Krooninen sairaus

tiivistelmä

Balkanin ja Taiwan, suhde altistumisen aristolokihappo happoa ja riski urothelial kasvainten oli päätellä A T geneettinen tunnusmerkki on

TP53

geenin pahanlaatuisia soluja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli luonnehtia

TP53

mutaatiostatuksesta taajuuksien urothelial syövissä peräkkäistä Aristolokihappo Acid Nephropathy Belgiassa. Serial jäädytetty kasvain osastoja naispotilaiden (n = 5), jotka altistuivat aristolokihappo happo aikana painonlasku hoito oli vaihtoehtoisesti käyttää joko p53 immuunivärjäysmenetelmällä tai laser mikrodissektion. Tissue alueilla, joilla on vähintään 60% p53-positiivisia tumat valittu microdissecting osastot p53-positiivisia vastaavia alueita. Kaikki alueet näyttivät olevan carcinoma in situ. Sen jälkeen DNA: n uutto, mutaatiot

TP53

hot spot alueella (eksonit 5-8) tunnistettiin käyttäen sisäkkäisiä-PCR ja sekvensointi. Vääriä negatiivisia valvonta muodostui microdissecting makean pakastetut tuumorikudoksista sekä potilaalta, jolla Li-Fraumeni oireyhtymä, joka kuljetti p53 perustuslaillinen mutaatio, ja

kras

mutatoitunut adenokarsinooman. Sulkea pois väärät positiiviset tulokset mahdollisesti syntyvät mikrodissektion ja sisäkkäisiä-PCR, joka on fenasetiini liittyvä urothelial karsinooma ja normaali tuoretta virtsanjohtimen kudoksissa (n = 4) on käsitelty suurella laserin teho. Ei yllättäviä tuloksia tunnistetaan, molekyylitason analyysi harjoitetaan pahanlaatuinen kudoksia, joissa on oltava vähintään yksi mutaatio kaikki (kuusi eri mutaatiot kaksi) potilailla, joilla 13/16 eksoni (roskaa, 2, missense, 11) ja 3/16 introni ( yksi liitos sivusto) mutaatioita. Ne jaettiin siirtymät (n = 7) tai transversiot (n = 9), jossa yhtä esiintyvyys A T ja G T (3/16 kukin). Vaikka nykyiset tulokset ovat linjassa A T yleisyys aikaisemmin raportoitu Balkanin ja Taiwanissa tutkimuksia, ne osoittavat myös, että useita mutaatioita

TP53

hot spot alueella ja tiheä G T transversiosta näkyvät täydentävänä allekirjoitus mikä myrkyllisyyden kumulatiivinen annos aristolokihappo hapon nauttia lyhyen ajanjakson aikana.

Citation: Aydin S, Dekairelle AF, Ambroise J, Durant JF, Heusterspreute M, Guiot Y, et ai. (2014) yksiselitteiset havaitseminen useita

TP53

geenimutaatioita AAN-Associated uroteelisyöpä Belgiassa käyttäminen Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä. PLoS ONE 9 (9): e106301. doi: 10,1371 /journal.pone.0106301

Editor: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2014; Julkaistu: 03 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Aydin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Eettisen selvitys esiteltiin Belgian rekisterinumero B40320095694.

Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Aristolokihappo acid Nephropathy (AAN) raportoitiin ensimmäisen kerran 1990-luvun alussa Belgian potilailla joka on laatinut painonlasku hoito saastuttamaa aristolokihappo hapolla (AA) [1], [2] . AAN on ominaista nopeasti etenevä interstitiaalinen nefropatia kanssa putkimainen proteinuria ja glukosurian, varhainen vakava anemia, laaja hypocellular sidekudoslisää vähentämällä ulomman ja sisemmän aivokuoren labyrintti, ja nopea kehitys virtsateiden siirtymäkauden solukarsinoomat vuonna 40-46%: n potilaat 2-6 vuoden kuluessa lopettamisesta altistus [3] – [6]. AAN on nyt tunnustettu tuhoisa sairaus esiintyy maailmanlaajuisesti peräti 100 miljoonaa ihmistä uhkaa mahdollinen AA altistus [7]. Vaikka mekanismia AA nefrotoksisuutta vielä perusteellisesti tutkittu, syöpää aiheuttavaa toimintaa on tällä hetkellä johtuvan genotoksisuuteen AL (aristolactam) -DNA adduktit ominaista suuri taajuus A T transversio

TP53

tuumorisuppressorigeeniä AA-liittyvien kasvainten. Tämä on hyvin dokumentoitu eläinkokeissa [8], [9] ja, vaikka ei aina, potilaille kliinistä ja histopatologisia yhtäläisyyksiä alkuperäisen Belgian AAN tapauksissa [10] – [14]. Kun taas AL-DNA additiotuotteiden osoittavat AA altistumiseen on hyvin dokumentoitu munuaiskudokset Belgian kohortin [6], [15], [16], kun läsnä on A T transversiosta todistamassa välinen syy-yhteys altistumisen ja maligniteetin piti vielä olla tutkittu. Tavoitteena oleva työ oli siis luonnehtia

TP53

mutaatiostatuksesta taajuuksien jäädy- pahanlaatuisten urothelial kudokset Belgian AAN käyttävillä potilailla perusteellisesti validoitu genotyypitysmenetelmiä.

Potilaat ja menetelmät

etiikka lausunto

vuonna 2001 tutkimuksen geneettistä vaihtelua entsyymien osallisena metaboliassa aristolokihappo hapon kesken Belgian AAN potilaiden hyväksyttiin prof JM Maloteaux puheenjohtaja Lääketieteellisen tiedekunnan ja Health Sciences Research Ethics komitean Leuvenin yliopistossa (Belgia). Sen jälkeen eettisen komitean hyväksyntä, kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan Belgian AAN sarjassa. Nämä tutkimustiedot jäi julkaisematta.

Vuonna 2009 muutosta pilottitutkimus erityisesti määritelty nykyisessä

TP53

tutkimusta, joka suoritettiin kudosnäytteitä 5 AAN potilaista tässä tutkimuksessa, ja hyväksyttiin sellaisenaan tutkimuseettiseltä komitean Leuvenin yliopistossa (Belgia) jatkoksi tutkimus aloitettiin vuonna 2001. kudosnäytteitä potilaista 1-5, jotka olivat kaikki osa alkuperäisen tutkimuksen (2001) on anonymisoitu ennen analyysi.

verinäytteet olivat osa aiemman tutkimuksen (UCL eettisen komitean hyväksyntä viitenumero. 2003/05/03/08) [17]. Adenokarsinooma ja kirurgiset ureteric kerättiin AA-etuyhteydettömältä potilasta osana lääketieteellistä hoitoa ja oli nimettömiksi ennen analyysiä. Sen jälkeen kirjallinen selvitys, adenokarsinooma kudoksia säilytettiin UCL Biological kirjastossa (https://www.centreducancer.be/fr/show/index/section/8/page/34). Non AA liittyvä ureteric otettujen näytteiden nephroureterectomies poistaa, kun munuaisensiirtoa käytettiin verrokkeina tässä tutkimuksessa kodifiointina jälkeen patologisen analyysin mukaisesti Belgian lakeja kudospankkeihin (2008).

Snap -frozen granulosa-kasvain näyte Li-Fraumeni potilaan saatiin UCL biologisesta kirjaston (sama kuin edellä). Sen jälkeen kirjallinen suostumus vanhemmilta, tämä näyte anonymisoidaan ennen käyttöä.

Edellinen raportoitu tiedot sisältävät AL-DNA addukteja tunnistettu munuaiskudosnäytteillä potilailta 1, 3, 4 [15], [16], [18 ] ja

TP53

geenin sekvensointi suoritettiin virtsarakon TCC potilaasta 1 [10].

AAN potilaiden

Viisi AAN tarkoitetut potilaat Cliniques Universitaires Saint-Luc (Bryssel, Belgia) tutkittiin (taulukko 1). Kaikki olivat naisia, joiden keski-ikä 42,8 vuotta (vaihteluväli 27-53) klo esitys. Yksi potilas oli tupakoitsija. Ei mitään oli ollut kipulääke väärinkäyttö tai tyypillisiä kipulääke nefropatiaa. He kaikki kävivät kahdenväliset nephroureterectomy joko ja munuaisensiirtoa tai myöhemmin ylemmän virtsateiden syöpäsairauksia. Lisäksi yksi potilas myös koki höyläys- leikkauksessa toistuvia siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) virtsarakon ja lopulta cystectomy. Diagnoosi AAN perustui seuraavat kriteerit: AA saanti läpi painonlasku hoito phytochemically osoitettava saastunut (potilaat 1, 2, 3 ja 5), ​​tyypillinen munuaisen histologia sidekudoslisää (kaikki viisi potilasta), tunnistaminen AL -DNA addukteja munuaisten kudoksen (potilaat 1, 3 ja 4) ja kehittäminen ylempien virtsateiden maligniteetti (kaikki viisi potilasta) [15], [16], [18]. Potilaalla 4, saanti AA voisi kuitenkin koskaan virallisesti todistettu kun hän väitti osallistui painonlasku klinikalla ennen hoito saastuttama AA (niin sanottu ”kaava 2”) otettiin käyttöön [1]. Kuitenkin kaikki viisi potilasta täyttävät äskettäin ehdottanut kriteerien selvä diagnoosi AAN [19] nykyisessä tapauksessa sarja. Vaikkakin puuttuu

TP53

mutaatiostatus, on syytä huomata, että potilas 1 on nro 3 viittauksissa 4, 5, 15 ja 16, potilas 2 on nro 7 viitaten 5, potilas 3 on nro 4 lähteissä 15 ja 16, nro 5 viitaten 5, ja potilas 4 on nro 2 viitaten 20 ja numero n ° 8 viitaten 18 taas potilas 5 ei ole vielä raportoitu.

Kirurginen näytteet

kudokset viiden pelvi-ureterectomies ja yhden cystectomy valittiin sen perusteella, saatavuus jäädytetyn materiaalin. Karsinooma

in situ

(CIS) ja papillaarinen TCC todettiin vastaavasti vuoden 2004 WHO luokittelu urothelial kasvaimia [21], [22]. Yksipuolinen multifokaalinen iVy kehitetty oikeassa ylä virtsateiden (lantio, ylempi, puolivälissä ja alemman virtsanjohdin) kahdella potilaalla (potilas 1 ja 5). Vaikka ureteral iVy tunkeutuneet fokaalisesti lamina propria potilaalla 1, hän kehitti myös virtsarakon papillaarinen TCC. Kahdenväliset multifokaalinen iVy kehitetty ylemmässä virtsateiden ja 3 muut potilaat. Viive lopusta altistumisen ja kirurgian keskimäärin 44,75 kuukautta (vaihteluväli 15-96) potilailla 1, 2, 3, 5 ja oli käytettävissä potilaiden 4. entinen neljällä potilaalla, yksipuolinen ja kahdenvälisiä TCC todettiin keskimäärin 61 kuukautta ( alue: 27-96) ja 41 kuukautta (vaihteluväli: 18-64) jälkeen loppuun tiedetyn altistumisen, vastaavasti.

p53 immunohistokemia (IHC) B

iVy tunnistettiin valomikroskoopilla hematoksyliini- eosiinilla petsattu osastoja jäädytetty pelvi-ureteric näytteitä. Out of serial jääleikkeitä (7 pm paksun), kohdat nro 1, nro 3 ja nro 5 käytettiin p53 immunohistokemia (IHC) ja pidettiin yön yli 37 ° C: ssa kun taas kohdissa nro 2, nro 4 ja n ° 6 käytettiin laser mikrodissektion. Jälkimmäinen kolme osaa oli asetettu biokemiallisesti inerttiä polyeteeni naphtalate (PEN) kalvo kuuluvat dioja ja pidettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. P53 IHC-osastot, pidettiin 37 ° C: ssa sen jälkeen vahvistettu formaldehydillä 4% 3 tuntia. Endogeeninen peroksidaasi estettiin 0,3% vetyperoksidia deionisoitua vettä 30 minuutin ajan. Levyjä inkuboitiin 97 ° C: ssa 75 min ja huuhdeltiin liuoksessa, joka sisälsi deionisoitua vettä ja triton 0,05%. Leikkeet peitettiin sitten 30 min 10% normaalia vuohen seerumia (NGS), joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia (BSA), laimennettu tris-triton. Niitä inkuboitiin yli yön huoneen lämpötilassa anti-p53-hiiri monoklonaalinen vasta-aine DO-7 (BioCarta, Europe GmbH) laimennoksena 1:1000. Kun oli pesty Tris-triton 0,05%, levyt inkuboitiin huoneen lämpötilassa 75 min, jossa on valmiina-käytettäväksi anti-hiiri EnVision-Peroxidase-järjestelmä (Dako, Glostrup, Tanska) mukaan valmistajan protokollan ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Normaali vuohen seerumia käytettiin negatiivisena kontrollina.

yli-ilmentyminen p53 määriteltiin tumavärjäystä riippumatta IHC intensiteettiä. Laaja p53 värjäyksen IHC on aiemmin suositellut parantaa mutaation havaitsemismäärä

TP53

[23]. Näin ollen vain kudoksen alueita, jotka sisältävät yli 60% positiivisia tumat valittu mikrodissektion. Täsmälleen vastaavia alueita vielä käsittelemättömien leikesarjojen (nro 2, nro 4 ja nro 6) koki mikrodissektion yksityiskohtaiset jäljempänä.

Laser capture mikrodissektion

Kun toluidiinisinivärjäystä, kukin korjaamatta jäädytetty kudoksen ala, joka sovitettu tarkasti kiinnostuksen kohteena oleva alue määritellään sen mukaan, p53 IHC dioja eristettiin käyttäen Palm microLaser järjestelmä (Bernried, Saksa), jossa pulssi UV typen (aallonpituus: 337 nm; Pulssienergia 270 μJ, pulssin kesto 3nsec , pulssitaajuus 1-30 /s) ja PALM Robot ohjelmiston versio 2.2. Järjestelmä on kytketty Axiovert 200 mikroskoopilla ja suunnitelma Neofluar 20 × (Zeiss, Oberkochen, Saksa). Mikropaloitelluista pesäkkeet sinkoutua mikroputkeen korkki ja jäädytettiin -20 ° C: ssa, kunnes DNA: n eristämiseksi (kuvio 1).

A-G TCC ala on enemmän kuin 60% p53 värjätään ytimet IHC vasta- värjättiin hematoksyliinillä pakastetusta osiosta virtsanjohtimen (A). Laser kaapata mikrodissektion, eli toluidiini sinistynyttä alueen edustava jäädytetty § on sovitettu (B), leikataan (C) ja sinkoutua (D) korkki mikroputkeen (E). 3′-5’dideoxy sekvensointi elektroferogrammi segmentin p53 osoittaa villityyppisen sekvenssin (F, nuoli) ja A T transversion (G, nuoli) johtaa missensemutaatio E286V eksonissa 8.

DNA: n uutto

kunkin cap, 10 ui liuosta, joka sisälsi EDTA: ta 0,001 M (pH 8), Tris-HCI: ää 0,02 M (pH 8), 0,5% Tween 20, proteinaasi K: n (2 mg /ml), ja ultrapuhdasta vettä mukana. Sentrifugoinnin ja sekoittamisen jälkeen, kunkin reaktion putki päällystettiin yksi tippa mineraaliöljyä haihtumisen estämiseksi ja inkuboitiin yön yli 55 ° C: ssa jatkuvasti sekoittaen (600 rpm). Ultrapuhdasta vettä (5 ui) lisättiin sitten reaktioputken lisätä lopulliseen tilavuuteen liuosta. Sentrifugoinnin jälkeen liuosta kuumennettiin 99 ° C: ssa 10 min inaktivoimiseksi proteinaasi K: Lopuksi uute siirrettiin toiseen mikroputkeen.

Nested-PCR

eksonit 5-8, joka vastaa p53-DNA: ta sitovan domeenin, joka on niin sanottu ”hot spot” ja

TP53

geenimutaatioita [24], monistettiin nested-PCR: llä. Ensimmäisen PCR-kierroksen, 3 ui DNA uutettiin kustakin mikropaloitelluista näytettä lisättiin lopulliseen 50 ui PCR-seosta sisältäen 2,25 mM MgCl

2, 0,2 U /ul Taq Gold -polymeraasia (Ampli Taq Gold, Applied Biosystems, Roche) , 0,2 mM dNTP ja 12:02 /ul alukkeita (Eurogentec, Liège, Belgia) (taulukko 2). Alkuinkubointi 95 ° C: ssa 4 minuutin ajan seurasi 25 sykliä (95 ° C 30 sekuntia, 60 ° C, paitsi eksoni 7, jossa hehkutus lämpötila oli 55 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C 1 min) ja lopullinen venymä 7 min 72 ° C: ssa. Toinen PCR kierros suoritettiin 2,5 ui ensimmäistä PCR-tuotetta käyttäen samoja olosuhteita kuin ensimmäisellä kierroksella, paitsi että 1,5 mM MgCI

2 ja 0,4 U /ul Taq Gold polymeraasia käytettiin eksonin 6. ultrapuhdasta vettä käytettiin negatiivisena kontrollina taas DNA: ta ulkopuoliselta verinäytteistä käytettiin kontrollina

TP53

vahvistusta.

Sekvenssianalyysissa

monistetut tuotteet puhdistettiin käyttämällä MSB Spin PCRapace kit (STRATEC Molecular GmbH, Berliini, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Sekvenssianalyysi suoritettiin automaattisella ABI 377 laitteistossa (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen Taq Dye deoksi Terminator Cycle Sequencing Kit samalta valmistajalta ja mukaan sen ohjeita.

TP53

viittaus sekvenssin Genbank oli NC_000017.10.

Arvio mahdollisten

TP53

-artifactual muutoksia kudosnäytteistä

(a) Arvioidaan kyky nykyisen mikrodissektion menettelyn tunnistaa DNA mutaatioita, neljä kolorektaalisista adenokarsinoomat aiemmin tutkittu

kras

mutaation rutiininomaisesti kliinisten tutkimusten FFPE (Formaliinifiksoidusta parafinoidut) kudosnäytteiden valittiin. Kaksi niistä suoritetaan mutaation ja kaksi villityypin. Nämä neljä näytettä valittiin, koska snap-jäädytetty vastine pidettiin varastoitiin -70 ° C: ssa Cancer Human Bio-pankki Leuvenin yliopistossa (https://www.uclouvain.be/416846.html). Laser mikrodissektion ja DNA uuttamalla snap-pakastetut adenokarsinooman näytteet tehtiin käyttäen edellä kuvattua ja tulokset

kras

testaus verrattiin. Lisäksi snap jäädytetty granulosa-kasvain näyte 15-vuotias nuori tyttö Li-Fraumeni oireyhtymä analysoitiin käyttämällä samaa mikrodissektion menettelyä. Vaikka perustuslaillinen mutaatio oli jo todettu FASAY (toiminnallinen analyysi erillään alleelien hiiva) on

TP53

mRNA uutetaan perifeerisen mononukleaaristen potilaan solujen [25], tuumorinäytesylinterin tutkittiin edelleen vahvistaa kyky nykyisen mikrodissektion menettely tunnistaa oikein tämä

TP53

mutaatio jääleikkeille kasvain.

(b) Onko pikajäädytettiin kudosleikkeiden voi vaikuttaa laser aiheuttama vaikutus on ei tiedetä ja se voi jopa pahentaa muita häiritseviä tekijöitä, kuten haitallinen vaikutus tallennuksesta, värjäys ja /tai sisäkkäisiä-PCR menettelyjä. Jättää tällaiset teknologiset bias, kirurgiset virtsajohdin näytteet kerättiin jälkeen nephroureterectomies (n = 4) otettujen munuaisten istutetut potilaiden kroonista munuaisten vajaatoimintaa johtuen PKD (n = 2), krooninen idiopaattinen interstitiaalinen nefriitti ehdottomasti liity AA nieleminen (n = 1 ), ja diabeettinen glomeruloskleroosi (n = 1). Nämä näytteet välittömästi upotettiin Tissue-Tek ja pikajäädytettiin, ja urothelial alueet käsiteltiin samanaikaisesti kolmella eri tavalla. Mikrodissektion suoritettiin kaksi eri vahvuisia (alhainen keskimääräinen UV-energia: 68, ja korkea keskimääräinen UV-energia: 69,4) ja myöhemmin käsitellä kuten raportoitu täällä AAN-potilaan näytteitä. Vertailun vuoksi ylimääräinen sarja osat samalta virtsajohdin näytteestä tehtiin yksinkertainen dia naarmuuntumista kuin suoritettiin

KRAS

rutiini mutaatio testaus FFPE kudosnäytteet. DNA: n uutto, monistus ja

TP53

sekvensointi suoritettiin menetelmällä kuvattu tässä artikkelissa.

(c) Koska muita valvonta AA-jotka eivät liity

TP53

keinotekoista muutoksiin mahdollisesti aiheuttama nykyisen analyysin mukaan fenasetiini aiheuttama urothelial karsinooma joka on tiettävästi ominaista puuttuminen A T transversioita

TP53

geeni [26] poistettiin alemmasta virtsajohdin on 64 vuotta vanha nainen, upotettu Tissue-Tek, pikajäädytettiin nestemäisessä typessä jäähdytettyä 2-metyylibutaani (isopentaani) ja säilytettiin -70 ° C: ssa. IHC, mikrodissektion, DNA: n eristämiseksi ja

TP53

sekvensointi suoritettiin menetelmien mukaisesti edellä kuvattu.

Arvio toteamisraja Sangerin sekvensointia

määritysrajan tutkimuksen DNA uutettiin kahdesta Pään ja kaulan Okasolusyöpä solulinjoja (SC173 ja SC263, ystävällisesti AC Begg, Alankomaat Cancer Institute, Alankomaat) kuljettaa eri

TP53

mutaatioita ja villin tyypin

TP53

HNSCC solulinja (HN30, ystävällisesti M. Flinterman osasto suulääketiede ja patologia, Kings College London, The Rain Institute, UK). Luonnehdinta

TP53

tila aiemmin suoritettiin meidän laboratoriossamme käyttämällä FASAY analyysi [25]. SC173 kantaa missensemutaatio eksonissa 5: R175H (CGC CAC). SC263 esittelee yhdiste heterotsygoottinen muutos, johon liittyy nonsense-mutaatio R306X eksonissa 8 (CGA TGA) ja 32 emäsparin deleetio eksonissa 7 (del 704-735) (CTMA laboratoriotuloksia). DNA sekä

TP53

mutatoituja soluja laimennettiin sarjana, ja piikki villin tyypin solun DNA: han on 50-1,25% mutantin villityypin DNA-suhteet. Vahvistusta ja sekvenssianalyysi suoritettiin edellä kuvatulla tavalla.

Vertaileva tilastollinen analyysi määrä ja tyyppi mutaatioiden nykyisen ja edellisen tietojen

Poisson regressiomalli rakennettiin vertailla yleisyys ja tyyppi ( A T ja G T)

TP53

mutaatioita p53 sitoutumiskohdassa lyhyt- (n = 5) ja edellinen [BEN (n = 11 ja n = 97) ja Taiwanin (n = 151)] kliininen sarja [11], [12], [14], ja verrata tuloksia tämän analyysin kanssa sairastavien potilaiden urothelial maligniteetteja (rakko, virtsajohdin, ylempi virtsateiden ja munuaisaltaan) (n = 1111), kuten raportoitu

TP53

IARC tietokantaan [27]. On syytä huomata, että data liittyy AA altistumisesta heitettiin pois maasta

TP53

IARC tietokannan tuloksia.

Tulokset

Arvio mahdollisten keinotekoista

TP53

muutoksia kudosnäytteet

Käyttämällä mikrodissektion menettely mahdollisti oikea tunnistaminen tunnetuista DNA mutaatiot ominaista edellinen rutiinikokeisiin. Tunnistamista koskevia

KRAS

mutaatioiden snap-jäädytetty adenokarsinoomat, tulokset olivat täsmälleen samoja kuin aikaisemmin saatu FFPE näytteistä (ts tunnistaminen G12S ja G12D mutaatioita

kras

mutatoitunut kudoksia ja villityypin asema kahdessa muussa kasvaimia). Mitä tunnistaminen perustuslaillinen g.13380 G A, p.R248Q mutaatio tunnistaa FASAY määritys ääreisverisoluissa potilaan Li-Fraumeni oireyhtymä, tämä mutaatio löytyi myös pahanlaatuisia soluja follikkeliepiteelisolujen kasvain käyttäen DNA: n eristämiseksi, mikrodissektion, sisäkkäisiä-PCR ja sekvensointi menettelyjä käytetään esillä olevassa tutkimuksessa.

Käänteisesti ei keinotekoista

TP53

muutoksia löytyivät eri tarkastukset suorittaa testata esiintyminen

TP53

DNA aiheuttama vaurio liittyvät DNA: n eristämiseksi, mikrodissektion, sisäkkäisiä-PCR ja sekvensointi menettelyjä. Ei mutaatioita löydettiin kolme neljästä ureter näytettä testata

TP53

iatrogeeninen vaurioita. Ainoa poikkeus oli virtsajohdin näyte tyypin 2 diabeetikko kanssa G Siirtymä (g.12455, p.R156H) eksonin 5

TP53

geenin jälkeen mikrodissektion kovassa laser teho. Ei mutaatioita löydettiin p53 DNA: ta sitovan domeenin (eksonit 5-8), kun analysoidaan DNA on uutettu fenasetiirii aiheuttama urothelial karsinooma.

Arvio toteamisraja Sangerin sekvensointia

Raja havaitsemista varten Sangerin sekvensointia tunnistettiin 6,25% mutantin villityypin DNA-suhde sekä

TP53

mutatoitu solulinjat, riippumatta siitä, mutaation tai deleetion arvioitu. Tällä DNA suhde, heterotsygoottinen A /G-piikki, jonka sarja- DNA laimennokset SC173 /HN30 sekoitettu DNA: t oli vielä nähtävissä oli myös heterotsygoottinen T ja C piikin yhdistettynä 32 emäsparin deleetio 7. eksonissa joiden sarjanumero DNA laimennokset SC263 /HN30 sekoitettu DNA: t.

Morfologia

Kaikki p53 positiiviset alueet vastasi papillaarisen TCC tai iVy sisältäviä anaplastinen ja Dysplasiasoluissa (taulukko 1). Sisäiset urothelial ja lamina propria tulehdus, hyperplasia ja reaktiivinen atypia olivat poissa. Potilaalla 2, neoplastiset ja dysplastiset solut kiinni tyvikalvon (takertuu CIS).

TP53 geenimutaatioita

Sisältää kaksi aiemmin raportoituihin [10], yhteensä 16 täysin erilaista eksoni (n = 13) tai introni (n = 3) mutaatiot

TP53

geenin havaittiin pahanlaatuisten urothelial kudoksissa Belgian AAN kohortin (taulukko 1). Potilaalla 1, kaksi mutaatiota löytyivät saman eksonin (eksoni 7), kun taas yksi mutaatio havaittiin potilaalla 2 (eksoni 5) ja 3 (introni 7). Potilaat 4 ja 5 kanna 5 eri eksoni ja yksi introni mutaatioita. Niistä 13 eksoni mutaatiot, kaksi oli nonsense (potilaat 2 ja 5) ja 11 missensemutaatioita (potilaat 1, 4 ja 5). Ne sijaitsivat eksonissa 5 (3 mutaatiota), eksonin 6 (3 mutaatiota), eksonin 7 (3 mutaatiot) tai eksonin 8 (4 mutaatiota). Yksi kolmesta introni mutaatiota (g.12627 A T, potilas 5), oli sijoitettu AG akseptorisilmukointikohdan. Maailmanlaajuisesti mutaatiot vaikuttavat A:T paria (7/16) ja G:C parit (9/16). Oli lähes yhtä suuri määrä siirtymiä (7/16) ja transversiot (9/16). Transitions (7/16) esiintyi todellakin samanlaisella taajuudella A:T paria (3/16) ja G:C parit (4/16). A G, G A ja C T (2/16) esiintyi yhtä usein kuin T C (1/16). Vastaavasti transversioita (9/16) havaittiin A:T paria (4/16) ja G:C parit (5/16) jakautuvat seuraavasti: A T (3/16), G T (3/16 ), G C (2/16) ja A C (1/16).

Vertaileva tilastollinen analyysi määrä ja tyyppi mutaatioiden nykyisen ja edellisen tietojen

Poisson regressiomalli osoittivat erittäin merkitsevä (p 0,001) suhteellinen kasvu on

TP53

mutaatio esiintyvyys p53 hotspot kodonit nykyisen kliinisen sarja, verrattuna IARC tietokannan tuloksiin (taulukko 3). Sen sijaan merkittävä suhteellinen lasku todettiin sekä BEN (n = 97) [12] ja Taiwanin (n = 151) [14] kliininen sarjaan verrattuna IARC ja nykyisten kliinisten tietojen (taulukko 3). Ei-merkitsevä (p 0,05) suhteellinen lasku /nousu havaittiin BEN (n = 11) [11] verrattuna IARC ja nykyisten kliinisten tietojen (taulukko 3).

Mitä lukumäärä A T transversion potilasta kohden, merkittävä suhteellinen kasvu todettiin nykyisessä molemmat BEN [11], [12], ja Taiwanin [14] kliininen sarja, verrattuna IARC tietokannan tuloksiin (taulukko 4). Ei-merkitsevä (p 0,05) tuloksia saatiin, kun edellinen AAN ja nykyisen kliinisen sarja verrattiin (taulukko 4).

Verrattuna IARC tietokantatulosten merkittävä 5,85 lisäystä G T yleisyys havaittiin, nykyisessä kliinisessä sarja (taulukko 5). Ei G T transversio todettiin kummassakin BEN sarjassa. Mitä Taiwanin sarja, oli ei-merkitsevä suhteellinen lasku G T yleisyys verrattuna IARC tietoja tällaiset lasku oli erittäin merkitsevä verrattuna nykyisiin tuloksiin (taulukko 5).

Keskustelu

Tämä on ensimmäinen raportti mutaatioprosessiin kirjo

TP53

tuumorisuppressorigeeniä sarjassa belgialaisen potilaista (n = 5), jossa dokumentoidaan AAN ja myöhempää kehitystä TCC ylemmässä virtsateiden yhdessä virtsarakon osallistumista yksi heistä. Neljä niistä oli seurannut AA-saastunut laihdutusruokavalioon ja yksi evätä altistuminen AA samalla esittää tyypillistä munuaisten histologia sidekudoslisää [20] kanssa AL-DNA addukteja [18].

Käyttämällä yksinomaan jäädytettyjen näytteiden ehdoton edellytys riittävän hyvät verrattuna raportoitujen tietojen. Paitsi viidessä 11 potilaille, joille formaliinikiinnitetyt parafiiniin upotetut kudokset käytettiin [11], kaikki suuret

TP53

geneettisiä tutkimuksia tapauksissa, joilla oli AA aiheuttama genotoksisuuden ja urothelial maligniteettia todellakin johti käyttäen tuore kudoksia [11], [12], [14]. Toisaalta tavoitteena oli välttää tunnettuja haitallisia vaikutuksia formaliinia kiinnityksen suhteen DNA laadun ja luonnehdinta kudoksen mutaatiostatuksesta riippumatta [28]. Sen todistamiseksi, että

TP53

mutaatioita ei johtunut teknologisia artefakteja käytettäessä jäädytetty osassa erityistä huomiota kiinnitettiin perusteellinen validointitavat. Nykyinen

TP53

testaus perättäisten vaiheiden (eli laser kaapata mikrodissektion kasvainsolujen jälkeen toluidiinisinivärjäystä, DNA: n eristämiseksi, sisäkkäisiä-PCR-monistus ja sekvensointi). Tämä menetelmä ei tuottanut vääriin negatiivisiin tuloksiin. Se mahdollisti todellakin oikea tunnistaminen tunnettuja

KRAS

onkogeeninen mutaatioita adenokarsinooman. Lisäksi se mahdollisti oikea tunnistaminen aikaisemmin tunnettu

TP53

perustuslailliset mutaatio liittyy Li-Fraumeni oireyhtymä. Tämä mutaatio havaittiin kasvainsoluissa kun edellisen luonnehdinta suoritettiin toiminnallisen määrityksen perifeerisiin mononukleaarisoluissa.

Samalla nykyinen menettely ei luoda vääriä positiivisia tuloksia analysoitaessa normaali virtsanjohdin kerätyt näytteet jälkeen nephroureterectomy vuonna potilaille, joilla on AA-etuyhteydettömien sairauksia tai fenasetiini aiheuttama syöpä, ja ottaen nykyiseen tavanomaiseen genotyypityksen kuten kultakantaan. Tämä koski myös suoritettaessa laser kaapata mikrodissektion korkean intensiteetin. Ainoa mutaatio todettiin yksi G Siirtymä (g.12455, p.R156H) kudoksen näyte tyypin 2 diabeetikko ilman historiaa neoplasia. Kiinnostaa, ei ole mitään merkittävää eroa esiintyvyys G siirtyminen väestössä ja tyypin 2 diabeetikoilla [29]. Arvioituna sarjalaimennoksia

TP53

muuntunut DNA, detektioraja nykyisen genotyypityksen menettely oli 6,25% mutanttien villityyppiseen suhde.

Mielenkiintoista, kaikki potilaat nykyisestä sarja oli naisia ​​ja jokainen niistä esittää vähintään yhden

TP53

mutaatio niiden pahanlaatuinen urothelial kudoksiin taas tasapainoisempi mies /nainen suhde havaittiin (53% /47%) aiemmissa tutkimuksissa [11], [14] . Aikaisemmissa tutkimuksissa raportoitu esiintyvyys potilailla, joilla on

TP53

hotspot mutaation vaihteli 100% (11/11 Ben potilasta) [11] 37% (36/97 Ben kasvaimet) [12], tai 47% ( 71/151) Taiwanin AA-potilailla [14]. Ottaen huomioon, että vain yksi potilas raportoitu kanssa quintuple mutaatio IARC tietokantaan, nykyinen havainto, että 40% (2/5) potilaista tunsivat useita

TP53

mutaatioita, joista jokaisella on kuusi erilaista mutaatiota (viisi eksoni ja yksi Introniset mutaatioita, joista yksi silmukointikohtamutaatio potilaan 5) oli silmiinpistävää ja hyvin epätavallinen havainto. On myös mielenkiintoista huomata, että tämä viisikko mutaatio havaittiin myös BEN sarjassa [12], joka on yksi tähän asti suurimmista raportoitu ihmisen joukko AA liittyvien

TP53

mutaatioita. Verrattuna tietoja muilla kuin AA: n liittyviä urothelial syöpiä IARC tietokannasta (n = 1111) ja Taiwanin sarja (n = 151), nykyinen sarja osoitti korkein suhteellinen yleistyminen mutaation ja G T transversio

TP53

hotspot alueella. Riippumatta nykyisen tai edellisen AA-sarja, esiintyvyys A T transversiosta oli merkittävästi ja johdonmukaisesti suurempi kuin IARC tietokantaan [27]. Meidän havainto vahvistaa, että numero ja profiilia

TP53

mutaatioiden potilasta kohden on erittäin epätavallista, mikä johtuu todennäköisesti äkillinen erittäin myrkyllisiä altistumista. Ovatko nämä lukuisat mutaatiot esiintyi eri pahanlaatuisia klooneja ei arvioitu. Kuitenkin useita eri kasvaimeen liittyvien alueiden tämän monimutkaisen mutaatiostatuksesta spektrin varmasti kuvastaa laaja sisällä kasvaimen heterogeenisyys poly- tai multiclonal pahanlaatuisten urothelial soluja.

Katse yksityiskohtia tyypistä hotspot mutaatio tässä tutkimuksessa piste mutaatiot A:T paria olivat yhtä usein kuin nyt G:C paria (7/16 vs. 9/16, tässä järjestyksessä). Ne hallitsevat transversioita A T ja G T osuus kumpikin 18,7% (3/16) kaikista

TP53

mutaatioita. Mielenkiintoista, A T transversio ihmisen AA liittyvää urothelial kasvain raportoitiin ensimmäisen kerran UK potilaalla [30], mutta A T transversiosta sitten usein todettu p53 hotspot alue urothelial syöpäliitteinen Balkanin endeeminen munuaissairauden (BEN) [ ,,,0],11], [12], sekä Taiwan [14]. Kaikissa näissä tutkimuksissa väestö altistuu AA monta vuotta, luvut peräti 66% (33/50) ja 72% (13/18) ja 55% (46/84) kaikista

TP53

mutaatioita, vastaavasti. Nykyisessä sarjassa, yksi kasvain useita

TP53

mutaatioita kanna kaksi A T transversiot, ominaisuus myös yleisesti raportoitu BEN ja Taiwanin sarja [11], [12], [14].