PLoS ONE: ursolic samanaikaisesti kohdistettu useisiin signaalinvälitysreittien ohitettavat leviämisen ja aiheuttavat apoptoosia in Colon Cancer Cells
tiivistelmä
ursolic (UA), luonnollinen pentasyklisestä triterpenoidi karboksyylihappoa jaetaan lääketieteen yrtit, kiinnostavuus antituumorivaikutukset ja on nousemassa lupaava yhdiste syövän ennaltaehkäisyyn ja hoitoon, mutta sen valmisteverosta toimintamekanismeja paksusuolen syöpäsoluissa vielä tunneta laajalti. Täällä tunnistaa molekyylitason mekanismeja, joilla UA inhiboi solujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosia ihmisen paksusuolen syövän SW480 ja LoVo-soluihin. Hoito UA johtaneet merkittäviin estoja solujen elinkelpoisuutta ja klooni muodostumista ja muutoksia solujen morfologia ja leviää. UA myös tukahdutti paksusuolisyöpäsolulinjassa maahanmuuttoa estämällä MMP-9 ja upregulating CDH1 ilme. Lisätutkimukset osoittivat, että UA esti fosforylaatiota Akt ja ERK proteiineja. Esikäsittely Akt tai ERK-spesifinen estäjä huomattavasti kumottu leviämisen esto UA. UA myös ehkäisi merkittävästi paksusuolisyöpäsolulinjassa COX-2 ilmaisun ja PGE2-tuotantoa. Esikäsittely COX-2-estäjän (selekoksibi) kumosi UA-indusoitua proliferaatiota. Lisäksi olemme havainneet, että UA tehokkaasti edistää NF-KB ja p300 translokaation solusta ytimet sytoplasmaan, ja vaimensi p300 välittämää asetylointi NF-KB: n ja CREB2. Esikäsittely kanssa p300 estäjän (roskovitiinilla) kumosi UA aiheuttaman soluproliferaation, jota päinvastaiseksi p300 yli-ilmentymisen. Lisäksi UA indusoi paksusuolen syöpä-solujen apoptoosin, lisäsi lohkaisu PARP, kaspaasi-3 ja 9, ja trigged vapauttamaan sytokromi c: mitokondrion välisen kalvon tilaa sytosoliin. Nämä tulokset osoittavat, että UA inhiboi solun proliferaatiota ja indusoi apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa kautta samanaikaisesti modulaatio useita signalointireittien, kuten MMP-9 /CDH1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /NF-KB /CREB2, ja sytokromi c: /kaspaasi reittejä.
Citation: Wang J, Liu L, Qiu H, Zhang X, Guo W, Chen W, et al. (2013) ursolic Samanaikaisesti kohdistettu useisiin signaalinvälitysreittien ohitettavat leviämisen ja apoptoosin indusoimiseksi koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (5): e63872. doi: 10,1371 /journal.pone.0063872
Editor: Chunhong Yan, Albany Medical College, Yhdysvallat
vastaanotettu: 04 tammikuu 2013; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 30, 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat varat National Natural Science Foundation of China (81071687, 81272195), johon ”863-ohjelma” of China (SS2012AA020403), tohtoriohjelmat säätiö Opetusministeriö Kiina (20110171110077), ja valtion Key Laboratory Syöpätautien Etelä-Kiinassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet liittämisellä (t) Wenlin Huang ”Guangzhou Double Biopro- inc ”. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.
Johdanto
Colon ja peräsuolen syöpä (peräsuolen syöpä, CRC), kolmanneksi yleisin syöpä maailmassa on tullut yksi yleisimmistä kuolinsyistä syövistä [1]. Leikkaus, kemoterapiaa ja sädehoitoa ovat ensisijainen ja yhteinen hoitojen peräsuolen syövän. Vaikka kemoterapia adjuvantti leikkausta paranemisasteella paksusuolen syövän oli vielä ole ihanteellinen, varsinkin myöhemmässä vaiheessa potilaita. Etäpesäke ja toistuminen leikkauksen jälkeen tai tuotettu kemoterapian resistenssin johtaa yleensä lopullinen kuolema. Siten täydentävä ja vaihtoehtoinen hoito strategia on tullut tarpeelliseksi parantaa eloonjäämisaste paksusuolen syöpäpotilaiden. Kiinan kasviperäisten lääkeaineiden on tulossa yhä suositumpi syövän hoitojen yhdistettynä tavanomaiseen hoitoon, koska sen luonnollista alkuperää, alhainen myrkyllisyys ja tehokkuutta ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi syöpien, kuten paksusuolen syöpä [2].
ursolic (UA) luonnollinen pentasyklisestä triterpenoidi karboksyylihappo uutetaan lääketieteen yrttejä ja syötäviä kasveja, kykenee monenlaisia biologisia vaikutuksia, kuten hepatoprotective [3], anti-bakteeri [4], viruslääkkeiden [5], ja tulehdusta [6]. Lisäksi on ollut mukana ehkäisyyn ja suojaa syöpiä [7]. Sen anti-kasvain toiminta johtuu sen kyky estää kasvaimien syntyyn [8], syöpäsolun proliferaatiota ja indusoivat syöpäsolujen apoptoosia [6], [9]. Signalointireittien mukana UA toimintaan saattaa olla erilainen eri syövän solulinjoissa, ja osittainen signalointireitteihin voitaisiin säännellä samanaikaisesti tai peräkkäin ja synergized edistää UA hoitoon. Kuitenkin tarkka molekyylimekanismeihin UA mukana leviämisen estäminen ja apoptoosin induktio kolorektaalisyövässä eivät vieläkään olleet riittävän selkeitä.
Entsyymi COX-2 (COX-2), joka vastaa katalyysin muuntaminen arakidonihapon happo prostaglandiinien ja tromboksaani
2, tiedetään olevan mukana useita patofysiologisiin prosesseissa, kuten in fl tulehdus ja kasvaimen kehittymisen [10], [11]. COX-2 on havaittavissa useimmissa normaaleissa kudoksissa, mutta se on yleisesti yli-ilmennetään monissa syöpää edeltäviin, pahanlaatuiset ja metastaattinen ihmisen syövissä, kuten kolorektaalisyöpä, sen jatkojalostustuotteen prostaglandiini E2 (PGE2). Lisääntyvä todistusaineisto osoitti avainrooleja COX-2 karsinogeneesissä ja syövän etenemistä ovat osallistumalla kasvain aloittamista, edistää kasvaimen huolto- ja etenemiseen, ja kannustaa kasvaimen metastaaseja [12], [13]. Selektiivinen COX-2-aktiivisuuden kääntää karsinogeneesi paksusuolisyövän ja sen on osoitettu aiheuttavan apoptoosia, ja estää proliferaatiota ja angiogeneesiä [14], [15]. Jotkut sen estäjien vaikka on osoitettu olevan potentiaalisesti houkutteleva kemoterapeuttisten lääkkeiden kolorektaalisyövän hoitoon yhdessä muiden yhteisten kemoterapeuttisten aineiden [16], [17]. COX-2: n ilmentymisen on tiukasti säädellään transkription tasolla sitoutuminen transaktivaattorista kuten NF-KB, CREB2 ja co-aktivaattorit kuten p300 vastaavaan toimipaikkoja sen promoottori [18] – [21]. Kuitenkin myös UA pelaa antituumorivaikutus asetuksilla COX-2, NF-KB ja p300 signalointi edelleen huonosti ihmisen peräsuolen syövän, ja sen taustalla olevat signalointireittejä jäädä hämäräksi.
Täällä arvioimme vaikutus UA paksusuolen syövän solujen lisääntymisen, migraation ja apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa ja analysoitiin sen sääntely keskeisistä proteiineihin noin signalointireittien osallistuvat solujen lisääntymisen, migraation ja apoptoosin. Tulokset osoittivat anti-leviämisen, anti-muuttoliike ja proapoptoottisiin vaikutukset UA paksusuolen syövän solut välittyvät samanaikaisesti modulaatio useita signalointireittien, kuten MMP-9 /CDH1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, P300 /NF -κB /CREB2 ja sytokromi c /kaspaasiriippuvaisen reittejä. Tutkimuksemme ei ainoastaan paljastaa taustalla molekyylitason mekanismeja UA toiminnan ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, mutta ehdottaa myös suuria mahdollisuuksia UA ihmisen peräsuolen syövän ehkäisyyn ja hoitoon.
Tulokset
UA Inhibioitu Cell lisääntymistä ja Clone Formation ja aiheuttama Solumorfologia Change
ensin analysoitiin kvantitatiivisesti vaikutuksen UA soluproliferaatioon 48 tunnin kuluttua hoidon SW480 ja LoVo soluissa MTT-määrityksellä. Hoidon UA annoksella 10 uM 60 uM inhiboi merkittävästi solujen elinkelpoisuutta pitoisuudesta riippuvaisella tavalla, mikä johtaa 20%: sta 83%: isen inhibition SW480-soluja ja 5%: sta 55%: isen inhibition LoVo-soluissa, vastaavasti ( kuva 1A). Olemme myös päättäneet vaikutukset UA kasvainsolupinnoilla kyky muodostaa klooneja. UA myös merkittävästi inhiboi kloonin muodostumista annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1 B), jolloin tuloksena on merkittävä inhibitio kloonin muodostumisen suhteen sekä SW480 ja LoVo-soluja (Fig. 1 C).
Ihmisen paksusuolen syövän solulinja SW480 ja LoVo ja normaali solulinjoissa CCD841 ja LO2 hoidettiin UA osoitetussa annoksilla. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä (A, E), ja kasvainsolujen indusoiman klooni muodostuminen analysoitiin (B, C). Muutokset solujen morfologia, leviää ja kupliminen soluissa hoitaa ilman tai UA (10 uM ja 20 uM) 48 tunnin ajan havaittiin ja solut valokuvattiin mikroskoopilla varustettu digitaalikameralla (D). Prosentuaalinen solujen elävyyden tai klooni muodostumisen suhteen kummassakin hoitoryhmässä laskettiin suhteessa soluihin käsitelty DMSO ajoneuvon hallinnan. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *,
P
0,05, merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä ja DMSO kontrolliryhmiin.
vieressä analysoineet UA välittämä muutoksia solujen morfologian ja leviää SW480 ja LoVo solujen . Solujen käsittely DMSO, ajoneuvon ohjaus, muodostetaan solun kerroksen, ja levittää, filopodia ja kupliminen havaittiin. Sen sijaan UA hoito aiheutti huomattavaan vähenemiseen solusta soluun kontakti, ja oli pienempi levittää vähemmillä muodostumista filopodia sekä SW480 ja LoVo soluja, ja indusoitu kalvo kupliminen on käsitelty solu UA (Fig. 1 D).
arvioidaan myös vaikutusta UA soluproliferaatioon ihmisen normaaleissa solulinjoissa CCD841 ja LO2. Käsittely UA annoksina ≤20 uM ei estävät solujen elinkelpoisuutta sekä normaaleissa solulinjoissa, jotka osoittavat potentiaalia spesifisyyden UA estossa kasvainsoluproliferaation annoksella ≤20 uM.
UA Kohdennettu MMP-9 /CDH1 Signaling estävän Cell Migration
vieressä tutkittiin, mikä vaikutus UA solujen muuttoliikettä käyttämällä scratch määritystä. Yhdenmukainen tietoja solujen lisääntymistä ja kyky muodostaa klooneja esto hoito UA 5 uM tehokkaasti esti soluvaelluksen sekä SW480 ja LoVo soluja (Fig. 2A). Se osa aukkoa tai loukkaantumisesta väli solukerroksissa tehtyään naarmu oli miehitetty kokonaan kulkeutuva solut jälkeen 56 h. Sen sijaan tyhjä tila solujen ei miehitetty kulkeutuva solut käsiteltiin UA (Fig. 2A).
(A), Cell muuttoliikettä analysoitiin naarmu määrityksessä. SW480 ja LoVo soluja kasvatettiin täyteen konfluenssiin. Yksisolukerrokset haavoittuneen steriilillä pipetillä kärjestä, ja pestiin väliaineen poistamiseksi irrottaa soluja levyt. Solut jätettiin joko hoitamatta tai hoidettiin osoitetun annoksilla UA. Sen jälkeen 56 h, haava rako havaittiin ja solut valokuvattiin. (B, C), SW480-soluja käsiteltiin UA osoitetussa annoksilla. 56 tuntia käsittelyn jälkeen, ilmaus MMP-9 (B) tai CDH1 (C) analysoitiin kvantitatiivisesti reaaliaikaisen qPCR analyysi. *,
P
0,05, merkittäviä eroja UA-käsiteltyjen ryhmien ja DMSO-käsiteltyjen ryhmien.
MMP-9 ja CDH1 kaksi avainmolekyylejä mukana soluinvaasiota ja maahanmuuttoon liittyviä signalointireitin [22], [23]. Seuraavaksi me analysoitiin kvantitatiivisesti vaikutukset UA ilmentymistä koskevat MMP-9 ja CDH1 jota reaaliaikaisen qPCR analyysi SW480-soluissa. Kuten odotettua, UA 20 uM ja 40 uM merkittävästi tukahdutti mRNA taso MMP-9-geenin (Fig. 2B), kun taas UA hoito johti merkittävään kasvuun CDH1 mRNA: n ilmentymisen (Fig. 2C). Nämä tulokset osoittavat, että UA on tärkeä rooli tukahduttamaan muuttoliikkeen ja hyökkäyksen kautta modulaatio MMP-9 ja CDH1 signalointi.
UA Inaktivoitu Akt ja ERK Signaling estävän Cell Proliferation
PI3K /Akt ja MAPK signalointipolkujen kriittisiä rooleja valvontaan solujen lisääntymisen ja kasvaimen kehittymisen. Sen arvioimiseksi, onko UA kykenee moduloimaan PI3K /Akt ja MAPK signalointi johtaa soluproliferaation inhibointi, tutkimme vaikutuksia UA fosforylaatiota signalointi-molekyylien näiden kahden reittejä SW480-soluissa Western blot -analyysin avulla. Käsittely UA 20 uM huomattavasti esti ilmaus fosforyloidun Akt ja mTOR-proteiinin, mutta kasvoi fosforyloidun PTEN ilmentymistä (Fig. 3A). Olemme myös havainneet huomattavaa alentamista fosforyloitu ERK proteiinien annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3B). Tasot koko proteiinin ekspression Akt, mTOR, PTEN (Fig. 3A) ja ERK (Fig. 3B) ei muutettu.
(A, B), SW480-soluja käsiteltiin UA on 20 uM tai 40 uM 48 tuntia. Ilmaus fosforyloidun tai kokonaan PI3K, Akt, mTOR, PTEN, JNK, ERK1 /2-proteiineja detektoitiin Western blot. GAPDH käytettiin kontrollina näyte lastaus. (C, D), SW480-soluja käsiteltiin PI3K /Akt-estäjä LY294002 (LY, 5 uM) (C) tai ERK-estäjä U0126 (20 uM) (D) 4 tunnin ajan, ja sitten sitä käsiteltiin UA 20 uM. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-analyysillä. Prosentuaalinen solujen elävyys kummassakin hoitoryhmässä laskettiin suhteessa käsiteltyjen solujen ajoneuvon ohjaus DMSO. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *,
P
0,05, merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä ja kontrolliryhmiin.
edelleen varmistamiseksi osallistumista Akt ja ERK signaalireaktioteissä UA estoa solujen proliferaatiota, olemme seuraavassa analysoitiin vaikutuksia Akt tai ERK-selektiivinen on UA-välitteisen proliferaation inhibitio SW480-soluissa. Solujen esikäsittely PI3K /Akt-inhibiittori LY294002 (LY) on 5 uM (Fig. 3C) tai ERK Inhibitor U0126 20 uM (Fig. 3d) inhiboi solujen proliferaatiota, ja yhdistelmä UA (20 uM), jossa nämä inhibiittorit hieman kasvanut soluproliferaation inhibointi (Fig. 3C ja 3D). Kuitenkin lisääminen UA ei merkittävästi muuttunut leviämisen esto on SW480 soluissa esikäsitellyt Akt estäjän LY (Fig. 3C) tai ERK estäjä U0126 (Fig. 3d), mikä vahvistaa roolia UA säätelyssä Akt ja ERK signalointi.
UA Kohdennettu COX-2 ja PGE2 Signaling estävän Cell Proliferation
COX-2: n ilmentymisen on osoitettu upregulate EGFR, PI3K /Akt ja ERK signalointi, mikä indusoi tuumorisolun proliferaatiota, migraatiota ja invaasio [24], [25]. Sen määrittämiseksi, onko UA-välitteisen soluproliferaation inhibointi välittyy modulaation COX-2-signalointi koolonkarsinoomasoluissa, arvioimme vaikutus UA on COX-2: n ilmentymisen on proteiini ja mRNA-tasoja Western blot ja RT-PCR: llä. Hoidon UA annoksilla 20 uM ja 40 uM dramaattisesti inhiboivat ilmentymistä COX-2-proteiinin (Fig. 4A) ja mRNA: n (Fig. 4B) on SW480 ja LoVo-soluihin. Määrällinen densitometria-analyysi osoitti myös, että UA on 20 uM ja 40 uM suppressoi merkittävästi COX-2: n mRNA sekä SW480 ja LoVo-soluja (Fig. 4C).
(A-D), SW480 ja LoVo-soluja käsiteltiin UA 48 tuntia. Ekspression COX-2-proteiinin (A) ja mRNA: n (B) analysoitiin Western-blottauksella ja RT-PCR: llä, vastaavasti. Tiheydet COX-2: n mRNA, ja suhde COX-2 /GAPDH analysoitiin kvantitatiivisesti (C). Tuotanto PGE2 havaittiin ELSIA analyysi (D). GAPDH käytettiin verrokkeina näytteen lastaus. (E), SW480-soluja käsiteltiin COX-2-estäjä selekoksibia (CB, 20 uM) 4 tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten UA 20 uM. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-analyysillä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *,
P
0,05, merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä ja kontrolliryhmiin.
PGE2 on loppupään tuote COX-2, ja se syntetisoidaan syklo ja prostaglandiini syntaasi reittejä. Käsittelimme SW480 ja LoVo solujen UA 20 uM ja määritti UA on PGE2-tuotantoa. Tulokset osoittivat, että UA hoito vähensi merkittävästi PGE2-tuotantoa sekä soluissa (Fig. 4D).
varmistamiseksi edelleen, että UA-välitteisen soluproliferaation inhibointi on sen säätelyn kautta COX-2 signalointi koolonkarsinoomasoluissa, esikäsittelimme SW480-soluja selekoksibin (CB, 10 uM), COX-2-estäjä, ja vaikutus testattiin UA on selekoksibi-välitteisen soluproliferaation inhibointi. Kuten on esitetty kuviossa. 4E, esikäsittely Selekoksibilla (CB) huomattavasti estivät solujen elinkykyä, kun taas UA 20 uM ei merkittävästi muuttanut välittämää estoa selekoksibin. Nämä tulokset osoittivat, että inhibitio paksusuolensyöpä soluproliferaation UA voi olla myös osittain välittämä inhiboimalla COX-2-signalointi.
UA aiheuttama translokaatio NF-KB: n ja p300 Cell Nuclei sytoplasmaan
ilmaisu COX-2 säätelee translokaatio ja vuorovaikutusta transaktivaattorin NF-KB ja koaktivaattorikompleksien p300 kasvainsolun ytimeksi. Me seuraavaksi suoritetaan immunofluoresenssimäärityksellä vaikutuksen arvioimiseksi UA ydinvoiman lokalisointi ja vuorovaikutus NF-KB ja p300 paksusuolen syövän SW480 ja LoVo soluja. Havaitsimme konstitutiivinen translokaatiota p50 ja p65 NF-KB: n ja p300 soluun ytimet (Fig. 5A ja 5B) sekä kolokalisaation p65 kanssa p50 (Fig. 5A) tai p300 (kuvio. 5B) sekä SW480 ja LoVo solut. Hoidon UA 20 uM ja 40 uM indusoidun translokaation NF-KB: n (Fig. 5A) ja p300 (kuvio. 5B) välillä solutumien sytoplasmaan. Tulokset osoittavat, että UA suunnattu NF-KB ja p300 signalointi edistämällä niiden translokaatio solusta ytimet solulimassa koolonkarsinoomasoluissa.
Ihmisen SW480 ja LoVo soluja kasvatetaan kammion dioja hoidettiin UA. 48 tuntia käsittelyn jälkeen, osa-sijainti solun p50, p65 ja p300 ja kolokalisaation p65 with p50 (A) tai p300 (B) tutkittiin konfokaalimikroskopiaa analysoinnin merkitystä -konfokaalimikroskoopilla. Yli 100 solua tarkastettiin koetta kohti, ja soluja, joilla on tyypillinen morfologia esiteltiin.
UA Kohdennettu p300 Signaling estävän NF-KB /CREB-2 asetylointi ja Cell Proliferation
p300-välitteisen asetylaatio transaktivaattorista ja niiden sitoutumista COX-2-geenin edistää keskeisessä asemassa ovat COX-2: n ilmentymisen. Me seuraavaksi määritetään vaikutus UA on P300-välitteinen asetylointi transaktivaattorista NF-KB: n ja CREB2 paksusuolen syövän SW480-solujen. Hoidon UA 20 uM p300-transfektoitujen SW480-solujen inhiboivat merkittävästi asetyloitu tasoja p50 /p65: n ja CREB-2-proteiineja (Fig. 6A), kun taas näiden proteiinien ilmentymisen ei muuttunut (Fig. 6B).
(A, B), SW480-soluja transfektoitiin FLAG-p300: ssa 24 tuntia ja sitten käsiteltiin UA 48 tuntia. Ydin- uutteet valmistettiin ja p50, p65 ja CREB2 immunosaostettiin asetyyli–lysiini-vasta-ainetta. Asetyloitu proteiinit (A) ja proteiinin ekspressio (B) p50, p65 tai CREB2 analysoitiin Western blot. (C, D), SW480-soluja esikäsiteltiin p300-estäjä roskovitiini (ROSC, 20 uM) (C), tai transfektoitu p300-ilmentävällä vektorilla (D) 8 tuntia, ja sitten sitä käsiteltiin UA. 40 tuntia käsittelyn jälkeen, solujen elinkelpoisuus määritettiin. Tyhjän vektorin (EV) käytettiin transfektiota ohjaus. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta. *,
P
0,05, merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä ja kontrolliryhmiin.
Voit tarkistaa roolia UA säätelyssä p300 signalointi koolonkarsinoomasoluissa, me esikäsitellään roskovitiini, inhibiittori p300 (Fig. 6C), tai transfektoitu p300 ilmentävän vektorin SW480-soluissa (kuvio. 6D), ja vaikutukset UA on roskovitiini tai p300-välitteisen soluproliferaation analysoitiin. Solujen käsittely roskovitiinilla (ROSC, 20 uM) esti merkitsevästi solujen elinkykyä, kun taas UA 20 uM ei merkittävästi muuta roskovitiinilla estoa (Fig. 6C). Sitä vastoin p300 yli-ilmentyminen merkitsevästi päinvastaiseksi UA-välitteinen inhibitio SW480-soluissa verrattuna transfektio tyhjällä vektorilla (EV) (Fig. 6D). Nämä tulokset osoittavat, että p300 on tärkeä tavoite UA ja että UA-indusoidun soluproliferaation inhibointi välittyy ainakin osittain läpi p300 signalointireitin paksusuolen syöpäsoluissa.
UA Kohdennettu Sytokromi c /kaspaasi Signaling indusoida solukuoleman
tutki myös vaikutusta UA solun apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa anneksiini-V-värjäys-pohjainen FACS-määritys 48 tunnin käsittelyn jälkeen. Solujen käsittely UA 20 uM ja 40 uM johti annoksesta riippuvan induktion positiivisen apoptoottisten solujen (Fig. 7A), joka johtaa 6,3%: sta 14,2%: induktion SW480-soluissa ja 2,8%: sta 53,4%: induktion LoVo solut (Fig. 7B). Kaspaasien aktivaatio on tärkeä loppupään tapahtuma apoptoottisen reitin. Me seuraavaksi määritetään, onko indusoiman apoptoosin UA liittyy lisääntynyt aktivointi kaspaasin väylän SW480-soluissa. Vaikutukset UA ekspressioon katkaistun proteiinien kolme keskeistä apoptoosiin liittyviä proteiineja: PARP, kaspaasi-3, ja kaspaasi-9, havaittiin 48 tunnin käsittelyn jälkeen Western blot -analyysillä. Kuten on esitetty kuviossa. 7C, hoidon UA 20 uM ja 40 uM johti nousi jopa katkaistun PARP, kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 proteiineja, mikä viittaa siihen, että UA voi toimia tärkeänä ja erityinen välittäjänä helpottaakseen kaspaasi porrastetusti.
SW480 ja LoVo-soluja käsiteltiin UA (20 uM ja 40 uM). 48 tuntia käsittelyn jälkeen apoptotsis määritettiin jota anneksiiniV-FITC värjäys-pohjainen FACS-analyysi (A, B). Tasot pilkottiin kaspaasi-3, kaspaasi-9 ja PARP-proteiinien SW480-solut analysoitiin Western blotilla (C). Vapautumista sytokromi c: n (Cyto-c) inter-mitokondrioiden tilaa sytosoliin määritettiin immunofluoresenssilla kuvantaminen analyysi (D). SW480-soluja transfektoitiin p300 siRNA: ssa 24 tuntia, ja sen jälkeen käsittely UA (20 uM). 48 tuntia käsittelyn jälkeen apoptotsis määritettiin FACS-analyysillä (E). Apoptoosi edustaa suhteellinen osuus apoptoottisia soluja verrattuna, että DMSO-käsitellyissä soluissa. *,
P
0,05, merkittäviä eroja UA-käsiteltyjen ryhmien ja kontrolliryhmiin.
Sytokromi c (Cyto-c) on ylävirtaan molekyylin caspase- riippuvainen apoptoosireitin. Me seuraavaksi suoritetaan immunofluoresenssimenetelmällä kuvantaminen (IFI) analyysi seurata muutoksia solunosasijaintia Cyto-c on UA-käsitellyn SW480 ja LoVo solujen onko UA voi laukaista Cyto-c release. Käsittely UA (20 uM) tehokkaasti edistää vapautumista Cyto-c inter-mitokondrioiden tila sytosoliin (Fig. 7D). Nämä tulokset osoittavat, että UA koordinoitu Cyto-c vapautumisen välisen mitokondrion kalvon tilaa ja helpottaa loppupään kaspaasin aktivaatio solulimaan.
tutki myös vaikutusta estämällä P300 on indusoiman apoptoosin UA. SW480-soluja transfektoitiin p300 tietyn siRNA (si-p300) ja käsiteltiin sitten UA (20 uM), ja vaikutus inhibition P300 on UA-välitteistä apoptoosia analysoitiin. Tulokset osoittivat, että knockdovvn p300 ilmentymisen si-p300 merkittävästi tehosti apoptoosin välittämää UA (Fig. 7E), joka vahvistaa roolia p300 signaloinnin säätelyssä UA aiheuttaman apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa.
Keskustelu
tässä tutkimuksessa olemme analysoineet vaste ihmisen paksusuolen syövän solujen UA hoitoon. UA ehkäisi merkittävästi solujen proliferaatiota, migraatiota ja indusoi apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla. Osoitimme, että UA indusoi sytokromi c release, mikä aiheutti kaspaasin aktivaatio ja apoptoosin. UA säädellään myös ilmaus MMP-9 ja CDH1 geenejä ja esti fosforylaatiota Akt ja ERK proteiineja, mikä johtaa inaktivoinnin solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä liittyviä signalointireitteihin. Tutkimuksemme osoitti myös, että UA tukahdutettu COX-2 ilmaisun ja PGE2-tuotantoa. Lisäksi olemme osoittaneet, että UA-välitteinen tukahduttaminen COX-2: n ilmentymisen ja solujen lisääntymistä välittyy samanaikaisesti modulaation p300 NF-KB, ja CREB2 signalointia. UA esti P300-välitteinen asetylointi NF-KB ja CREB2, ja myös edistänyt translokaation NF-KB-p65 ja p300 solusta ytimet sytoplasmaan. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti, joka osoitti, että UA samanaikaisesti kohdistuu useita signalointireittien estävän paksusuolen syövän solujen lisääntymisen ja apoptoosin.
UA on tutkittu intensiivisesti viime; pääasiassa syövän vastaisena yhdiste ja sen sydän- suojaavia ominaisuuksia. Kiista raporttien viittaa antiangiogeenisen ja sytotoksisia vaikutuksia UA toisella puolella ja sydän- ja endoteelin suojaavia vaikutuksia toisella puolella. Tällä hetkellä on riittävää näyttöä siitä ihanteellisen ihmisen annoksesta. Eläinkokeissa hyötyä käytön välillä 0,05-0,2% rotan ruokavalion UA. Olettaen erilaisia 10-40 mg /painokilo, hyödyt rottakokeissa liittyvät UA vastaa noin ihmisen annoksella 1,6-6,4 mg /painokilo (110-440 mg 150 lb henkilö).
sivuvaikutuksia UA peräisin pääasiassa kahteen seikkaan: miehen hedelmällisyyttä ja DNA-vaurioita. Edellinen tutkimus on osoittanut, että UA on potentiaalia siittiöiden liikkuvuutta esto ja niitä voidaan käyttää paikallisesti emättimen ehkäisymenetelmää [24], [25]. Erityisesti, se aiheuttaa rikkoutuminen siltojen solujen välillä, jotka ovat pian spermaa, ja vaurioituneiden solujen sitten kerätä muodostamaan symplasts että siementiehyiksi, jotka liittyvät miehen hedelmättömyyteen. UA anti-angiogeneesiä, syövän ja paikallisesti levitetään sydän- lääke voi olla hyödyllistä. Kuitenkin DNA: ta vahingoittavat aktiivisuus UA voi myös olla vakava ongelma. UA kykeni indusoimaan solukuoleman endoteelisoluissa kun pitoisuus ylitti 12,5 uM [26].
Ilmaisu COX-2 on keskeinen rooli ihmisen syövissä. COX-2 ilmaisun ja PGE2-tuotantoa on osoitettu upregulate PI3K /Akt ja ERK signalointi siten angiogeneesissä, solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota [27], [28]. COX-2 esto voi solujen kasvua vaimentava ja apoptoosin ja aiheuttaa epiteelin-mesenkymaalitransitioon [29] – [32]. Kuitenkin mekanismi, jolla COX-2 ilmentyy voimakkaasti kasvaimien syntyyn ei täysin ymmärretä. COX-2-transkription säätelyyn on laajasti tunnettu [33] – [35]. P300 on osoitettu olevan olennainen COX-2: n ilmentymisen ja kohdistaa maailmanlaajuinen vaikutus COX-2-promoottori kromatiinin rakenteen parantamiseksi sitoutumisen transaktivaattorista [20], [21]. P300 on ilmaistu runsaasti syöpäsoluissa ja p300 yli-ilmentyminen täydentää COX-2 transkription aktivaation [36], [37]. Se toimii transkription koaktivaattorikompleksien kuroa promoottori sidottu transaktivaattorista kanssa transkriptiotekijöitä transkription koneet [20], [21]. P300 HAT acetylates histones avaten siten kromatiinirakenteeseen sekä lisäämällä Lisäävän elementtien transaktivaattorista. P300 HAT pystyy myös asetylointi transaktivaattorista kuten NF-KB: n, mikä parantaa transaktivoijaproteiinia sitova [21]. Yhdenmukainen aiempien raporttien tämänhetkisiin tutkimus osoitti myös, että p300 keskeinen rooli säätelyssä NF-KB ja CREB2 asetylointi ja solujen lisääntymistä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. UA tavoitteet P300 signalointi estävän asetylointi NF-KB ja CREB2 siten estävät solujen lisääntymistä. On osoitettu, että p300 HAT säädetään p300 fosforylaation tai asetylaatio [38]. On mahdollista, että UA tukahduttaa p300 fosforylaatio, muuttaa p300 HAT rakenne ja katalyyttinen aktiivisuus, ja estää translaation jälkeisen muuttaminen P300 HAT, estäen täten HAT aktiivisuus koolonkarsinoomasoluissa. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään mekanismia, jolla UA estää p300 signalointi.
Aiemmat tutkimukset osoittivat, että UA indusoi apoptoosia ihmisen syövissä [39]. Kuitenkin tarkka molekyylimekanismeja ja signalointi kanavat, joita UA indusoi apoptoosin jää epäselväksi. Mielenkiintoista on, että tietomme osoittavat, että apoptoosin induktio UA on pääasiassa UA-välitteisen kaspaasi-riippuvaisen apoptoottisen reitin. Solujen käsittely UA laukaisi julkaisun sytokromi c (Cyto-c) sytosoliin, ja sitten stimuloi kaspaasien aktivaatio, mikä indusoi apoptoosin.
Olemme myös havainneet, että UA suunnattu Akt ja ERK riippuva signaalinvälitysreittien estävän paksusuolen syövän solujen lisääntymisen. Fosforyloidun Akt ja ERK ovat välittäjiä solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen ja kliinisen vaste tyrosiinikinaasiestäjät (TKI), ja vähentää fosforyloidun Akt ja ERK ilme on tärkeä tapahtuma herkistävät kasvainsolut TKI hoitoon. UA inhiboi fosforylaatiota Akt ja ERK-proteiineja, jolloin tuloksena on inaktivointi solujen kasvua ja selviytymistä liittyvät Akt /ERK-signalointireitin. Meidän havainnot ovat merkittäviä vaikutuksia tutkimalla uusia terapeuttisia strategioita paksusuolensyöpä.
Yhteenvetona osoitimme, että UA esti solujen proliferaatio ja migraatio ja indusoi apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa samanaikaisesti moduloimalla MMP-9 /CDH1, Akt /ERK COX-2 /PGE2, p300 /NF-KB /CREB2, ja sytokromi c: /kaspaasiriippuvaisen signalointireitteihin (Fig. 8). Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uutta tietoa molekyylimekanismeihin UA-välitteisen proliferaation eston ja apoptoosin induktio ja viittaavat siihen, että UA voi olla lupaava aine ehkäisyyn ja hoitoon ihmisen paksusuolen syövän.
UA esti solujen proliferaatio ja migraatio ja aiheuttama apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa samanaikaisesti moduloimalla MMP-9 /CDH1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /NF-KB /CREB2, ja sytokromi c: /kaspaasiriippuvaisen signalointireitteihin.
Materiaalit ja menetelmät
Cell Culture and Chemicals
Ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa (SW480, LoVo) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI 1640 johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 100 ug /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä, ja pidettiin inkubaattorissa, jossa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO
2 37 ° C: ssa . Kaikissa kokeissa soluja 60% konfluenssiin testattiin. Ursolic (UA), selekoksibi ja roskovitiini ostettiin (Sigma (St. Louis, MO). 100 mM liuosta lääkkeen valmistettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), tallennetaan pienissä erissä -20 ° C: ssa ja sitten laimennetaan tarvitaan solujen elatusaineesta.
solunelinkykyisyysmääritys
solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä (Roche Diagnosis, Indianapolis, iN). Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille (3000 solua /kuoppa) käsiteltiin UA eri annoksina. 48 h käsittelyn jälkeen solujen elinkelpoisuus määritettiin.
Colonogenic Pitoisuus
Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille käsiteltiin UA. 24 tunnin kuluttua , solut pestiin PBS: llä ja trypsinoitiin. Sitten solut ympättiin 100 solua /kuoppa 6-kuoppalevyille, ja dispergoitiin tasaisesti hieman ravistamalla astioita ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO2 21 päivää. kasvualusta