Krooninen sairaus

tiivistelmä

DNA hypometylaatio on tärkeä epigenetic muutos havaittiin esiintyvän monissa eri syöpätyyppejä, johtava että säätelyä aiemmin vaiennettu geenien ja menetys genomista vakautta. Olemme aiemmin osoittaneet, että hypoksia ja hypoglykemia (iskemia), kaksi yhteistä mikro-ympäristön muutoksiin kiinteitä kasvaimia, vähentää DNA: n metylaatio kautta downregulation DNMTs ihmisen peräsuolen syövän soluja. Tässä hyödynsimme genomin laajuinen cross-platform lähestymistapa geenien tunnistamiseksi hypometyloidut ja voimistuvan iskemia. Sen jälkeen altistuminen hypoksia tai hypoglykemia, metyloitua DNA ihmisen peräsuolen syöpäsolujen (HCT116) immunosaostettiin ja analysoitiin kanssa Affymetrix promoottori array. Lisäksi RNA eristettiin ja analysoitiin rinnan Affymetrix ilme array. Kekseliäisyyttä polku analyysin ohjelmisto osoittaa, että huomattava osa geeneistä hypometyloidut ja yliaktiivista olivat mukana solujen liikkumista, kuten

PLAUR

ja

Cyr61

. Matrigel invaasiomääritys paljasti, että todellakin HCT116 soluja kasvatettiin hypoksinen tai hypoglykeemisiä olosuhteet ovat lisääntynyt liikkuvuus ominaisuuksia. Vahvistus ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentymisen solun liikkeen geenien suoritettiin qPCR. Korrelaatio iskemia ja etäpesäke on vakiintunut syövän etenemiseen, mutta molekyylitason mekanismeja vastuussa tämän yhteisen havainto ei ole selkeästi. Meidän uudet tiedot viittaavat siihen, että hypoksia ja hypoglykemia saattaa olla ajon muutoksia DNA: n metylaatio kautta downregulation DNMTs. Tämä on ensimmäinen raportti tietojemme joka tarjoaa selityksen lisääntyneestä metastaattista potentiaalia nähdään iskeeminen soluissa;

eli

että ischemia voisi ajaa DNA hypometylaatio ja lisäämällä ilmentymistä solun liikkumisen geenejä.

Citation: Skowronki K, Andrews J, Rodenhiser DI, Coomber BL (2014) genominlaajuisten Analysis in Human peräsuolen syövän solut paljastaa Iskemia välittämää ilmentäminen Liikkuvuus geenien kautta DNA hypometylaatio. PLoS ONE 9 (7): e103243. doi: 10,1371 /journal.pone.0103243

Editor: Hassan Brim, Howard University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 helmikuu 2014; Hyväksytty: 30 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 31 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Skowronski et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ Rahoitin Research Grant # 020094 on BLC ja DR Kanadan Cancer Society Research Institute (https://www.cancer.ca/research/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kiinteä kasvaimia läpikäyvät perustavanlaatuinen prosessia kutsutaan angiogeneesi (rekrytointi neo-verisuonistossa) säilyttämiseksi riittävä hapen ja ravinteiden laajenee massa [1]. Kasvaimen verisuonet ovat erittäin epätavallista ja johtuen kasvaimen kasvunopeus ylittää nopeuden angiogeneesin, alueet kasvain kehittyy heikentynyt verenkierto, tai iskemian [2]. Lisäksi muita muutoksia, iskeeminen alueiden on alueita hypoksia ja hypoglykemian, ja vaikka vaikutus hypoglykemian on tumorigeneesin ei ole hyvin tutkittu, rooli hypoksia syövän etenemisen on hyvin dokumentoitu ja sisältää yhä geneettinen epävakaus, ja stimuloi solujen invaasiota ja angiogeneesiä, mikä edistää etäpesäkkeiden [3].

Cellular liikkuvuus /maahanmuutto on kriittinen vaihe etäpesäkkeitä, joka on syynä useimpiin syöpään liittyvien kuolleisuutta [4]. Erilaisia ​​molekyyli- muutokset voivat aiheuttaa solun olla liikkuvia ja matkustaa lymfaattinen tai verisuoniston järjestelmä, joka lopulta johtaa pidättämään uudessa sivusto kehossa [5]. Solut sisällä iskeemisen ympäristössä olla korkeampi metastaattista potentiaalia säätely geenien kuten

VEGF

edistää angiogeneesiä, ja

urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin

(

uPA

), joka aktivoi plasmiini hajottamaan ECM [5]. Stabiloimalla alayksikkö hypoksia-reagoiva transkriptiotekijä, HIF1α, hypoksia ohjaa ekspressiota nämä kaksi geeniä, ja monet muut, edistää etäpesäkkeiden. Soluja voidaan myös muuttaa nykyistä liikkuvia kautta epigenetic uudelleenohjelmointi. Useat asiaan geenejä, kuten

uPA

[6] ja

S100A4

[7] ovat muuttuneet epigeneettiset kuviointi syöpäsoluissa, jolloin solumorfologiaan muutettava entistä metastaattinen suotuisaa tilassa. Mikä on tuntematon on jos epigeneettisellä muutoksia ja iskemiaan liittyvät edistämisessä tuumorimetastaasissa.

DNA: n metylaatio on tärkeä epigeneettiset mekanismi, joka säätelee geenin ilmentymistä [8]. Metyloitua DNA liittyy transkription hiljentäminen, koska metyyliryhmät at sytosiinitähteiden muuttaa asetuksia DNA ja estää sen vuoksi transkriptiotekijöiden sitoutumisen [9], sekä käynnistävät rekrytointi repressors ja chromatin modifioivia entsyymejä, jotka edelleen vaientaa ilmaisun kromatiinin tiivistyminen [10], [11]. Useat DNA-metyylitransferaaseja (DNMT) katalysoivat sytosiinin 5-metyylisytosiinin [12], yleisimmin tutkittu DNMTs on DNMT1 (huolto metyylitransferaasin) ja DNMT3a ja DNMT3b (

de novo

metyylitransferaasit) [13] .

syöpä, kaksi yhteistä häiriöitä DNA metylaation noudatetaan: promoottori-erityisiä hypermetylaation ja globaali hypometylaatio [14]. Useimmat tutkimukset ovat keskittyneet DNA hypermetylaation ja millainen vaikutus hiljentäminen tuumorisuppressorigeeneille on kasvainten aloittamisesta, etenemisen ja ennusteen. DNA hypometylaatio toisaalta on varjoon laajaa huomiota DNA hypermetylaation syövän hoidossa, vaikka hypometylaatio oli ensimmäinen epigeneettiset häiriöitä todettiin syöpä [15], [16]. Huolimatta alkuperäisen ymmärryksen puute siitä, miten tärkeää DNA hypometylaatio syövän, nyt tiedetään, että toistuvat sekvenssit tulevat demetyloituja ja johtaa genomisen kaaokseen [17], [18]. Kuten DNA hypermetylaation, hypometylaatio voi olla paikkasidonnainen, mikä edistää lisääntynyt ilmentyminen [16]. Lisäksi tällainen geeni-spesifisten vaikutusten, perimän epävakaisuuden, menetys merkintä [19] ja epänormaalin X-kromosomi aktivointi edistää myös kasvaimien syntyyn [20].

Hoffmann ja Schultz [16] arveltu, että DNA hypometylaatio kiihdyttää mukauttaminen syöpäsolujen dynaamisen mikroympäristöä kautta valinta tietyn geenin toimintojen, kuten liikkuvuuteen. Todisteita tämän teorian piilee urokinaasin plasminogeeniaktivaattorin

(uPA

) geeni. Seriiniproteaasi mukana hajoamiseen soluväliaineen,

uPA

on osoitettu olevan hypometyloidut promoottorialueen, mikä johtaa yli-ilmentymisen sekä rinta- ja eturauhassyöpää ja liittyy suoraan lisääntynyt invasiivisen ja metastaattisen potentiaalin [ ,,,0],6].

melanooma-antigeeniin

(

MAGE

) on toinen ryhmän geenien havaittiin demetyloitunut ja yläreguloituja moniin syöpiin kuten melanooma, paksusuolen ja peräsuolen, mahan, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [ ,,,0],21], [22], [23], [24], [25]. Kaiken kaikkiaan useat mekanismit voivat olla vastuussa dysregulaatio DNA: n metylaation syövässä. Yliekspressio DNMTs on raportoitu monissa eri syövissä [26] ja selittää poikkeava hypermetylaation, mutta vähemmän painopiste on mennyt ymmärrystä DNA hypometylaatio, vaikka DNA hypometylaatio näyttelee yhtä tärkeitä muokkaamisessa syövän epigenome.

edellinen työ on kuvattu uudenlainen suhde iskemian ja DNA: n metylaatio, joilla on alentunut metyyli sytosiinin nähty solujen iskeeminen alueilla kasvaimia [27]. Olemme myös havainneet, että HCT116 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, DNMT1, DNMT3a ja DNMT3b ilmaisun ja toimintaa vähennettiin

in vitro

hypoksia ja hypoglykemia [28]. Nämä muutokset ilmaisun ja toimintaa olivat keskenään sukulaisia ​​hypometylaatio

p16

INK4a

promoottorialue hypoglykeemisiä olosuhteissa [28]. Esillä olevassa tutkimuksessa selvitimme ilmaisun ja metylaation muutoksia HCT116 solujen genomin laajuisesti, hyödyntäen cross-platform lähestymistapa tunnistaa geenejä säätelee iskeemiset tilat. Koska aikaisemmat havainnot yhdistettynä yhteinen havainto lisääntyneestä metastaattisen potentiaalin iskeeminen kasvaimissa, me arveltu, että lisääntynyt solun motiliteettia paksu- ja syöpäsolujen iskeemiset tilat johtuu säätelyä liikkuvuuden liittyvien geenien, ja että nämä muutokset ilme ovat ohjaavat iskemia välittämän DNA hypometylaatio.

tulokset

Vähäinen kopioluvun vaihtelu

kopioluku geenien HCT116-soluissa arvioitiin kanssa Affymetrix SNP 6,0 array määrittää jos, ja missä määrin, solut käytimme oli ajautunut /mutatoitunut kulttuurin verrattuna alkuperäiseen karyotyyppi tämän solulinjan. Kun verrataan yhdistettyyn normaalin ihmisen karyotyyppi Kansainvälisen HapMap projektitietokantaa [29], solut ollut laaja kromosomaalisten poikkeavuuksien (kuvio 1). Meillä ei tarkkailla alueiden 8q, 10q, 16q, ja 17Q että näytetään alueelliset kromosomi voitot (merkitty punaisella), kuten aiemmin raportoitu muiden [30]. Hyvin harvat täydellinen menetys kappaletta nähtiin (sininen), paitsi Y-kromosomi, joka on raportoitu olevan poissa 50-100% of HCT116-solujen [31]. Niinpä verrattuna muihin syövän solulinjoissa, HCT116 on suhteellisen normaali ja vakaa karyotyyppi minimaalisella kromosomi epävakauden [30].

Numbers (ja X /Y) vastaavat kromosomeja, ja MT edustaa mitokondrio-DNA. Tuloksia verrattiin aineisto päässä Affymetrix sisältävän 270 sekapopulaatioon näytteitä Kansainvälisen HapMap Project [29]. Alueet harmaalla osoittaa mitään muutosta kopiomäärä, punainen osoittaa kopiomäärä voitto, ja sininen kopio numero tappiota. Tämä joukko suoritettiin kahtena.

Hypoglykemiaa vaikutukset enemmän geenejä kuin hypoksia

Expression analyysin avulla kvantitatiivisesti arvioida geenien ilmentymisen muutoksia HCT116 soluja iskeemiset tilat. Ilmaus paneelit osoitti, että altistuminen hypoksia 48 tuntia, HCT116-solut oli 310 ja 1081 geenien ylä- ja alassäädetty, vastaavasti. Kun solut altistettiin hypoglykemia, 1052 ja 2433 geenit olivat ylä- ja alassäädetty, vastaavasti (taulukko 1). Analyysi promoottorin metylaation käyttäen Affymetrix 1.0R laatoitus array paljasti, että hypoksia johti 1386 hypometyloidut geenejä, ja 1655 hypermetyloitunut geenejä. Kasvu on ollut hypoglykeemisiä olosuhteissa johti 1940 hypometyloidut geenejä, ja 1980 hypermetyloitunut geenejä (taulukko 1). Siten sekä ilmaisun ja promoottorin metylaation oli eniten vaikutti hypoglykemia, mitattuna kokonaismäärä merkittävästi muuttunut geenejä.

Cross-platform analyysi

Seuraavaksi arvioimme toiminnallisen merkitystä näiden monimutkaisten geeniekspression ja epigeneettiset (DNA: n metylaatio) profiileja. Käyttäminen Partek Software Suite, ainutlaatuinen geenejä, jotka hypometyloidut ja voimistunut (sekä hypermetyloitunut ja vaimentua) peitettiin jotta voidaan tunnistaa muutoksia geenien ilmentyminen liittyy muutoksia promoottori metylaatio. Oli 58 ainutlaatuisia geenejä hypermetyloitunut ja vaimentua mukaan hypoksinen olosuhteet, ja 161 geenien hypoglykemia (dataa ei esitetty). Olemme keskittyneet geenejä, jotka hypometyloidut ja lisääntynyt ilmentyminen, koska meidän edellinen työ osoitti DNMTs oli tukahdutettu iskemiaan. Havaitsimme, että 18 ja 96 ainutlaatuinen geenejä hypometyloidut ja voimistuvan hypoksia ja hypoglykemia, vastaavasti (kuva 2). Osittainen luettelot näistä geeneistä on nähtävissä taulukoissa 2 ja 3, joissa täydellinen luettelo esitetään taulukossa I Information S1.

määrä geenejä, jotka olivat molemmat merkittävästi hypometyloidut ja voimistuvan hypoksia (A) ja hypoglykemia ( B) on ilmoitettu päällekkäinen alueilla.

Nerokkuus Pathway Analyysi hypometyloidut ja voimistuvan geenit

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) käytettiin analysoimaan ja luokittelemaan hypometyloidut ja voimistuvan geenien toiminnallinen reittejä, jotta voidaan paremmin ymmärtää biologista merkitystä geenien meidän tietokokonaisuus. Ohjelmisto määrittää, onko biologinen funktio rikastetaan joka datajoukon tutkimalla koko geeni lista toiminnallinen merkinnät löytyvät nerokkuus tietopohjaa, ja suorittamalla Fisherin testiä vertaamalla suhdetta geenien tiettyyn merkintä tiedoissa asettuvat suhde geenien, joilla on tämä sama merkintä koko väestöstä (

eli

kaikki geenien HG U133 Plus 2.0 array). Jos ensimmäinen suhde on huomattavasti suurempi kuin toinen, niin luettelo on sanottu olevan rikastettu geenejä, joilla on tämä merkintä.

hypoksia altistuminen, kolme parasta solun toimintoja lista hypometyloidut /voimistunut geenit olivat: solu-solu-signaloinnin, solun liikkuvuus, ja sidekudos kehitys (kuvio 3). Hypoglykemia rikastettu muutoksia solukuolemaan, solusyklin ja geenin ilmentymisen säätelyyn (kuvio 4). Vaikka ei sisällä alkuun muutaman toimintakategorioihin, solu liike oli myös rikastetun toiminto hypoglykeemisiä ryhmässä. Verkko-analyysi suoritettiin myös antamaan graafinen esitys tunnettujen biologisten ovat määritelty hypometyloidut ja voimistuvan geenejä. Verkot on luotu määrittämällä painopiste molekyylin, ja sitten tutkitaan geenin luettelot kaikkein yhteydet painopiste molekyyliä, perustuu kirjallisuuden kekseliäisyyttä tietokantaan. Top verkkoja (joilla on eniten yhteydet) sekä hypoksia ja hypoglykemian mukana geenejä, jotka ovat rooleja solun liikettä. Vuonna hypoksinen olosuhteet,

PLAUR, LDLR

, ja

LAMB3

(kuva 5A) olivat kaikki yhdessä verkossa ja kaikilla on osoitettu olevan osallisena solujen liikkumista. Top verkko hypoglykeemisiä olosuhteissa sisältyvät solujen liikkuvuuden geeneistä

ETS1, Klf4 IL6ST, NEDD4L

, ja

sääntelyviranomaisten

(kuvio 5B). On tärkeää huomata, että jotkut geenit listalta voi olla biologisia toimintoja /merkinnät että Ingenuity tietokanta ei tunnista. Esimerkiksi

AFAP1L1

ei ollut Nerokkuus luetteloon liittyvien geenien solujen liike, mutta on olemassa näyttöä tämän molekyylin roolia muuttoliike ja invaasiota [32]. Perustuen IPA analyysi toiminnallisten polkuja ja verkostoja, luokka ”solu liikkeen” ilmestyi mielenkiintoinen ja asiaa ja me jatkoi edelleen geenejä, jotka liittyvät näihin toimintoihin array validointi.

Ingenuity Pathways Analysis tietokantaa käytetään osoittamaan geenejä biologisiin toimintoihin ja määrittää toimintoja, jotka rikastettu perusteella tilastollista merkittävyyttä.

Ingenuity Pathways Analysis tietokantaa käytetään osoittamaan geenien biologisia toimintoja ja määrittää toimintoja, jotka rikastettu perusteella tilastollista merkittävyyttä.

top verkot (useimmat yhteydet Keski-molekyyli) varten hypometyloidut ja voimistuvan geenit näkyvät sekä hypoksian (A) ja hypoglykemia (B). Intensiteetti punainen väritys molekyylien heijastaa ilmentymistason jollainen löytyy ilmaisun array (tummempi merkitsee suurempaa lisäystä ilmentymisen verrattuna kontrolli olosuhteissa).

Migration liittyvien geenien rikastuvat hypoksia ja hypoglykemia

cross-platform analyysi geenien hypometyloidut ja voimistuvan hypoksia ja hypoglykemia paljasti useita geenejä, jotka osallistuvat solujen liikkeen:

LDLR, LAMB3, ALDOA, PLAUR, SCAI,

ja

NEDD4L

vuonna hypoksinen ryhmässä (kuvio 3), ja

ITGB1, ETS1, IL6ST, sääntelyviranomaisten, TJP1, Smad3, TMOD3, LATS2, Klf4 ADI1, NCOA3, PTEN, CSNK2A2, TRIO, CSNK2A1, BRD4, RTN4, SEMA3C, NEDD4L

,

Cyr61, TFPI,

ja HEY1 in hypoglykeeminen ryhmässä (kuva 4). Lisäksi näiden geenien, havaitsimme kaksi muuta, jotka hypometyloidut ja voimistunut todennäköisesti myös osallistuvat solujen liikkeen.

ANKRD37

ja

AFAP1L1

että ”hypoksinen ryhmän on osoitettu olevan osallisena muuttoliike ja hyökkäys syöpäsolujen (taulukko 2). Monet ”solun liikkeen” geenejä analyysimme ovat mukana välittämässä solujen liitetiedoston joko muihin soluihin tai ECM tai ECM hajoamista, kaikki prosessit tarvitaan solun liikkua kudosten ja syöttää verisuonia.

Vahvistus lisääntyneen ilmentymisen solun liikkeen geenien

Käytimme qRT-PCR määrällisesti ilmentymistä valittujen geenien sekä hypoksia ja hypoglykemian ryhmiä. Valitsemme keskittyä geenien solujen liikettä tunnistettu cross-platform analyysin voimistunut ja hypometyloidut. Sillä hypoksia ryhmä, tutkimme

PLAUR

,

AFAP1L1

, ja

LAMB3

. Sekä PLAUR ja LAMB3 merkittävästi voimistunut hypoksia, verrattuna kontrolliin olosuhteissa (kuvio 6A). Kansi-ilmentymisen muutosten näiden kahden geenin määritettynä qRT-PCR: llä olivat verrattavissa kertamuutoksen nähdään ilmaisun array (taulukko 2). Geenit arvioitava ilmaisun muutokset qRT-PCR hypoglykeemisiä sisältyviä ehtoja

EPHA2

,

sääntelyviranomaisten

,

NEDD4L

, ja

Cyr61

. Kaikki neljä näistä geeneistä oli voimistunut ilmaisussa erilaisia ​​analyysi ja hypometyloidut että promoottori laatoitus array, paitsi EPHA2 ei hypometyloidut mukaisesti promoottori array. Merkittävä säätelyä EPHA2, NEDD4L ja Cyr61 hypoglykemian varmistettiin qRT-PCR (kuvio 6B).

cDNA tasoilla HCT116 kasvatettujen solujen hypoksia (A) ja hypoglykemia (B) mitattiin mielenkiinnon kohteena olevat geenit ja normalisoidaan p-aktiini ja hallita. N = 5 ilman hapen ja N = 3 ei ole glukoosia. * Tarkoittaa merkitsevää eroa suhteessa kontrolliin;

p

≤0.05.

iskeeminen-olosuhteissa parantaa HCT116 motiliteetin

Invasion analyysit suoritettiin vaikutusten määrittämiseksi iskemian solun liikkuvuuteen. 48 tunnin iskeeminen olosuhteissa, oli selvää, että solut altistetaan hypoksia ja hypoglykemian olivat merkittävästi lisääntynyt liikkuvuus ja invasiivisia ominaisuuksia määritettynä solujen kyky hajota ja kautta muuttaa matrigeelin (kuva 7). Tämä funktionaalinen määritys tukenut havainto, että kohonnut ilmentyminen liikkuvuuden liittyvien geenien kautta promoottori hypometylaatio iskeemiseen olosuhteissa kääntää fenotyyppisiä muutoksia HCT116-soluissa.

Solun otettuja kuvia 10 × suurennuksella alapuolelta Matrigel päällystetyn siirtoaltaat (A). Light taittovirheen soluja (mustat) osoittavat, että nämä solut vaelsivat läpi Transvvell- kalvon. Keskimäärin HCT116 soluja, jotka tunkeutuneet Matrigel päällystetty siirtoaltaat kuluttua 48 tunnin altistuksen hapettoman (NO) ja ei glukoosia (NG), jota seurasi 24 tuntia siirtoaltaat (B). * Tarkoittaa merkittävä ero valvonta;

p

0,01.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa käytimme cross-platform lähestymistapa tunnistaa genominlaajuisten muutoksia promoottori metylaatio ja geenien ilmentymisen selvittää, miten akuutin iskemian vaikutuksia metylaatio välittämän geeniekspression paksu- ja syöpäsoluja. Havaitsimme ja varmistanut, että geenien parantaa solujen liikkumista säännellään iskeemiset tilat, edustaa hypoksia ja hypoglykemia

in vitro

.

Välitön iskemia tapahtuu usein kiinteitä kasvaimia johtuu dynaamisen kasvaimen verisuonistossa ja nopea laajeneminen kasvaimia yli angiogeneesin [2]. Olemme aiemmin todettu, että akuutti iskemia johtaa alas-säätely sekä solukko- metyylisytosiinia sisällön ja DNMT ilmaisun ja toimintaa [27], [28]. Jatkaa tätä päätelmää ja mitkä geenit hypometyloidut ja voimistuvan iskemia maailmanlaajuisesti, käytimme alustoja, jotka jakavat yhteiset Affymetrix teknologiapohja helpottamiseksi ristiinvertailun aineistoja. Meillä on siis käytetty yksittäisen ohjelmisto bioinformatiikan paketti (Partek Perimän Suite) tuoda, analysoida ja korreloida raaka tiedot eri microarray alustoille [33]. Meidän genomin laajuinen, cross-platform tutkimuksessa, löysimme iskeemiset tilat merkittävästi yliaktiivista geenien solun liikkuvuus ja invaasio, ja nämä geenit olivat demetyloituu promoottorialueita tunnistetaan paneelit. Siksi meidän cross-platform analyysit osoittavat joukko geenejä, jotka näyttävät reagoivan ympäristön hypoksia ja hypoglykemia kautta muuttuneessa CpG metylaatio.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että jotkut HIF1 välittämää geenit (

esim CA9, EPO

) vaatia CpG sisällä hypoksiavaste elementin (HRE) olisi demetyloida jotta HIF1 sitomiseksi, ja ilmaisu tapahtuu [34] – [36]. S100A4, jäsen S100 perheen Ca

2 +: aa sitova proteiineja, tiedetään olevan osallisena syövän soluliikkuvuus sen kykyä aktivoida ei-lihaksen myosiinin, ja sen on osoitettu liittyvän mahalaukun syövän etenemisessä [ ,,,0],34]. S100A4 oli voimistuvan hypoksia munasarjasyöpä, joilla on alentunut metylaatio HRE in

S100A4

n promoottorialueille ja lisääntynyt sitoutuminen HIF1 [7]. Nämä tutkimukset tukevaa näyttöä kohti käsite, hypometylaatio tarvitaan hypoksinen edellytykset geenien ilmentymisen tapahtua.

asiaa geenin merkittävästi voimistunut ja hypometyloidut hypoksia meidän cross-platform analyysi on plasminogeeniaktivaattori urokinaasireseptorin tai PLAUR , reseptori urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA). uPA on seriiniproteaasi, joka katalysoi plasminogeenin plasmiiniksi, joka sitten heikentää ECM [35]. PLAUR osallistuu solujen liikkeen ja etäpesäkkeiden [36] ja ilmaisun kasvaa aikana kriittisen siirryttäessä vakava dysplastic adenooma invasiivisia karsinooma kolorektaalisyövässä [35]. Lisäksi PLAUR on yliaktiivista hypoksia [37] kautta HIF1 aktiivisuus [38], ja vastaa hypoksia välittämää invasiivisuus in HCT116-soluissa [39]. Sekä ligandi uPA säätelee transkriptiotekijä ETS1, ja sitoutumiskohdat ETS1

uPA

promoottori on myös demetyloituu varten transkription tapahtumisen [40].

Laminin beta 3 (LAMB3), alayksikköä laminiini- 5 (laminiini-332), on tyvikalvon proteiinin arvellaan välittävän soluunkiinnittymisaktiivisuutta, muuttoliike, ja järjestäminen solujen alkionkehityksen aikana. LAMB3 ilme on suurempi pahanlaatuinen ruokatorven okasolusyöpä kuin normaalissa kudoksessa, ja ilmaisun korreloi syvyys invaasion ja selviytymisen [41]. LAMB3 on myös raportoitu olevan hypometyloidut ja yläreguloituja mahasyövässä [42]. Olemme vahvistaneet, että LAMB3 oli yläreguloituja hypoksinen olosuhteissa CRC. Kiinnostavaa, yksi tutkimuksessa tutkittiin koolonadenokarsinooma koepaloja, ja näin laminiini- 5 positiivista värjäytymistä oli yhteydessä orastava syöpäsolujen sijaitsee kärjessä valtaavat pahanlaatuinen epiteelin, ja että laminiinin-5 colocalized kanssa PLAUR [43].

lisäksi

PLAUR

ja

LAMB3

,

S100A10

on toisen geenin voimistunut sekä hypoksia ja hypoglykemia perustuvat erilaisia ​​analyysi, ja sen on osoitettu olevan tärkeä syöpäsolujen invaasio ja etäpesäkkeiden kautta rinnakkaispaikantumisen kanssa uPA /PLAUR järjestelmän [44]. S100A10 yliekspressoituu mahasyövässä [45] ja on välttämätöntä kasvaimeen liittyvät makrofaagien kulkeutumista tuumorikohdat [46]. Olemme ensimmäinen ilmoittaa, että

PLAUR

ja

LAMB3

näyttävät olevan keskeinen geenikohteet iskeemia- välittämä hypometylaatio, samanlainen

S100A4

. PLAUR, LAMB3 ja S100A10 voitaisiin työskennellä yhdessä toistensa kanssa lisäämään solujen liikkuvuuden hypoksinen kasvaimia. Lisätutkimuksia tarvitaan sen määrittämiseksi, näitä proteiineja colocalized vuonna hypoksinen kudoksessa.

kysteiini-rikas 61 (Cyr61) kuuluu CCN perheen kasvutekijöiden. Cyr61 tiedetään yhdistää solun pinnan ja ECM, ja on liittyi solun tarttumiseen, proliferaatio ja migraatio [47]. Olemme tunnistaneet

Cyr61

kuin hypoglykemia-reagoiva geenin. Cyr61 ilmentyminen lisääntyy erilaisia ​​syöpiä, kuten rintasyöpää, melanoomaa, gliooma, mahan, paksusuolen, virtsarakon, eturauhasen, ja haiman [47]. Hiljentäminen Cyr61 vuonna osteosarkooman ja ruokatorven squamous karsinoomasoluja vähentänyt kulkeutumista ja solujen invaasiota [48], [49]. Cyr61 ilmentyminen on osoitettu korreloivan aggressiivisuus haimasyöpäsoluissa, mikä myös osoittaa, roolia tämän kasvutekijän etäpesäkkeiden [47]. Tähän mennessä ei ole olemassa tutkimuksia osoittaa, että

Cyr61

ilmentymistä säätelee promoottori metylaatio. Kuitenkin Cyr61 ilmentymistä säätelee transkriptiotekijä STAT3 [50], ja muut ovat osoittaneet, että CpG että STAT3 sitova sivusto edellyttää demetylaatio varten STST3 sitoa ja ilmaista sen kohdegeenien [51].

Kaksi muuta geenit, jotka yläreguloituja analyysimme hypoglykemia oli

EPHA2

ja

NEDD4L

. EPHA2 on transmembraaninen reseptori tyrosiinikinaasin, joka on yli-ilmentynyt useissa karsinoomissa, mukaan lukien varhaisessa vaiheessa ja peräsuolen syöpä [52], ja sen ilmentyminen korreloi kasvaimen invaasion ja metastaasin [53]. NEDD4L on E3 ubikitiinistä ligaasi osoitettu olevan lisääntyneen ilmentymisen sappirakon syövän etenemisessä. Käyttämällä siRNA, vaimentaminen NEDD4L vähensivät matrigeelin ja kollageeni invaasion sappirakon syöpäsolujen, ja sen rooli hyökkäys on mahdollisesti johtuu sen yhdessä MMPdden [54]. Tällä hetkellä ei ole olemassa tutkimuksia, jotka osoittavat, että promoottori demetylaatio voi olla vastuussa ylössäätely kumpaankaan geeneistä.

melanooma liittyviä antigeenejä (MAGE) ovat ryhmä geenejä, joiden ilmentyminen on vaiennettu useimmissa normaalissa somaattisen kudoksen, paitsi kiveksissä, mutta yläreguloituja moniin syöpiin [22]. Yksi tutkimus osoitti, että promoottorialueen

MAGE-A1

sisältää kaksi ETS sitovaa kohtaa, joka on demetyloida transkriptiotekijää sitoa ja ilmaisun esiintyvän [55]. Demetylaatio ja ilmentymistä havaittiin useilla eri syöpäsolulinjoilla, ja käsittely 5-atsa-dC kasvoi MAGE-A1 ilmentyminen normaaleissa fibroblasteissa vuoksi demetylaation promoottorialueella. Expression of MAGE-A1 ja -A4 on osoitettu korreloivan sairauden vaiheen melanoomapotilailla [23]. Sekä demetylaatio ja ilmentyminen MAGE-A1 ja -A3 on nähty kolorektaalisyövässä [22] ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaita, jossa ilmentyminen korreloi huonon ennusteen [24]. Meidän array tiedot osoittivat, että kaksi MAGE geeniä demetelyloitiin hypoksian (

MAGEA11

) ja hypoglykemia (

MAGEB1

), vaikka ei induktio ilmentymisessä havaittiin. Tästä huolimatta MAGE ovat ryhmä geenejä, jotka tukevat merkitys demetyloituneen CpG jäämien transkriptiotekijän sitoutumiskohtia, ja että demetylointi syöpä voi olla geeneille.

Kaksi muuta osallistuvia geenejä solun liikkumista,

AFAP1L1

ja

sääntelyviranomaisten

, joka todettiin olevan merkittävästi yliaktiivista hypoksia ja hypoglykemia että mikrosirut vastaavasti myös kvantitoitiin qRT-PCR. Molemmat näistä geeneistä ei osoittanut lisääntynyt ilme, kun tarkastetaan qRT-PCR, johtuen mahdollisesti ristihybridisaation epäspesifisiä sekvenssit tai silmukoitumisvarianttia kaksi yleisiä syitä välisiin eroihin microarray havainnot ja qRT-PCR [56].

on riittävästi todisteita kirjallisuudessa tukevat käsitystä, että CpG: t sisällä eri transkriptiotekijän sitoutumiskohtia (kuten HRE, STAT3 ja ETS) on demetyloida jotta transkription tapahtumisen, ja mikä tärkeintä, jotkut näistä geeneistä ovat mukana parantamisessa solun liikkuvuus. Tässä tutkimuksessa olemme osallistuneet tähän tärkeään käsitettä tarjoamalla todisteiden avulla cross-platform erilaisia ​​analyysi muiden solun liikkumisen geenejä, jotka ovat sekä hypometyloidut ja voimistuvan iskemia. Olemme validoitu muutokset ilmentyminen solun liikkeen geenien PLAUR, LAMB3, EPHA2, NEDD4L, ja Cyr61 iskeeminen olosuhteissa. On hyvin tunnettua, että HIF1α tasot ovat korkeampia rinta- ja paksusuolen syövän etäpesäkkeitä [3]. Tämä havainto täydentää havainto, että hypoksia vähenee metylaatio, ja että väheneminen metylaatio CpG on hRes voisi helpottaa HIF sitova ja promoottori geenin ilmentymisen. Ehkä hypoksian aiheuttamaa laskua DNMT tasoilla on varhainen tapahtuma primaarikasvaimia. Solut, joissa vähentynyt DNA: n metylaatio siis sitten viritetty transkriptiotekijän sitoutumiseen geenin promoottorit, jotka parantavat solujen liikkumista, kuten

PLAUR

. Tärkeys hypoksia syövän etenemisen on hyvin osoitettu kohdunkaulan syöpäpotilaille, joiden kasvaimet ovat hypoksinen ja ovat lisääntyneen etäpesäke verrattuna potilaisiin paremmin happipitoista kasvaimia [57]. On selvää, että hypoksia vaikuttaa syövän etenemiseen, ja maailmanlaajuisia muutoksia DNA: n metylaatio ovat yhteinen esiintyminen vaikuttavat syövän etenemistä [58].

IPA analyysi cross-platform tiedot geenejä, jotka molemmat hypermetyloitunut ja vaimentua tunnistettu geenejä mukana solun toimintoihin, kuten solujen liikkumista ja solusta soluun signaloinnin ja vuorovaikutus (taulukot II ja III Information S1). Downregulation liittyvien geenien soluadheesiota voisi käsitteellisesti osaltaan lisätä solujen liikkuvuutta ja etäpesäke. Edelleen kirjallisuuskatsaus, hyvin harvat näistä hypermetyloitunut ja vaimentua geenit liittyvät solu-soluadheesion. Vaikka mielenkiintoinen ajatus, meidän tiedot eivät tue poistaminen solusta-soluadheesiomolekyyli ilmaisu kuin todennäköinen mekanismi vastuussa lisääntyneestä motiliteetin nähdään iskemian.

DNMT estäjät, kuten decitabine on käytetty kliinisesti joidenkin menestystä hoitoon hematologisissa syöpäsairauksista, kuten akuutti myelooinen leukemia [59]. Teho kuitenkin näiden estäjien ei ole toistettu kiinteitä kasvaimia [60]. Syöpä genomit läpikäyvät hypometylaatio samanaikaisesti hypermetylaation [61], mikä edelleen hypomethylating kanssa DNMT estäjien vain ratkaisee puolet metylaation epäjärjestykseen. Lisäksi kiinteät kasvaimet on ainutlaatuinen ominaisuus puuttuu hematologisissa syövissä: mikroympäristön iskeemiseen alueisiin. Kuten olemme aikaisemmin osoittaneet, DNMT ilme ja toiminta vähenevät iskeemiseen olosuhteissa [28]. Siksi käytetään DNMT inhibiittorit tuumoreissa, joilla on iskeeminen alueet voivat olla tehottomia syövän hoidossa, jos näillä alueilla on jo käynnissä hypometylaatio seurauksena iskemia-välitteisen DNMT tukahduttaminen.

Päätelmät

On hyvin tiedossa että iskeemiset tilat ajaa syövän etäpesäkkeiden ja tässä ehdotamme mahdollinen mekanismi tähän tavallista: geneettisen hypometylaatio helpotti iskemia välittämä säätely alaspäin DNMTs. Merkittävä osa geenien vaikuttanut tämän valinnan paine ovat mukana solun liikkuvuus. III.