Krooninen sairaus

tiivistelmä

endobronkiaalinen Ultraääni Opastettu Transbronchial punktiomenetelmällä (EBUS-TBNA) ja Trans-ruokatorven Ultraääni skannaus Fine neula pyrkimys (EUS-STT) ovat tärkeitä, uusia tekniikoita diagnostiikkaan ja lavastus ei-pienisoluisen keuhkosyöpä (NSCLC), joka on sisällytetty keuhkosyöpään lavastus ohjeita. Ohjata ja optimoida hoitopäätöksiä, erityisesti pienisoluista keuhkosyöpää vaiheessa III ja IV,

EGFR

ja

KRAS

mutaatiostatus on usein tarpeen. Konkordanssi nopeus mutaation analyysi näiden Sytologisten imee mukaansa ja histologisten näytteiden saatu kirurginen lavastus on tuntematon. Siksi tutkimme, missä määrin alleelispesifinen kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR hydrolyysikoettimesta voitaisiin luotettavasti suorittaa EBUS ja EUS hieno neula aspiraattien vertaamalla tuloksia histologisia materiaalia samasta potilaasta. Analysoimme sarja 43 NSCLC potilaille, joille Sytologisten ja histologiset materiaali oli saatavilla. Olemme osoittaneet, että näillä standardi molekyyli- tekniikoita voidaan levittää tarkasti hienoksi neula Sytologisten aspiraateissa NSCLC potilaiden. Mikä tärkeintä, me osoitamme, että kaikki mutaatiot havaittu histologisia materiaali primaarituumorin havaittiin myös sytologista näytteissä. Olemme päätellä, että molekyyli profilointia voidaan luotettavasti suorittaa hienoksi neula sytologia aspiraateissa pienisoluista keuhkosyöpää.

Citation: van Eijk R, Licht J, Schrumpf M, Talebian Yazdi M, Ruano D, Forte GI, et al. (2011) Rapid

KRAS

,

EGFR

,

BRAF

ja

PIK3CA

mutaatio analyysi Fine Needle Aspiraatit Vahinkovakuutustoiminnan pienisoluinen keuhkosyöpä käyttäminen alleelispesifisen qPCR. PLoS ONE 6 (3): e17791. doi: 10,1371 /journal.pone.0017791

Editor: Ralf Krahe, University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 lokakuu 2010; Hyväksytty: 11 helmikuu 2011; Julkaistu: 08 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 van Eijk et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Leidenin yliopiston Medical Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolleisuus länsimaissa [1]. Kliinisiin ja terapeuttisiin tarkoituksiin, keuhkosyöpä on perinteisesti jaettu pienisoluinen (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Kun taas SCLC käsitellään kemo- ja /tai sädehoitoa, NSCLC ensisijaisesti käsitellä kautta resektiota; Kuitenkin vain 30% NSCLC potilaista on kokoisen sairaus (vaihe I /II) aikaan esityksen [2]. Tämä korostaa tarkkojen, leikkausta edeltävän välikarsinan lavastus estämään tarpeettomia poisleikatuista. Preoperatiivinen lavastus voidaan suorittaa kautta transbronchial (EBUS-TBNA) tai transesofageaalista (EUS-STT) toive välikarsinan imusolmukkeiden. Nämä sytologinen menettelyt ovat vähemmän invasiivisia kuin rutiini mediastinoscopy seuraa biopsia imusolmukkeiden, mutta samanlaisia ​​korkea spesifisyys ja herkkyys [3] – [9] saavutetaan. Endosonography on sisällytetty keuhkosyöpään pysähdyspaikan suuntaviivat vaihtoehtona kirurgisen lavastus välikarsinan [10], [11].

Monissa tapauksissa, lisääntynyt käyttö näiden vähän invasiivisia menetelmiä on riittävä diagnosoida ja vaiheessa potilas oikein. Vaikka määrä huokoisen materiaalin saatu näitä menettelyjä on suhteellisen pieni, pyytämiä tietoja kliinikot kasvaa nopeasti, käytetään esimerkiksi NSCLC, immunohistokemia ja molekyylitason patologia on tullut osa standardin hoidon [12].

tämän lisäksi muutoksen pysähdyspaikan menettelyissä, nopea kehitys uusien lääketieteellisten hoitojen pienisoluista keuhkosyöpää on tapahtunut. Osajoukko NSCLC syöpien hautoisi aktivoivaa mutaatiota EGFR kinaasidomeenista [13]. Kasvaimet nämä mutaatiot ovat usein herkkiä tyrosiinikinaasiestäjät (TKI). Toisaalta, aktivoivat mutaatiot

KRAS

liittyvät vastustuskyvyn TKI. Vaikka useimmissa julkaisuissa ilmoittaa, että nämä mutaatiot ovat toisensa poissulkevia [14] – [19], todisteet osoittavat [20], että kasvain voi samanaikaisesti satama aktivoiva

EGFR

mutaatio ja mutaatiot myötävirtaan koulutusjakson

KRAS

-geeni, joka tarkoittaa sitä, että ylävirtaan EGFR ei ole terapeuttista vaikutusta näissä tapauksissa. Myös mutaatiot

BRAF

ja

PIK3CA

raportoidaan NSCLC. Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään missä määrin nämä mutaatiot voivat vaikuttaa hoitoon [21], [22].

Koska tätä kehitystä ja halu potilaat ja lääkärit minimoida viive hoidon , nopea ja herkkä molekyylitekniikkaa tarvitaan. Edullisesti näitä tekniikoita olisi sovellettava formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) Sytologisten näytteitä [23] – [25], koska EBUS-TBNA ja EUS-FNA toive näytteet ovat usein ensimmäinen materiaali, joka on hankittu potilailta NSCLC. Alleelispesifisen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qPCR) ja koettimien hydrolyysiä, on luotettava ja herkkä menetelmä, jota voidaan käyttää tähän tarkoitukseen. Mutaatioiden havaitsemiseksi

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

kanssa hydrolyysikoettimesta on aiemmin kuvattu pienisoluista keuhkosyöpää [23] – [26 ]. Herkkyys määritykset myös ylittää 1% herkkyys ehdotus asetettu

KRAS

mutaatio testaus [27].

Suurin osa

EGFR

mutaatiot ovat p.L858R, The hotspot eksonissa 21 ja poistot eksonissa 19, mikä on raportoitu käsittää jopa 36% kaikista aktivoivia mutaatioita [15], [28].

KRAS

on mutatoitunut 10% -30% keuhkojen karsinoomat ja yli 95% kaikista aktivoivia mutaatioita

KRAS

sijaitsevat eksonin 1 (kodonit 12 ja 13) [28], [ ,,,0],29].

BRAF

p.V600E hotspot mutaatio on raportoitu 3% NSCLC ja muuttaa jäännökset tärkeitä AKT-välitteinen BRAF fosforylaation, mikä viittaa siihen, että häiriöt AKT aiheuttaman BRAF esto on rooli pahanlaatuisiksi [28] , [30]. Kolme hotspot mutaatiot

PIK3CA

voi olla toinen syy yli-aktivointi PI3K-AKT-reitin, joka edistää pahanlaatuisiin ihmisen hengitysteiden epiteelisolujen ja on raportoitu noin 4% keuhkokarsinoomista [28 ], [31].

nykyisessä tutkimuksessa vertasimme alleelispesifinen qPCR määritykset yleisin aktivoivat mutaatiot

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

kasvaimia positiivinen ohuella neulalla sytologisten aspiraattien vastaan ​​histologisia materiaali primaarikasvainten.

tämä lähestymistapa, me haluttiin selvittää, missä määrin alleelispesifisen qPCR kanssa hydrolyysikoettimesta voidaan suorittaa sytologisten pyrkimys materiaalista vertaamalla mutaatiostatus ja sitten tarkkailemalla vastaavuutta välinen kurssi sytologista ja histologisia materiaalin välillä ensisijaisen kasvaimia ja etäpesäkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Erityinen tarve eettisen komitean hyväksyntä ei ollut välttämätön tätä tutkimusta varten. Kaikki näytteet käsitellään mukaisesti lääketieteellisen eettisiä ohjeita kuvattu Code oikea Toissijainen käyttö Human Tissue perustettu hollantilainen Federation of Medical Sciences (www.federa.org, näytetty 27 lokakuu 2010). Niinpä näiden ohjeiden kaikkien ihmisten materiaalia käytettiin tässä tutkimuksessa on nimettömiksi koska kliiniset tiedot ei ole käytetty. Tämän vuoksi nimettömäksi menettelyn yksittäisten potilaiden lupaa ei tarvita.

Näytteiden valinta

Materiaalia 43 potilasta NSCLC, joille sekä kasvain-positiivisia Sytologisten ja histologiset materiaali saatavissa valittiin osaston Patologian vuonna Leiden University Medical Center (LUMC) ja jotka oli valittu PALGA tietokantahaku; ei-gynecologic Sytologisten näytteitä vuosina 2005 ja 2009 etsittiin käyttämällä hakua-jouset ”keuhko-, pahanlaatuiset solut ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä” ja ”välikarsinassa, pahanlaatuiset solut ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä”. Vuodesta 447 ainutlaatuinen sytologisen näytteitä, valitsimme tapausta, joiden kasvain-positiiviset histologiset materiaali primaarikasvaimen oli myös saatavilla (Täydentävä taulukko S1). Niistä 43 potilasta, 33 potilasta aliluokitusta: 14 okasolukarsinoomia, 15 adenokarsinoomat, 3 adenosquamous karsinoomat ja 1 iso cell carcinoma. Loput 10 potilasta oli luokiteltu NSCLC vain.

DNA 42 ohjaus FFPE näytteitä saatiin Molecular Diagnostics (MD) osa Patologian osasto on LUMC. Validointitarkoituksissa, sarja 10 DNA-näytteitä, joista 9 oli osoittanut

EGFR

eksonin 19 deleetio DNA- sekvensoinnilla, saatiin Alankomaiden Cancer Institute – Antoni van Leeuwenhoek sairaalassa.

DNA: n eristä-

Ennen DNA: n eristä-, kasvaimen solut rikastetaan saamiseksi kasvainsolujen prosenttiosuudet 70% (kuvio 1). FFPE kasvainkudospalasta rikastettiin kasvainsolujen ohjaa hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 35 (tietoja ei esitetty); siksi, että myöhemmissä määrityksissä, käytimme 5 × varastossa DNA laimennoksia steriiliin veteen.

Mutaatio tunnistus

assay seitsemän eri

KRAS

, kolme

PIK3CA

ja yksi

BRAF

variantti saatiin läpi Custom TaqMan® Assay suunnittelu Tool (Applied Biosystems, Nieuwerkerk a /d IJssel, NL). Hydrolyysikoettimia suunniteltiin pieniä Grove sideaine (KTK) muutostöissä 3′-päähän. Nämä modifioidut koettimet on se etu, että suhteellisen lyhyitä koettimia voidaan suunnitella korkeamman sulamislämpötilan (Tm) ja lisääntynyt duplex vakautta ja spesifisyys verrattuna tavanomaisiin koettimia [32].

EGFR

määritykset kuvattu aiemmin [33]. qPCR reaktiot suoritettiin 10 ul: n reaktiot sisälsi 5 ui FastStart Universal Probe Master (Roche Applied Science), 1 ui 10 x aluketta ja hydrolyysikoetin ratkaisuja, 2 ui 5 x laimennettiin DNA: ta ja 2 ui steriiliä vettä suljetussa LightCycler 480 kuopan levy, 384 (Roche Applied Science) LightCycler 480 järjestelmä (Roche Diagnostics) seuraavasti: 10 minuuttia 95 ° C: ssa ja 45 sykliä 15 sekuntia 92 ° C: ssa, 60 sekuntia 60 ° C: ssa ja 10 sekuntia 72 ° C. Sillä validointi, suoritimme suoraan Sangerin sekvensoinnilla käyttäen M13-alukkeita kuten aiemmin on kuvattu [34] on sekvensointi ytimessä Leiden Genome Technology Center. Primer sekvenssit on lueteltu Täydentävä taulukossa S2. Kaikki DNA sekvensointi valmistui tunnettuja geenejä eikä uutta sekvensointi valmistui.

Raaka dataa LC480 ohjelmisto tuotu in-house-luotu Microsoft Excel 2003 taulukkolaskenta määrittämään mutaation tila. Kvantifiointia sykli (Cq) käytettiin laadun arviointiin ja näytteitä Cq arvo ylittää 35 (Cq 35) villin tyypin kanava hylättiin ja jätetty tarkempaa analysointia. Määrittämään läsnäolo tai puuttuminen mutaation, päätepisteen fluoresenssin suhde R

m /R

paino laskettiin sen jälkeen, kun vähentämällä keskimääräinen tausta signaali kolmesta negatiivisia kontrolleja. Laskentataulukossa on saatavilla pyynnöstä. Sillä

BRAF

,

PIK3CA

ja

EGFR

p.L858R, mutaatio asema oli suoraan syrjitty (kuva 2a). Mutaatiot tunnistettiin, kun R

m /R

paino- suhde oli suurempi kuin 0,7, kun taas suhde pienempi kuin 0,3 ei ollut osoitettavissa mutaatio. Ei väliarvojen havaittu. Vuonna

KRAS

villityypin näytteitä, suurentunut tausta signaali havaittiin c.34G T (R

m /R

p ± 0,4) ja c.38G C (R

m /R

p ± 0,6) määritystä mutantti koetin kanavan. Tämä oli luultavasti johtuu epätäydellisestä näiden koettimien hybridisaatio villin tyypin alleelin. Asetus tunnistaa mutaation oikein oli c.34G TR

m /R

p 0,7, kun taas c.38G T mutantti tunnistettiin kun R

m /R

p suhde cut-off 0,8 käytettiin.

EGFR

eksonin 19 deleetio koetin johti lasku päätepisteen fluoresenssin, kun taas villityypin näyte, molemmat koettimet antoi signaalin. Analysoida

EGFR

eksonin 19 poistot, R

m /R

p 0,8 ja Cq 32 katsottiin villityypin ja R

m /R

wt≤0.6 ja Cq 32 osoitti poisto. Väliarvot, jossa R

m /R

p suhde 0,6 ja 0,8 ja Cq 35, tarvitaan vahvistusta käyttäen Sangerin sekvensointia.

Paneeli A esittää EGFR p.L858R määrityksessä. Kaikki näytteet osoittavat villityypin (valvonta) signaali, VIC, alapaneeli (vihreät ja siniset viivat), kun taas vain ryhmä 2 (sininen viiva) esittää mutantti FAM signaalia. Paneeli B esittää EGFR eksonin 19 mutaatiokokeessa. Alempi paneeli esittää villityypin VIC signaali kaikille näytteille (punainen, vihreä ja violetti linjat). Top paneelit osoittaa mutantti FAM signaalia. Ryhmä 1 (punaiset viivat) esittää villityyppisen signaali, ryhmä 2 (punainen ja violetti) näyttää mahdolliset mutanttien kanssa laski fluoresenssi, ryhmä 3 (vihreä linja) esittävät lähes kokonaan hävinnyt signaali ilmaisee poisto. Kuvat saadaan LC480 ohjelmistoversion 1.5.0. Y-akseli esittää suhteellisen fluoresenssi FAM (465-510 nm) ja VIC (533-580nm) koettimia, x-akseli esittää PCR-sykliä.

Tulokset ja keskustelu

Pitoisuus suunnittelu ja validointi

BRAF

, yksi määritys suunniteltiin joka havaitsee aktivoiva hotspot mutaatio p.V600E, joka johtuu c.1799T Korvaushoidon [35]. Sillä

PIK3CA

, suunnittelimme koettimia kolme yleisintä vaihdot [36]: c.1624G A (p.E542K), c.1633G A (p.E545K) ja c.3140A G ( p.H1047R). Vaikka näitä kolmea määrityksissä havaittiin yli 85% kaikista mutaatioiden NSCLC, jotkut harvoin substituutioiden hotspot alueilla oli mahdollisesti menetetty. Sillä

KRAS

, suunnittelimme määrityksiä varten seitsemän yleisin emäsparisubstituutiot kodoneissa 12 ja 13: c.34G A (p.G12S), c.34G C, (p.G12R), c .34G T, (p.G12C), c.35G A (p.G12D), c.35G C, (p.G12A), c.35G T (p.G12V) ja c.38G A (p.G13D). Yhdessä nämä määritykset havaitsemaan lähes kaikki substituutiot

KRAS

, vaikka joitakin harvinaisia ​​muunnoksia saattavat jäädä huomaamatta. Havaitsemaan p.L858R hotspot ja eksonin 19 poistot on

EGFR

käytimme aiemmin raportoitu määrityksissä [33].

EGFR

p.L858R mutaatio havaittiin käyttämällä koetinta yhdistelmä, joka sisältää villityypin koettimen ja kaksi erilaista mutantti koettimia: yksi yleisimmistä variantti (c.2573T G), ja yksi harvinainen monimutkainen c .2573_2574TG GT käännellen.

hotspot mutaation analyysi sytologia materiaalia pienisoluista keuhkosyöpää

Vastatakseen missä määrin mutaation analyysi voidaan luotettavasti suorittaa EBUS-TBNA ja EUS-FNA toive materiaali teimme 13 määritykset 43 potilasta NSCLC, joille sekä primaarikasvaimen (joko koepaloja tai histologisia materiaalia asemointia) ja kasvaimeen positiivinen sytologisten materiaalia oli kerätty. Materiaali alkaen 43 potilaista edustaa 29 kudosta porausnäytteistä histologinen excisions, 23 mikropaloitelluista koepaloja ja 3 koko-osiossa koepaloja joita verrattiin 45 mikropaloitelluista Sytologisten smears ja 17 mikropaloitelluista Aikasolujen (Täydentävä taulukko S1).

Kuudella potilaalla esitetään

KRAS

mutaatio: c.34G T (N = 2), c.34G A, c.35G A, c.35G C ja c.38G . Yksi potilas suorittaa deleetion eksonissa 19

EGFR

(c.2238_2252del15) ja kaksi potilasta osoitti

PIK3CA

mutaatiot: c.1633G A ja c.3140A G. Jälkimmäinen tapaus osoitti ylimääräinen

KRAS

mutaatio (p.34G T). Ei mutaatiot

BRAF

havaittiin.

Joillekin potilaille, useita histologiset ja /tai sytologiseen näytettä analysoitiin. Eri näytteet saman potilaan, ristiriitaisia ​​tuloksia saman tyyppistä materiaalia ei havaittu koskaan. Siksi taulukossa 1 kullekin potilaalle on edustettuna vain kerran, jos kunkin materiaalin tiedot kaikista potilaan näytteet yhdistetään. Tämä tarkoittaa, että selkein signaali kutakin määritystä varten olivat etusijalla. Taulukossa 1, loput puuttuvat puhelut, alhaisen signaaleja on merkitty ”?”.

yleinen verokanta on 13 määrityksissä, sulautumisen jälkeen, määrä on 95% (58 määrittelemätön mahdollisia tuloksia 1118 testiä). Puhelutaajuuden histologista materiaali on huomattavasti korkeampi 99% (8 määrittämätön ulos 559) kuin Sytologisten materiaalia 91% (48 out of 559). Sisällä sytologinen materiaali, puhelutaajuuden ensisijaisen kasvaimia on pienempi (84%) kuin metastaaseja (96%). Huomaa, että nämä havainnot ovat edelleen, jos potilas, jolla on pienin laadukkaita tuloksia (näyte 21) poistetaan. Sisällä histologinen materiaali saman eron puhelutaajuuden voidaan havaita, mutta on huomattavasti alhaisempi (98% primaarikasvainten vs. 99% etäpesäkkeitä). Verrattaessa puhelun hinnat per määritystä havaitsimme, että kolme määritykset

PIK3CA

geeni suoritetaan vähemmän (välillä 88 ja 91%) kuin muut 10 määritykset (välillä 94 ja 99%).

Kuten voitiin havaita, kun sytologisten aines saatiin primaarikasvaimia mutaatio tulokset histologian ja sytologian olivat yhtäpitäviä kaikissa tapauksissa, joissa molemmat tulokset määritettiin. Kun sytologinen aines saatiin etäpesäke, yhdellä potilaalla (nr 40), jossa on adenokarsinooma /bronkoalveolaarinen karsinooma (BAC), joka on KRAS c.34G Mutaatio oli tunnistettu välikarsinan imusolmuke, joka ei havaittu primaarikasvaimen. Tämä voi selittyä yleisesti havaittu geneettisiä eroavaisuuksia etäpesäke sen primaarikasvaimen. Tällöin aikaväliä 18 vuotta välillä primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä. Kaiken diskordanssi- korko on vain 0,20% (1 määritys ulos 503, jossa sekä histologisia ja sytologiseen tulokset määritetään).

Kasvainsolulinja prosenttiyksikköä ja DNA laatu

Vuodesta koepaloja ja sytologia, vain pieni kasvainkeskusten voidaan microdissected. Tämä johtaa alhainen DNA tuotto, että jos formaliinia kiinnitys, on myös huonontunut. Tutkia DNA: n laatu, vertasimme DNA: n saanto on määrityksen suorituskykyyn. Havaitsimme, että keskimääräinen määrä DNA eristettiin (295 ng) oli alempi ryhmässä (n = 15), jossa kaksi tai useampia määrityksiä epäonnistuneet [verrattuna ryhmään murtumatta määritykset (n = 102, 2973 ng)]. Kuitenkin jälkimmäisessä ryhmässä, 44% näytteistä (n = 45) oli myös DNA määrä pienempi kuin 295 ng. Tämä osoittaa, että Cq arvot ovat parempi indikaattori DNA laadun ja suorituskyvyn kuin DNA konsentraatiomittauksia.

Alleelispesifisiä qPCR kanssa hydrolyysikoettimesta on raportoitu ylittämään 1% herkkyyttä [27]. Ottaen kuitenkin huomioon, että qPCR tehokkuus riippuu myös DNA pirstoutuminen, DNA eristettiin FFPE näytteistä voidaan syystä analysoida sen herkkyys tasolle 10% [26]. Olemme määrittäneet havaitsemisraja sarjalaimennoksia DNA kahdesta kasvaimia kantavat

KRAS

c.34G T tai c.35G mutaatio. Tämä osoitti, että minimaalinen DNA panos on oltava vähintään 32 s, mikä vastaa 4-6 solujen suuren molekyylipainon DNA, jolloin Cq arvoihin 35 (kuva 3).

yläpaneelissa näyttää mutantti (FAM) signaali joukolle eri määriä panos DNA pg kuljettavat c.34G T KRAS-mutaatio. Ei ”mutantti” signaali havaitaan villityypin DNA (vihreä viiva) ja veden ohjaus (harmaa viiva). Vuonna villityypin (VIC) paneelin DNA show villityypin signaali, kun vesi ohjaus on negatiivinen (harmaa viiva). Kuvat saadaan LC480 ohjelmistoversion 1.5.0. Y-akseli esittää suhteellisen fluoresenssi FAM (465-510 nm) ja VIC (533-580nm) koettimia, x-akseli esittää PCR-sykliä.

Lisäksi olemme validoitu analyysit sarja DNA isolaattien mikropaloitelluista FFPE näytteistä, joiden tiedetään

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

tai EFGR variantteja määritettynä Sangerin sekvensoinnilla. Löysimme 100% korrelaatio hydrolyysikoettimesta määrityksissä.

validoitu määritystä varten

EGFR

eksonin 19 sarjassa 10 näytteiden mahdollinen sekvenssi varmistettiin eksonin 19 poistot ja kasvain prosenttiosuus yli 50%. Näytteet testattiin ilman tietoa mutaation aseman. Hydrolyysi määrityksen tuloksia verrattiin DNA-sekvenssin tulokset ja kaikki yhdeksän näytettä, joka sisältää eksonin 19 deleetio oli tunnistettu oikein ja erottaa villityypin näytteen (kuva 2b). Yhdessä tapauksessa, oli 18 bp: n insertio eksonissa 19. Koska tämä kuuluneet havaitseminen alueen koettimia, mutantti ei havaittu poistamista määrityksellä (SampleID 1012 Täydentävä taulukko S3). Nämä tulokset osoittavat, että kaikki hotspot mutaatiot ja

EGFR

eksoni 19 poistot voidaan havaita hydrolyysikoettimesta.

Ristireagoivuus

Mutaatiot

KRAS

ja

PIK3CA

klusteria kuormittajat. Sillä

KRAS

, kaikki seitsemän määrityksissä hybridisoitiin kodonien 12 ja 13 (nukleotidit c.34G, c.35G ja c.38G), kun taas

PIK3CA

kaksi määritys havainnut eksonin 9 muutoksia (c .1624G A ja c.1633G A). Koska koettimien mahdollisesti hybridisoitiin samalla alueella, ristireaktiivisuus eri

KRAS

tai

PIK3CA

määrityksiä voidaan havaita seurauksena lisääntyneeseen fluoresenssiin lukemien epätäydellisesti täsmäsi koettimina tai alukkeina [26 ]. Lisäksi ristireaktiivisuus saattavat johtua (harvinainen) emäsparisubstituutiot jotka eivät kuulu käytetään määrityksissä.

Cross-reaktiivisuus tutkittiin sarjassa 42 MD näytteiden kuljettaa

KRAS

mutaatio asemassa 34, 35 tai 38. yhteensä 294 määritykset (42 x 7) suoritettiin. Oikeaa mutaatio asema tunnistettiin kun R

m /R

paino- suhde cut-off 0,7 käytettiin; kuitenkin 68 määrityksissä ristireaktiivisuutta signaali havaittiin. Viisi ristireaktiivisuus signaaleja oli R

m /R

p 0,7, mutta näissä tapauksissa määritystä varten aito mutaatio oli R

m /R

p 1,0. Ristireaktiivisuutta havaittiin vain anturien kattaa saman emäsparin asemassa (asemassa 34 tai 35). Ristireagoivuus signaalien emäsparista 34 tai 35 ja kanta 38 ei havaittu (Täydentävä taulukko S4). Siksi on todennäköistä, että ei ristireaktioita vaikutuksia havaittiin kahta erilaista

PIK3CA

antureista.

Harjoittelu

kuvattuja menetelmiä voidaan toteuttaa kliinisessä työssä. Molekyyli diagnostiikka testitulokset voidaan tuottaa lyhyessä ajassa. Päivittäisessä Käytännössä sytologinen EBUS-TBNA tai EUS-STT toive materiaali morfologisesti kirjoittama patologia. Sen jälkeen näytteet ovat ryhmittyneet varten mikrodissektion viikoittain. Mikrodissektion on välttämätöntä saada korkea kasvainsolun prosenttiosuudet havaitsemaan EGFR eksonin 19 deleetio ja sallia muiden analyysien pienemmillä herkkyys kuin kuvattu menetelmä, esimerkiksi Sangerin sekvensoinnilla. Sen jälkeen DNA eristys, hydrolyysikoettimesta määritykset suoritetaan DNA laimennoksia. Lopussa toisen päivä, qPCR tulokset analysoidaan in-house-kehitetty Microsoft Excel-pohjainen analysointityökalu tulkita tuloksia, esimerkiksi, määrätä mutaation tilan kunkin anturin ja tulkitsevat vaikutus ristireaktiivisuutta. Tulokset on myöhemmin raportoitu klinikalle. Rajoituksena hotspot analyysi on määritelmän, että vain hotspot mutaatiot havaitaan, kun taas Sangerin sekvensoinnin voi tunnistaa kaikki mutaatiot PCR-amplikonin. Joissakin tapauksissa, joissa mutaatio analyysi ei täytä laatua asetukset, Sangerin sekvensointia suoritetaan. Sillä Sanger sekvensointi, extra PCR-reaktiot, reaktiotuote puhdistuksia ja elektroforeesi on tehtävä, joka vaatii kaksi ylimääräistä päivää analyysissä valmisteilla.

Johtopäätös

Olemme päätellä, että somaattinen mutaatio hotspot analyysi

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

ja

EGFR

hienoja neula toiveita välikarsinan imusolmukkeiden NSCLC potilaiden on tarkka ja luotettava. Somaattiset hotspot mutaatio-analyysi

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

ja

EGFR

voidaan luotettavasti suorittaa käyttämällä alleelispesifistä qPCR kanssa hydrolyysikoettimesta; mutaatio tulokset Sytologisten yksilöitä ja primäärikasvaimissa ovat erittäin yhdenmukaisia.

Somaattiset mutaatiot analyysi NSCLC Molekyylien lavastus ja ohjauksessa hoitopäätökset voidaan suorittaa EBUS ja EUS hieno neula aspiraatteja, menettelyjä, jotka ovat vähemmän invasiivisia potilaalle kuin rutiini mediastinoscopy.

tulokset osoittavat, että molekyyligeneettinen analyysin NSCLC olisi sisällytettävä standardin EBUS ja EUS menettelyjä. Tämä yhdistetty lähestymistapa johtaa tarkkoja diagnosoinnissa ja lavastus ne potilaat ja auttaa myös ohjaamaan optimaalisen hoitopäätöksiä erityisesti vaiheen III ja IV ei.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Yleiskatsaus.

doi: 10,1371 /journal.pone.0017791.s001

(XLS) B Taulukko S2.

Alukesekvensseillä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0017791.s002

(XLS) B Taulukko S3.

EGFR eksoni 19 validointimenettelyssä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0017791.s003

(XLS) B Taulukko S4.

Cross reaktiivisuutta KRAS määrityksissä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0017791.s004

(XLS) B

Kiitokset

Kiitämme teknikkojen Molecular Diagnostics ryhmä LUMC Patologian osasto testaamiseksi protokollia eri biologisten asetukset ja vianmääritys eri osa tutkimuksesta.