Krooninen sairaus

tiivistelmä

endoteelin riippuvaista angiogeneesistä ajatellaan olevan ratkaiseva askel syövän etenemistä. Olemme aiemmin raportoitu että etäpesäke-liittynyt paksusuolensyöpä-1 (MACC1) vaikuttivat vaskulogeeniseen mimiikka mahasyövän (GC), mutta ei tiedetä, MACC1 edistää endoteelin riippuvaista angiogeneesistä GC ja onko TWIST1 on mukana tässä prosessissa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme havainneet MACC1 ilmaisun ja mikroverisuonitiheys (MVD) by immunohistokemia 159 potilasta, joilla on vaiheen I-III GC, ja tutkittiin miten TWIST1 ja verisuonten endoteelikasvutekijä A (VEGF-A) MACC1 aiheuttama endothelium- riippuvaisia ​​angiogeneesistä käyttämällä nude-hiiriä, joissa GC-ksenografteista, ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t), jotka olivat viljeltiin yhdessä vakioitua elatusainetta yli-ilmentymisen ja häiriöitä MACC1 GC-soluja. Huomasimme, että MACC1 ilmentyminen korreloi positiivisesti lisääntynyt MVD ja kasvaimen uusiutumisen GC potilailla. GC ksenograftimalleissa, MACC1 kohonnut MVD ja voimistunut ilmentyminen VEGF-A sekä nopeutetun kasvaimen kasvua. Lisäksi, MACC1 ilmeisesti lisäsi ekspressiota TWIST1 ja indusoitiin putkimainen muodostumista HUVEC, kun taas vaimennus TWIST1 tukahdutetaan proteiinin ekspressio VEGF-A: n ja kumottiin vaikutus MACC1 on putken muodostumiseen. Meidän havainnot valottavat funktio MACC1 in endoteelin riippuva angiogeneesiä GC ja ehdottaa mahdollisia prognostista ja terapeuttista arvoa.

Citation: Wang L, Zhou R, Zhao Y, Dong S, Zhang J, Luo Y, et ai. (2016) MacCE-1 Edistää endoteelin riippuva Angiogeneesi mahasyövän aktivoimalla TWIST1 /VEGF-A Signal Pathway. PLoS ONE 11 (6): e0157137. doi: 10,1371 /journal.pone.0157137

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 08 helmikuu 2016; Hyväksytty: 25 toukokuu 2016; Julkaistu: 09 kesäkuu 2016

Copyright: © 2016 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimuksen rahoittivat National Natural Science Foundation nuorten tutkijoiden of China (No.81302155), National Natural Science Foundation of China (No. 31271564), presidentti Foundation of Nanfang Hospital (No.2015B007), ja avain Clinical Specialty Kuri rakentaminen ohjelma Kiinassa (The Syöpätautien, Nanfang sairaala).

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Jatkuva verenkierto on tarpeen nopea kasvu kasvainten [1]. Lisäksi hyvin tutkituissa endoteelin riippuvaisen angiogeneesiä, viimeaikaiset tutkimukset ovat paljastaneet useita uusia malleja kuten vaskulogeeniseen mimiikka ja mosaiikki alukset [2, 3]. Olemme aiemmin raportoitu että etäpesäke-liittynyt paksusuolensyöpä-1 (MACC1) vaikuttivat vaskulogeeniseen mimiikka (VM) muodostuminen ihmisen mahasyövän (GC) [4]. On kuitenkin vielä tiedetä, onko MACC1 on mukana todellisessa endoteelin riippuvainen angiogeneesistä GC.

MACC1, joka on keskeinen säätelijä hepatosyyttikasvutekijän (HGF) /c-Met /mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK ) signalointireitin [5-7], edistää proliferaatiota, migraatiota, ja invaasion GC solujen [8], sekä vaikuttaa kasvaimen sokeriaineenvaihdunnassa [9] ja microenvironment [4, 10, 11], viimein ennustamaan kehno kliinisistä tuloksista GC potilaille [8]. Aiemmat tutkimukset raportoitu, että useita säätelijöitä VM [12, 13] osallistunut angiogeneesissä [14, 15]. Siksi me erittäin spekuloida, että MACC1 tärkeä rooli endoteelin riippuva angiogeneesiä GC.

On todettu, että angiogeneesiin liittyy läheisesti leikkauksen jälkeisen kasvaimen uusiutumisen [16]. Mutta ei ole selvää, onko yhdistelmä MACC1 ja korkea tiheys pienten suonten (MVD) edelleen vaikuttaa tautivapaan elinajan (DFS) GC potilaista, eikä molekyylitason mekanismi MACC1 angiogeneesissä. Meidän alustavassa tutkimuksessa osoitimme, että TWIST1 oli tarpeen MACC1 aiheuttama VM GC [4], kun taas TWIST1 ekspressiota edistetään vaskularisaatiota Rintasyövän [17, 18], ja tukee verisuonten kehitystä säätelemällä verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) – [19], joka on ensimmäinen muoto tunnistettu pro-angiogeeninen tekijä [20, 21]. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että TWIST1 /VEGF-A angiogeenisten akselilla on keskeinen rooli endoteelin riippuvainen angiogeneesistä kasvaimia. Tärkeää on, aiemmat raportit analyysi Julkaistujen microarray aineistoja osoitti MACC1 mRNA tasot olivat merkitsevästi korreloivat VEGF-A ilmentymisen GC kudoksissa (TCGA; n = 387, r = 0,224, P 0,001) (S1 Kuva). Ennen kaikkea, oletamme, että MACC1 edistää endoteelin riippuvaisen angiogeneesin kautta aktivoimalla TWIST1 /VEGF-A signaloinnin akselin GC.

Tässä tutkimuksessa tutkimme onko MACC1 positiivisesti liittyy endoteelin riippuvaista angiogeneesistä. Havaitsimme onko MACC1-positiivinen ilme ja korkea MVD ennustettu lyhyt DFS potilaalla on GC jälkeen radikaali resektio. Sitten tutkimme rooli MACC1 angiogeneesissä in vivo ja in vitro. Lopuksi määritetään onko TWIST1 /VEGF-A angiogeenisten akseli edustaa taustalla olevan mekanismin MACC1 aiheuttaman endoteelin riippuvaisen angiogeneesiä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja Tuumorikudoksen Näytteitä

parafinoidut patologiset näytteet saatiin 159 potilasta vaiheen I-III GC joka tehtiin radikaali kirurginen resektio at Nanfang sairaalan Southern Medical University (Guangzhou, Guangdong, Kiina) vuosina 2005 ja 2010. Kaikki potilaat diagnosoitiin mukaan 7 painos ehdottanut American sekakomitean Cancer Manual (AJCC) 2010 pysähdyspaikan järjestelmä GC. Me vahvisti, että kaikki kokeet suoritettiin mukaisesti asiaa koskevien suuntaviivojen ja suostumus saatiin kaikissa aineissa. Tutkimuksessa pöytäkirjat hyväksyttiin eettisen komiteoiden Nanfang sairaalan ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

Animal Models

Male NOD-SCID-nude-hiiriin 5 viikon ikäisiä saatiin Sun Yat-Senin yliopistossa (Guangzhou, Kiina). Vakaa yliekspressio MACC1 geenin (oxMACC1) ja vektori-ohjaus soluja tai vaiennettu MACC1 (shMACC1) ja scramble-ohjaus GC soluja (1 x 10

7 solua /hiiri, n = 6) injektoitiin subkutaanisesti vasempaan ja oikeaan puolin takaisin kuten aikaisemmin on kuvattu [8]. Kasvaimen kyhmyt tarkkailtiin joka 3 päivä mittaharppimittauksilla pituuden ja leveyden kasvaimia. Kasvaintilavuudet laskettiin kaavalla: tilavuus = leveys x pituus x (leveys + pituus) /2. Kaikki hiiret sijoitettu tiettyyn patogeenittomassa laitos mikroisolaattorihäkkeihin häkkejä vapaa pääsy autoklavoitiin ruokaa ja happamaksi vettä täydennetty sulfametoksatsoli-trimetopriimi. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin laboratoriossa eläinten Administration komitean Nanfang Hospital (Luvan numero: NFYY-2015-10) ja sopusoinnussa Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals julkaiseman Yhdysvaltain National Institutes of Health. Kasvainten annettiin kasvaa 0,5-1 cm kooltaan suurimman dimension ja kerättiin päivänä 18, koska valtava kasvaimen tilavuus oli altis keskeinen nekroosia kasvaimia, jotka vaikuttavat tuloksiin seuraavissa kokeissa [8]. Sitten kudos keruu aloitettiin sen jälkeen, kun eläimet oli lopetettiin taittamalla niskasta. Hiiret poistettiin häkeissään ja kevyesti hillitty kun lepää työtason. Niskanmurto suoritettiin manuaalisesti ja johtivat eutanasia noin 10 sekunnin kuluessa. Ihonalainen kasvaimet käytettiin immunohistokemiallisia (IHC) värjäys.

Human verisuonten endoteelin Cell Putken muodostumisen määritys

HUVEC-putken muodostumiseen määritys suoritettiin pipetoimalla 200 ui Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ , USA) kuhunkin kuoppaan 24-kuoppaisella levyllä, joka sitten polymeroitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. HUVEC-soluja (1 x 10

5), 200 ui väliainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 12 tuntia. Kuvat otettiin käyttäen kirkkaan kentän mikroskoopilla suurennuksella 100 x. Kapillaariputkien kvantitoitiin laskemalla keskimääräinen lukumäärä päätökseen kiemuratiehyessä rakenteiden kolme satunnaisesti valittua aloilla.

Solulinjat ja soluviljelmät

OxMACC1 ja shMACC1 mahan adenokarsinooman solulinjoja suoritettiin, kuten on kuvattu edellisessä tutkimuksessa [8]. Soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (HyClone, Logan, UT, USA), ja 0,5 ug /ml puromysiiniä [8]. Solulinjat todistaa oikeaksi lyhyitä tandem-toisto ja genotyyppi upon uudelleen laajennuksia, ja kokeet suoritettiin varhainen kulttuureissa näiden kantojen. HUVEC-solut saatiin Yiyuan Biotechnology Company (Guangzhou, Kiina), ja viljeltiin endoteelisolujen kasvualustaa (Gibco, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 0,1 mg /ml hepariinia ja 20% FBS: ää (HyClone) toimittajan ohjeiden mukaisesti ehdotuksia. Kokeissa, soluja käytettiin välillä 2 ja 5 kohtia.

Plasmidit ja Cell transfektio

Ihmisen TWIST1 monistettiin PCR: llä ja kloonattiin pcDNA3.1-vektoriin (Primer sekvenssit S1 taulukko) ( Invitrogen), ja yhdistelmä-DNA-plasmidin pcDNA3.1 /TWIST1 on rakennettu. Äänenvaimennusjärjestelmä tehokkuus kolme paria TWIST1 erityisiä siRNA (Sigma, St. Louis, MO, USA) ORF alueella tutkittiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR (qRT-PCR, Alukesekvensseillä S2 taulukko). GC-solut transfektoitiin pcDNA3.1 /Twist1 ja TWIST1-spesifisten siRNA käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

immunohistokemia Värjäys

IHC värjäys suoritettiin standardin protokollan [8]. Leikkeitä inkuboitiin joukon ensisijainen ja toissijainen vasta (S3 taulukko). Värjäys tulokset arvioitiin kolme riippumatonta arvioijat, ja puoli-kvantitatiivinen pisteytysjärjestelmä määritettiin raportoitu muualla [8]. Lyhyesti, sillä MACC1 värjäytymisen intensiteettiä, kohdat pisteytettiin 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (medium), tai 3 (voimakas). Vaikka värjäytyminen määrin teki alueen mukaan prosenttiosuudet: 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), tai 4 (76% -100%). Tuotteet värjäyksen voimakkuus ja laajuus tulokset olivat lopullinen värjäyksen tulokset (0-12) varten MACC1 ilmaisua. Kasvaimet lopullinen värjäys pisteet ≥ 3 katsottiin olevan positiivinen ilmaisu, koska 95% normaalista mahalaukun kudosten ilmaistuna alhainen MACC1 kanssa IHC pisteet 3 meidän alustavassa tutkimuksessa [8]. Olemme edelleen määritelty 3 ~ 7 alhaiset ilmaisun ja 8 ~ 12 korkean ilmentymisen suorittamiseksi laadullisesti.

mikroverisuonitiheys

MVD määritettiin kuten julkaisussa Weidner et al. [22] . MVD arvioitiin mukaan verihiutaleiden endoteelin adheesiomolekyyli 1 (CD31) IHC värjäys tuumoriverisuoniin. Leikkeitä perin skannattu alhaisella teholla tavoite (suurennus 100 x) valita parhaiten vascularized (hot-spots) alueilla. Pienten verisuonten kuuman täplät laskettiin sitten suurennettuna 200 x, ja keskimääräinen alus määrä kuudessa hot-spotit laskettiin MVD. Kaikki lukemat olivat itsenäisesti uudelleen kolme tarkkailijaa, jotka sokaisi vastaavaan ennusteeseen viittaavia tietoja. MVD oli luokiteltu joko korkea (≥ 36,8) tai matala (alle 36,8); 36,8 oli mediaaniarvon MVD.

entsyymi-immunosorbenttimääritys

konsentraatio TWIST1 ja VEGF-A kvantitoitiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla TWIST1 (Sandwich, käyttöikä Biosciences, CA, USA) ja VEGF-A: n (R 0,05 pidettiin tilastollinen merkitsevyys.

Tulokset

koholle MVD ja VEGF-A liittyvät kanssa uusiutunut GC Potilaat

arvioimiseksi uudissuonittumisen indeksi, MVD määritettiin IHC värjäys CD31 159 potilaiden kudosten vaiheen I-III GC. Edustavia esimerkkejä värjäyksen korkean ja matalan suurennoksia oli kuviossa 1A. Mediaaniarvon MVD, määritelty raja-arvo, oli 36,8. Olemme määritelleet arvot suurempia kuin cut-off korkean MVD, toisin kuin alhainen MVD. Niistä 159 GC potilaita, 106 (66,7%) jaettiin MVD-korkea ryhmässä ja 53 (33,3%) jaettiin MVD-low ryhmä (kuvio 1A). Yhdistyksen välillä MVD ja eri kliinispatologiset parametrit listattiin S5 taulukossa. Huomasimme, että MVD-high oli yleisempää GC potilailla, joilla uusiutumisen (P = 0,001, Kuvio 1C ja 1D). Ei ollut merkittävää yhteyttä viitaten sukupuoli, ikä, histologinen eroavuus laatu, syvyys invaasio (T vaiheita), lymfaattinen etäpesäke (N vaiheita), ja yleinen TNM vaiheittain kahden ryhmän välillä. Kuitenkin meidän lisäksi analyysi paljasti, että MVD oli suurempi vaiheen III kuin molemmissa vaihe II (P = 0,009) ja Vaihe I (P = 0,007) (kuvio 1 F), vaikka tämä ei pidä paikkaansa huomioon yksittäisten T tai N vaiheessa.

(A) edustaja immunovärjäyksen CD31 GC kudoksissa. (B) edustaja kuvaa VEGF-A värjätty ihmisen GC kudoksissa. (C-E) edustaja mikrovalokuvia (C) ja Bar kuvaaja, joka esittää MVD (D) ja VEGF-A lauseke (E) oli suurempi uusiutumisen GC potilaille kuin ei-toistuminen GC potilaille. Mittakaava = 50 pm.

#P 0,01, n = 65 ja n = 94 ei-toistuminen ja uusiutumisen potilaista. (F G) I vaiheessa potilailla, MVD oli alhaisempi (F) ja keskimääräinen VEGF-A tulokset näyttivät olevan alhaisempi (G) kuin vaiheessa II ja vaiheen III.

#P 0,01 vs. vastaava kontrolliryhmään, N. S., nro merkitys; n = 26, n = 50 ja n = 83 vaiheen I, II, ja III, vastaavasti.

On dokumentoitu, että VEGF on keskeinen rooli, joka kiihdyttää kasvaimen verisuonten muodostumista ja biologisesti korreloi kanssa MVD [20, 23]. VEGF-A eniten tutkittu VEGF perhe [20, 21]. Koska tärkeä merkitys VEGF-A kasvainangiogeneesissä, toteutimme immunovärjääminen 159 GC kudoksissa (kuvio 1 B). Mukaan VEGF-A värjäys tulokset, potilaat jaettiin ryhmiin negatiivisen (pisteet 0-2), alhainen (pisteet 3-7) ja korkea ilmaisuja (pisteet 8-12). Oli 108 VEGF-A positiiviset potilaat, jotka ottivat enemmistö (positives 67,9% vs. negatiivisiksi 32,1%). Heistä 47 (29,6%) potilaista määriteltiin heikkoa ilmentymistä, ja 61 (38,4%) olivat korkeita ilme. Suhde VEGF-A ilmaisun ja toistumisen arvioitiin edelleen GC. Tämän seurauksena VEGF-A: n havaittiin positiivinen korrelaatio kasvaimen uusiutumisen GC potilailla (P 0,001, kuvio 1C ja 1E). Lisäksi vaikka ei ollut tilastollisesti merkitsevä (P 0,05), VEGF-A ilme olivat korkeampia vaiheessa II-III kuin vaiheen I päätellen laatikon kuvaaja (kuvio 1 G), joka ehdotti myönteinen säätelevän roolin VEGF-A MVD GC etenemiseen.

MACC1 Positiivisesti korreloi MVD ja VEGF-A Human GC

selventää roolia MACC1 että uudissuonittumisen GC, ryhdyimme onko MACC1 korreloi MVD ja angiogeenisen tekijän VEGF-A. Sitten IHC värjäys suoritettiin havaitsemiseksi MACC1 ilmentymistä GC kudosleikkeiden (kuvio 2A). Kuten kuviossa 2B, MACC1 osoitti korkeampi ilmaisun GC potilailla, joilla uusiutumisen kuin ilman. Erityisesti MACC1 korreloi positiivisesti MVD (r = 0,258, P = 0,001, kuvio 2C) ja lisääntynyt VEGF-A ekspressiotaso GC kudoksissa (P = 0,008, Kuva 2D). Tässä nämä havainnot osoittivat, että MACC1 korreloivat MVD ja VEGF-A ihmisen GC.

(A) edustaja MACC1 värjätään kuvia GC kudoksissa. Mittakaava = 50 pm. (B) taajuus negatiivinen, matala ja korkea MACC1 ilmaisun GC potilailla luokiteltuna toistumisen. (C) MACC1 ilmaisun tulokset korreloivat positiivisesti kanssa MVD (r = 0,258, P = 0,001 ja n = 159). (D) VEGF-A oli suurempi MACC1 positiivisuus kasvaimia.

#P 0,01, n = 23 ja n = 136 MACC1-negatiivisten ja MACC1-positiivisia kasvaimia, vastaavasti. MACC1 positiivinen ilmaisu sisällytetään MACC1-alhainen ja -korkea ilme.

MACC1 ja MVD Ilmoita Short DFS GC Potilaat

Mukaan Monimuuttuja-analyysissä käytetty Cox mallia, MVD (P = 0,043, HR = 1,737) ja yleistä TNM vaiheissa (P 0,001, HR = 2,559) olivat riippumattomia ennustetekijöitä parametrit ennustavat uusiutumisen riskiä sen jälkeen kun radikaali resektio vaiheen I-III potilaat (S6 taulukko). Kaplan-Meier selviytymisen käyrä piirrettiin käyttämällä edellä mainittua ennustavat tekijät. Niistä 159 potilasta, 94 (59,1%) uusiutunut ja keskimääräinen aika uusiutumiseen oli 27,0 kuukautta. DFS aika oli merkittävästi lyhyempi potilailla, joilla on edennyt TNM (P 0,001, kuvio 3A). Lisäksi ei vain MACC1-positiivisia tai MVD-high yksin vaikutti DFS yhdistelmä molemmat voivat myös ennustaa lyhyellä DFS GC potilailla (Kuva 3B-3D). On silmiinpistävää, 3 vuoden DFS korko yhdistelmä MACC1-positiivisten ja MVD-korkea potilailla oli vain 34,5%, kun se oli 55,3% potilailla, joilla kasvaimia, jotka olivat MVD-alhainen ja negatiivinen MACC1 (kuvio 3D).

(A) Kaplan-Meier-analyysi GC potilaiden DFS kertaa alaryhmiin vaiheen I-III. (BD) Kaplan-Meier käyrä, MACC1 positiivinen ilme ja kohonnut MVD osoitti lyhyt DFS GC potilaiden luokiteltu MACC1 lauseke (B), MVD taso (C) ja yhdistelmällä MACC1 positiivisuus ja MVD-korkea (D).

MACC1 Edistää GC endoteelin-Dependent Angiogeneesi in vivo ja in vitro

Angiogeneesi on tärkeää kasvaimen kasvulle. Aluksi, testasimme onko muutos MACC1 ilmaisun voisi vaikuttaa kasvainsolujen kasvua in vivo. Pystyimme BGC-823 solulinjoissa oxMACC1 ja shMACC1 kuten aiemmin on kuvattu [8], sen jälkeen solut injektoitiin subkutaanisesti NOD-SCID nude-hiiriin (n = 6 /ryhmä). Tämän seurauksena (kuvio 4A ja 4B), ektooppinen ilmentyminen MACC1 helpottaa tuumorigeneesiä in vivo: keskimääräinen tilavuus oxMACC1 kasvainten oli huomattavasti suurempi kuin vektorin-valvonnan päivänä 18, ja shMACC1 injektiona saaneiden hiirien näytetään merkittävästi vähäinen kasvaimen tilavuus. Kuten on esitetty kuviossa 4C ja 4D, ekspressio VEGF-A: ta lisääntyivät merkitsevästi oxMACC1 ryhmissä verrattuna vektori-verrokkiryhmien (P = 0,007). Sitä vastoin VEGF-A arvosanalla koko shMACC1 ryhmissä oli huomattavasti pienempi kuin ryntäily-verrokkiryhmien (P 0,001). Molemmissa solulinjoissa, määrä MVD todettiin edistetään oxMACC1 ja estää shMACC1 (P = 0,025 ja P = 0,002, kuvio 4C ja 4E).

(A) edustaja kuvia ihonalaisen implantoidun yliekspression of MACC1 (oxMACC1) ja vaiennettu MACC1 (shMACC1) kasvain GC ksenograftien. (B) tuumorin tilavuuden käyrät GC ksenograftien on 18 päivää inokulaation jälkeen. * P 0,05;

#P 0,01, n = 6 (C-E) edustaja immunovärjäys MACC1, VEGF-A, CD31 (C) ja määrän (D 0,05;

#P 0,01, n = 6 vs. vastaava kontrolliryhmään. (F) Kuvat ovat putken muodostumisen kolmiulotteinen kulttuuri (vasen paneeli) ja määritysrajan (oikea paneeli) ja HUVEC käsitelty vakioitua elatusainetta BGC-823 tai MKN-28 GC soluja 12 tuntia. WT, villityypin. V, vektori. Ox, oxMACC1. S, scramble. Sh, shMACC1. Mittakaava = 50 pm. * P 0,05;

#P 0,01, n = 3.

Jotta voitaisiin vahvistaa roolia MACC1 angiogeneesissä in vitro, käytimme vakiintunut kolmiulotteisia (3D) kulttuuri malli välillisten co-kulttuuri järjestelmä. Kuten kuviossa 4F, tiheys verisuonten putken kaltaisia ​​rakenteita on dramaattisesti lisääntynyt HUVEC viljeltiin yhdessä vakioitua elatusainetta oxMACC1 BGC-823 ja MKN28 solujen (P = 0,05 ja P = 0,003), kun taas oli merkittävästi vähentynyt shMACC1 BGC-823 ja MKN28 soluja, verrattuna vastaavaan vektori-ja scramble-ohjaus soluja 12 h (P = 0,006 ja P = 0,02). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että MACC1 nopeutettu kasvaimen kasvua ja indusoi endoteelin riippuvaisen angiogeneesiä GC.

MACC1 edistää angiogeneesiä säätelemällä TWIST1 Expression

aiemmin raportoitu, että TWIST1 oli olennainen tekijä MACC1 indusoima VM GC soluja. MACC1 voisi transkriptionaalisesti upregulate TWIST1 [4]. Tämä sai meidät tutkimaan, TWIST1 harjoittavat MACC1 aiheuttaman endoteelin riippuvaisen angiogeneesiä GC. Tulokset osoittivat kuviossa 5A ja 5B ehdotti, että ilmaus TWIST1 ilmeisesti yläreguloituja oxMACC1 GC solulinjoissa (P 0,001 ja P = 0,024), mutta merkittävästi vaimentua vuonna shMACC1 GC solulinjoissa verrattuna vastaavaan kontrolliin solujen (P = 0,002 ja P 0,001). Samanlaisia ​​on päädytty ELISA-analyysissä (S2 Kuva). Seuraavaksi havaitaan proteiinin ekspressio VEGF-A: n kaksi GC solulinjoissa (kuvio 5A ja 5B), VEGF-A oli huomattavasti kasvanut MACC1 säätelyä (P 0,001 ja P = 0,008), mutta laski shMACC1 (P = 0,039 ja P = 0,041). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin ELISA-analyysissä (kuvio 5C ja 5D). Lisäksi IHC värjäytymistä ihonalaisen kasvaimissa GC ksenografteissa osoittivat, että TWIST1 ja VEGF-A oli merkittävästi suurempi oxMACC1 soluja versus vektori-valvonta, ja oli merkittävästi laski shMACC1 soluja versus scramble-ohjaimet (P = 0,003 ja P = 0,026, kuviot 4C ja 5E).

(A B) Western blot-analyysi (ylempi paneeli) ja määritysrajan (alempi paneeli) on MACC1, TWIST1, ja VEGF-A ilmentymistä vasteena yli-ilmentymisen tai vaiennettu MACC1 (oxMACC1 ja shMACC1) in BGC-823 ja MKN-28 GC soluissa. * P 0,05;

#P 0,01, n = 3. WT, villityypin. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (C 0,05;

#P 0,01, n = 3.

Tähän asti, näyttää siltä, ​​että TWIST1 on mukana MACC1 aiheuttaman endoteelin riippuvainen angiogeneesistä, joten siellä tulee toinen mahdollisuus: on TWIST1 tarpeen indusoiman angiogeneesin MACC1?

TWIST1 tarvitaan MACC1 angiogeneesissä in GC solut

Voit selvittää TWIST1 on tärkeää MACC1 angiogeneesissä GC, me yli-ilmennetään kohdunulkoinen TWIST1 geeni (oxTWIST1) on shMACC1 soluissa ja pudotti endogeeninen TWIST1 (siTWIST1) on oxMACC1 soluissa. Kolme riippumatonta siRNA konstruktioita vastaan ​​Twist1 ORF alueella käytettiin (S2 taulukko). MRNA-tasojen, kaikki kolme siTWIST1 onnistuneesti tukahdutti TWIST1 ilmaisun ja tehokkaimpien käytettiin transfektoimaan GC-soluja (S3 kuvassa). Tehokkuutta yliekspressoiva tai hiljentämisen varmistettiin qRT-PCR: llä ja Western blot.

Seuraavaksi havaitaan proteiinin ekspressiotaso VEGF-A: n Western blot GC solulinjoissa. Molemmissa solulinjoissa, muutokset VEGF-A-proteiinin ilmentyminen ilmeisesti lisääntyi oxTWIST1 (P = 0,015 ja P = 0,02, kuvio 6A), mutta se oli merkitsevästi pienempi siTWIST1 (P = 0,022 ja P = 0,01, kuvio 6B). Putken muodostumisen määritys, tiheys putken muodostumiseen edistettiin oxTWIST1 (P = 0,007 ja P 0,001), ja estyi siTWIST1 (P 0,001 ja P 0,001, kuvio 6C). Yhdessä tulokset Näiden täydentävien sarjaa yli-ilmentymisen ja pudotus kokeet osoittivat, että TWIST1 oli tarpeellinen ja riittävä osallistua MACC1 aiheuttaman endoteelin riippuvainen angiogeneesistä, mikä tarkoittaa, että MACC1 angiogeneesin aktivoinnin kautta TWIST1 /VEGF-A angiogeenisten akselin GC.

(A B) Western blot analyysi (ylempi paneeli) ja määrän (alempi paneeli) VEGF-A: ekspression vaimentaminen MACC1 (shMACC1) GC-soluja, jotka yli-ilmentynyt TWIST1 (oxTWIST1) ja yliekspressio MACC1 (oxMACC1 ) GC soluja, jotka vaiennetaan TWIST1 (siTWIST1). * P 0,05;

#P 0,01, n = 3 (C) edustaja micrographs verisuonten putkimaisen muodostumista kolmiulotteinen viljelmiä HUVEC käsitelty supernatanteista shMACC1 /oxTWIST1 tai oxMACC1 /siTWIST1, ja vastaavat säätimet 12 h. Mittakaava = 50 pm. * P 0,05;

#P 0,01, n = 3 kussakin ryhmässä.

Keskustelu

Angiogeneesi on ajateltu olevan ratkaiseva askel syövän etenemisen, ja useita tutkimukset ovat osoittaneet sen roolit aggressiivinen maligniteettien [24] . Siitä huolimatta aiemmat tutkimukset ovat löytäneet useita tehokkaita säätö- edistävät tekijät endoteelin riippuvaisen angiogeneesiä [14, 15, 18, 25], mahdollista roolia MACC1 GC angiogeneesiin on tuntematon. Tässä tutkimuksessa olemme lähinnä tutkittiin miten MACC1 endoteeliin riippuvaista angiogeneesistä GC. Tulokset osoittivat, että säätelyä MACC1 ollut merkittävää korrelaatiota korkeampi MVD ja VEGF-A ilmentymisen GC. Yhdistelmä MACC1 positiivisuus ja korkea MVD ennustettu lyhyt DFS GC potilailla. Lisäksi olemme havainneet, että MACC1 lisääntynyt ilmentyminen TWIST1 GC solulinjoissa ja helpottaa putken muodostumiseen HUVEC. MACC1 paitsi koholla VEGF-A tason in vitro, mutta myös kiihtynyt kasvaimen kasvua ja indusoi pienten suonten muodostusta in vivo. Näin ollen, esillä oleva data from tutkimukset osoittavat, että MACC1 on onkogeenisen tehostaja endoteelin riippuvainen angiogeneesiä ja kasvaimen etenemistä GC.

aiemmin raportoitu, että MACC1 heikensi metabolisen stressin kautta AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK ) aktivointi, ja mukana kasvaimen energia-aineenvaihduntaan lisäämällä Warburg vaikutus [9]. MACC1 edistänyt GC solujen lisääntymisen ja invaasiota indusoimalla epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) aktivoimalla HGF /c-Met-signalointireitin [8], ja indusoi VM muodostumista GC HGF /c-Met-TWIST1 /2-au- kadheriinin /VEGFR2 signalointi akseli [4]. Lisäksi on raportoitu, että MACC1 osallistuu eri signaloinnin verkkojen, kuten Akt /β-kateniinin [26] ja Ras /Erk [27], joiden aktivointi on myös raportoitu parantaa TWIST1 ilmaisun [28-30]. Haimasyövän solulinjoissa, HGF /c-Met on osoittivat välittää solunsisäisen signaalin kautta MAPK-reitin [31], ja on välttämätöntä fosfory- ja vakauttaa TWIST1 rintasyövässä [28]. Aikaisemmat tutkimus toimittanut ensimmäiset todisteet että MACC1 kopiointia voimistunut TWIST1. Samalla olemme osoittaneet, että HGF helpotti ydin- translokaatiota MACC1 ja säätelyä TWIST1 edistämään VM GC, kun taas c-Met estäjä antagonized tässä prosessissa [4]. Kuitenkin MACC1 keskeisenä säätelevä tekijä HGF /c-Met: /MAPK-signalointireitin [5], sen suhdetta TWIST1 endoteelin riippuvainen angiogeneesistä GC ei ole vielä löydetty. Esillä olevassa tutkimuksessa, tuloksemme osoittivat, että MACC1 voimistunut TWIST1 ilmaisun ja indusoi verisuonten putkimainen muodostumista HUVEC. Siksi MACC1 transkription tekijä voisi kopiointia moduloida endoteelin riippuvia angiogeneesiä ja välittävät TWIST1 säätelyä, joka vastaa angiogeneesi ja kasvaimen etenemistä GC.

Toistaiseksi hallitseva rooli TWIST1 kasvaimen etenemisen arvellaan voidaan asiakkuutta EMT [32]. Hyvin harvat tutkimukset paljastivat, että TWIST1 edistänyt endoteelin riippuvaista angiogeneesistä rintasyövässä [33] ja maksasolukarsinoomassa [34] rekrytoimalla makrofagit, muuttamalla metalloproteinaasi 9 ilmaisun ja aktivoiva VEGF-A signaloinnin [19]. Tutkia tarkemmin, ovatko TWIST1 on myös kriittinen välittäjänä MACC1 aiheuttaman endoteelin riippuvaisen angiogeneesin GC tunnistimme, että ilmentyminen TWIST1 kasvoi merkittävästi, kun läsnä on MACC1. Lisäksi hiljentäminen TWIST1 voimakkaasti vaimen- MACC1-välitteisen putken muodostumiseen HUVEC, viittaa siihen, että TWIST1 tarvitaan MACC1-välitteisen angiogeneesin GC.

mekanismeista VEGF-A-indusoidun angiogeneesin syöpäsolujen sekä perus- että kliinisen tutkimuksen tutkimukset ovat tutkittu intensiivisesti [35-37]. On ehdotettu, että VEGF-A toimii kytkimen edistää angiogeneesiä [38]. Yhdenmukainen kriittinen rooli VEGF-A: angiogeneesissä, esillä olevassa tutkimuksessa vahvistettu, että VEGF: n ilmentymistä-A: n ja MVD, sekä kasvaimen kasvua merkittävästi lisääntynyt MACC1 yli-ilmentymiseen GC-soluja. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että VEGF-A signalointireitin osallistuu MACC1 /TWIST1 aiheuttama endoteelin riippuvaisen angiogeneesiä GC.

Johtopäätökset

Yhteenvetona Tutkimuksemme antoi sekä kliinistä ja kokeellista näyttöä toiminnan kannalta MACC1 in endoteelin riippuva angiogeneesiä GC. Ektooppinen ilmentyminen MACC1 edistää kasvaimen leviämisen, merkittävästi upregulated TWIST1 ilmentymistä in vivo, ja indusoi verisuonten putkimainen muodostumista in vitro. Nämä havainnot osoittavat, että MACC1 edistää endoteelin riippuvaista angiogeneesistä GC jonka signalointireitille näkyy kuvassa 7. Ymmärtäminen MACC1 on mukana GC synnyssä on hyödyllistä kehittää mahdollisia terapeuttisia kohteita hallintaan GC.

Yhteenvetona kaavio tässä tutkimuksessa, MACC1 yli-ilmentyminen mahasyövän (GC) aktivoi TWIST1 angiogeneettisiä akselin, joka johtaa säätelyä VEGF-A, ja helpottaa angiogeneesiä. * P