig. 5). Oli vain 25 vaikutti merkittävästi geenien yhteistä näiden kahden ajankohtina. Koska kasvun hidastumisen ja solukierron häiritseekin aiheuttama CAPE hoito aloitettiin 24 tunnin kuluessa ja estävä vaikutus ajan myötä kertynyttä, me arveltu, että tärkein tavoite geenejä syövän vastaisen aktiivisuuden CAPE nämä olivat 25 yhteisiä geenejä. Kruppel kaltainen tekijä 4 (Klf4) transaktivoi p21

CIP1 promoottori ja estää leviämisen aktivoimalla p21

CIP1 sekä suora tukahduttaminen sykliini D1 ja sykliini B1-geenin ilmentymisen [46] – [48]. Marraskuu geeni koodaa proteiinia CCN3 (marraskuu), joka estää solujen proliferaation kautta Notch /p21

CIP1 koulutusjakson [49]. Elevation of Klf4 ja marraskuu geenit voivat estää PC-3 kasvu kautta p21

CIP1. Kasvu /erilaistuminen tekijä-15 (GDF-15) on poikkeava TGFli perheenjäsen, joka on ollut mukana tuumorin kasvu ja kasvaimen invasiivisuus [50]. Muutama geenit ovat sytokiinit osallistuvat tulehduksen vasteen, kuten CCL20 [51], CXCL2 [52], CXCL5 [53]. Ne löytyivät säädelty, mikä viittaa siihen, että CAPE indusoi tulehdus vasteen PC-3-solut. Lisäksi CAPE hoito kasvattaa RhoE /RND3. Up-regulation pienen G-proteiinin RhoE /RND3 /Rho8 estää proliferaatiota eturauhasen syöpäsolujen apoptoosin edistämiseksi ja estämällä solusyklin etenemisen [54].

lisäksi 25 yleisesti muuttunut geenejä, jotkut differentiaalisesti ilmentyvien geenien erityisesti sen jälkeen, kun 24 tunnin tai 72 tunnin hoidon säätelevät myös solujen eloonjäämistä, lisääntymistä tai solukuolemaan. CAPE hoito lisäsi KLF6, S100P, GADD45A, PPP1R15A, S100P, mutta laski TOP2A ja CAV2. Kruppel kaltainen tekijä 6 (KLF6) on sinkkisormipolypeptidiin transkriptiotekijän ja toimii tuumorisuppressorigeeniä ihmisen eturauhassyövän [55]. KLF6 up-säätelee p21

CIP1 on p53-riippumattomalla tavalla ja vähentää merkittävästi solujen lisääntymistä [55]. S100P proteiini säätelee kalsiumin signaalitransduktion, tukirangan vuorovaikutus, proteiini fosforylaatio, transkriptionaalisen säätelyn, solusyklin etenemistä, ja erilaistumista. Elevation of S100P PC3-soluissa edistää solujen kasvua, lisäsi prosenttiosuutta S-vaiheessa olevien solujen, vähentynyt pohjapinta apoptoosin korko, edistänyt ankkurointi riippumattomaan kasvuun pehmeässä agarissa, ja resistenssiä kemoterapiaa [56]. GADD45A proteiini reagoi ympäristön häiriötekijöille välittämällä aktivoituminen p38 /JNK-reitin. Gadd45 proteiini on kuvattu muodostamaan kompleksin p21

CIP1. P21

CIP1-sitovan domeenin GADD45A koodaa myös Cdc2 sitovan aktiivisuuden. GADD45A vuorovaikutuksessa Cdc2, hajoaa Cdc2-sykliini B1 monimutkainen, muuttaa sykliini B1 ydinvoiman lokalisointi, ja siten inhiboi Cdc2 /sykliini B1 kinaasi [57] – [59]. PPP1R15A (Proteiinifosfataasi 1 säätelyalayksikön 15A, joka tunnetaan myös GADD34) on osoitettu indusoivan kasvun pysähtymisen ja apoptoosin. PPP1R15A ylössäätöä tehostaa p21

CIP1 proteiinin ilmentymistä ja indusoi p21

CIP1 promoottorin aktiivisuus [60].

vinblastiinin, Paclitaxol, ja CAPE vaikuttaa geenin ilmentymistä α-tubuliinin ja β-tubuliinia (kuva S1, S2), kun taas etoposidi, mitoksantroni, ja CAPE vaikuttaa geenin ilmentymisen tyypin II topoisomeraasin (kuva S3). Kuitenkin etoposidi indusoi p21

CIP1 kautta p53 ja alas-säätely c-Myc syöpäsoluissa [61], [62]. Mitoksantroni indusoi p21

CIP1 [63]. Vinblastiini indusoi apoptoosin kautta vähentämään p21

CIP1 [64]. Paclitaxol indusoi Akt-riippuvaisen fosforylaation p21

CIP1 johtaa yhdistyksen p21

CIP1 kanssa 14-3-3 ja siten kertymistä fosforyloidun muodon p21

CIP1 solulimaan joka estää estävää vaikutusta p21

CIP1 [65]. Ei tutkimus raportoi suhde p21

CIP1 ja estramustiinin. Koska CAPE hoito kasvattavat mRNA ja proteiini taso p21

CIP1 (Fig. 3) ja knockdovvn p21

CIP1 PC-3-solujen teki solut vastustuskykyisiä CAPE hoitoon (Fig. 8), Cape May tukahduttaa kasvua ja selviytymistä PC-3-soluja lähempänä etoposidi ja mitoksantroni, mutta vähemmän samanlainen vinblastiini, Paclitaxol, ja estramustiini. Paitsi CDKN1A (p21

CIP1 geeni), CAPE hoito lisäsi myös geenin ilmentymisen Klf4 KLF6, marras, GADD45A, PPP1R15A. Nämä geenit kaikki tukahduttaa leviämisen kautta p21

CIP1. Näin ollen vaikka yhteistyössä hoidon KAP tukahdutetaan enemmän PC-3-solujen kuin hoidon kemoterapiaa lääkkeellä yksin, CAPE vain osoitti synergististä estävää vaikutusta vinblastiiniin, Paclitaxol, ja estramustiinin (Fig. 7). CAPE hoito tukahdutti myös runsaasti ja fosforylaatiota Akt sekä alku- ja loppupään signalointi proteiineja Akt signalointi. Siksi olemme sitä mieltä, että p21

CIP1 induktio ja tukahduttaminen Akt signaloinnin molempien olla tärkeä rooli kasvun aiheuttama esto CAPE käsittely PC-3-solut. Kiteytämme Akt /p21

CIP1 signalointireitin verkon sairastumatta CAPE käsittely PC-3 kuvassa 9.

Protein runsaus tai toimintaa stimuloidaan Kap hoito on merkitty punaisella ylöspäin nuolet, kun taas on tukahdutti CAPE hoito on merkitty sinisellä alaspäin nuolia.

Yhteenvetona havaintomme edellyttäen käsityksen molekyylitason mekanismi CAPE n antiproliferatiivinen vaikutus PC-3 syöpäsolujen. Meidän tiedot osoittivat, että Kap antaminen voi olla hyödyllistä mahdollisena adjuvanttiterapiana yhdistettynä solunsalpaajahoitojen etäpesäkkeitä eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

kahvihappo AICD fenetyyliesteri, etoposidi, Paclitaxol, vinblastiini, estramustiini, ja mitoksantronilla hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA).

Cell Culture

PC-3-solut olivat antelias lahjoitus tri Shutsung Liao lab (University of Chicago) ja pidettiin DMEM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA), penisilliinillä (100 U /ml ), ja streptomysiinillä (100 ug /ml).

proliferaatiomääritystä

Suhteellinen solujen määrä analysoitiin mittaamalla DNA-pitoisuus solulysaateista fluoresoivalla värillä Hoechst 33258 (Sigma), kuten aikaisemmin on kuvattu [66] – [69]. EY

50 (lääkeaineen pitoisuus aiheuttamaan 50% kasvun inhibitio) huumeiden PC-3-solujen määritettiin Excel-apuohjelma ED50V10.

Soft Agar pesäkemuodostusta

8000 solut suspendoitiin 0,3% matalan sulamispisteen agaroosilla (Lonza, Allendale, NJ, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia DMEM ja sitten kerroksittain päälle 3 ml 0,5% alhaisen sulamispisteen agaroosia ja 10% naudan sikiön seerumia DMEM 6 cm ruokia. Solujen annettiin kasvaa 37 ° C: ssa, 5% CO

2 14 päivää. Levyt värjättiin 0,005% kristallivioletilla 30% etanolia 6 tuntia.

Luciferase-reportteri Assay

PC-3-soluja ympättiin 1,9 x 10

5 solua /kuoppa on 12-kuoppaisen levyn DMEM, joka sisälsi 10% FBS. 24 h maljaamisen jälkeen, PC-3-solut transfektoitiin PRL-TK-Renilla lusiferaasi-plasmidia (normalisointi vektori, 8 ng /kuoppa), 4X NF-KB: n (reportterigeenin vektori, 800 ng /kuoppa) käyttäen PolyJet ™ in vitro DNA- transfektioreagenssia (SignaGen Laboratories, Rockville, MD). 24 h transfektion jälkeen, solut käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla KAP. Kun oli kulunut vielä 24 tuntia, solut hajotettiin 100 pl passiivista hajotuspuskuria (Promega, Madison, WI, USA) ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase kit (Promega) on 20/20

n luminometrillä Turner Biosystems .

virtaussytometrianalyysin

Solut istutettiin 6 cm ruokia 4,5 ml: aan väliainetta ja CAPE lisättiin 24 tunnin kuluttua pinnoitus. Sen jälkeen ilmoitetun ajan (24, 48, 72 tuntia) kulttuurin läsnäollessa erilaisia ​​pitoisuuksia CAPE, solut poistettiin trypsiinillä ja kiinnitettiin 70% etanolilla PBS yön yli -20 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä, käsiteltiin 0,1 mg /ml RNaasi A: PBS: ssä 30 minuutin ajan, ja suspendoitiin sitten 50 ug /ml propidiumjodidia PBS: ssä.