Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suurin osa ihmisen haimasyövän soluja ovat resistenttejä tuumorinekroositekijän (TNF) liittyvien apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) – välitteistä apoptoosia. Kuitenkin mekanismeja, joilla haimasyöpäsoluissa hyödyntää solunulkoisen molekyylien torjumiseksi proapoptoottiset signalointi välittyy TNF-perheen ovat suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että DcR3, erittyvä valereseptori että pahanlaatuisia haimasyöpäsoluissa ilmentävät korkealla tasolla, toimii solunulkoinen antiapoptoottisten molekyylin sitoutumalla TRAIL ja torjumaan sen kuolema mainostaisi. Vähentäminen DcR3 siRNA naamaria TRAILin ja lisää suuresti TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Gemsitabiini ensilinjan lääke haimasyöpä, myös alensi DcR3. Lisäämällä DcR3 siRNA entisestään gemsitabiini: n indusoiman apoptoosin. Erityisesti meidän

in vivo

Tutkimus osoitti, että terapeuttinen vaikutus gemsitabiinin voitaisiin tehostaa kautta vähentää edelleen DcR3, mikä viittaa siihen, että downregulation DcR3 kasvainsoluissa voisi vaaka haiman soluja kohtaan apoptoosin ja mahdollisesti toimia uusi strategia haimasyövän hoidossa.

Citation: Wang W, Zhang M, Sun W, Yang S, Su Y, Zhang H, et al. (2013) vähentäminen valereseptori 3 Parantaa TRAIL-välitteistä apoptoosia in Haimasyöpä. PLoS ONE 8 (10): e74272. doi: 10,1371 /journal.pone.0074272

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2013; Julkaistu: 25 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Natural Science Fund of China Grants (81071968) WW ja Key Program tieteellisen tutkimuksen Fujianin lääketieteellinen yliopisto (09ZD014) WW. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: toinen kirjoittaja Sunghee Kim työskentelee BioPowerTech. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Tasapaino proapoptoottiset ja antiapoptoottisten tekijöiden on suuresti vaikuttaa kohtalo kasvainsolujen . Nämä solut onnistuvat vaaka kohti selviytymistä yliekspressiolla antiapoptoottisten molekyylien solunsisäisten ja solujen väliset sivustoja. Elin tutkimukset ovat osoittaneet, että solunsisäiset B-solulymfooma 2 (Bcl-2) edistää syöpään useita kasvaimia, kun taas estää sen toimintaa tehostaa vaikutusta syöpähoitoihin [1], [2], [3]. Bcl-2 stabiloi mitokondrion kalvon ja estää vapauttamista sytokromi C mitokondrioissa ja muodostumista apoptosomes sytoplasmassa [4], [5], mikä vähentää tuumorisolujen apoptoosin ja parantaa kykyä kasvainten kasvaa ja etäispesäkkeitä.

kuitenkin suurin apoptoottisten signalointi aktivoidaan solun kautta sitoutuminen proapoptoottiset ligandeja yhdestä solusta kuolemaan reseptoreihin toisen solun pinnalla [6], [7]. Esimerkiksi ligandit tuumorinekroositekijän (TNF) -perheen sitoutuvat niiden reseptoreihin (esim TNF TNFR, FasL Fas, LIGHT HVEM /TR2), ja sitten käynnistää apoptoottisten signalointi vasteena epäsuotuisat tapahtumat [8], [ ,,,0],9]. Solunulkoista mekanismia, jolla solut suojella itseään ennen kuolemaa ligandit sitoutuvat niiden reseptoreihin on herättänyt paljon huomiota [10], [11]. Vaikka löytö houkutuslintujen reseptorien (esim DcR1, DcR2, ja DcR3) on hieman selventää tätä ilmiötä [8], [12], tarkempi käsitys näistä mekanismeista tarvitaan.

tuumorisoluja käyttää 2 suojakerrosta: (1) aktiivinen puolustusjärjestelmä, jossa decoy reseptorit estävät kuoleman ligandin ennen kuin ne saavuttavat TNF perheen solun pinnalla ja estää aloittamista kuoleman signalointi; ja (2) passiivinen puolustus järjestelmän, jossa antiapoptoottisten kone on rooli, kun kuolema signaali laukaistaan ​​solujen sisällä. Koska osat molekyylien tyypin I solukuoleman reseptorit (esim, DcR3, DR3, DR5, TNFR1, OPG ja OX40) ja kuolema ligandit (esim, FasL, LIGHT, TL1A, TRAIL, ja LTA) jakaa toiminnallisesti samankaltaisia ​​domeeneja, etenkin 6 jäsentä TNFR-perheen [13], käytettiin useita lähestymistapoja tutkia sitova ja vuorovaikutus DcR3 TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL). Tuloksemme osoittivat, että DcR3 sitoutuu paitsi FasL TL1A (vegi), ja LIGHT [14], [15], [16], [17], mutta myös TRAIL, mistä on osoituksena tuloksia useista määrityksistä, mukaan lukien Biacore sitovia, virtaussytometria, immunosaostuksella, Western blotting, ja entsyymi-immunologinen määritys (ELISA). Pahanlaatuisia haimasyövän-solut ekspressoivat korkean DcR3, joka voi vaimentua, jonka DCR3 siRNA tai kemoterapiaa huumeiden, kuten gemsitabiini. Yhdistelmä DcR3 siRNA TRAILin kanssa tai gemsitabiinin parantaa merkittävästi apoptoottisten prosessi

in vitro

ja hidastaa kasvaimen kasvua

in vivo

, mikä viittaa siihen, että downregulation solunulkoisen antiapoptoottisten DcR3 voi parantaa syövän hoitoon. Tämä pätee erityisesti aggressiivinen haimasyöpä, joka käyttää DcR3 keinona sen etenemistä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

kaksi ihmisen haimasyövän solulinjoissa , AsPC-1 ja MiaPaca-2, ja koolonikarsinoomasolulinjan, SW480, saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Soluja ylläpidetään mono-layer, Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä, 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä. DcR3 liittyvät reagenssit toimitti BioPowerTech (Tuscaloosa, AL). Gemsitabiini ostettiin apteekista yliopiston Rochester Medical Center (Rochester, NY). SiRNA DcR3 syntetisoitiin Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). Rekombinantti FasL ja TRAIL, ja niiden vasta-aineet hankittiin valmistajalta R sen jälkeen 100 ui 1:4000 streptavidiini-piparjuuriperoksidaasi (SA-HRP) lisättiin ja inkuboitiin kaivoissa 45 minuuttia 37 ° C: ssa, pestiin, visualisoitiin 3, 3 ’, 5, 5’ tetrametyylibentsidiini (TMB), ja lukea aallonpituudella 450 nm. Päinvastaisessa, levyt päällystettiin DcR3 (100 ui 2 ug /ml) ja inkuboitiin sitten rekombinantti FasL tai TRAIL (100 ui 1 ug /ml) kanssa tai ilman DcR3 (20-50 ug /ml, ja kilpailu) , jota seurasi biotinyloitu anti-FasL tai anti-TRAIL (0,5 ug /ml), SA-HRP, TMB ja lukea A

450.

ELISA DcR3

DcR3 oli kvantitatiivisesti mitattuna, kuten edellä on kuvattu 17]. Koska DcR3 on erittyvä proteiini, 100 ui viljelyalustaa on käytetty. Lyhyesti, sitä inkuboitiin yön yli ELISA-levylle päällystettiin anti-DcR3 McAB (2 ug /ml) 4 ° C: ssa. Sen jälkeen sekalaiset proteiinit pestiin pois, sitoutuneen DcR3 havaittiin biotinyloidulla anti-DcR3 McAB ja SA-HRP ja visualisoidaan TMB-substraattia. Tuntemattoman näytteen konsentraatio määritettiin standardikäyrältä, joka laskettiin samanaikaisesti.

alassäätely DcR3 kanssa Sirna (siRNA) B

Sirna sekvenssit ihmisen DcR3 suunniteltiin käyttäen BLOCK -Se RNAi Suunnittelija (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). SiRNA-sekvenssi oli 5′-CGCUGCAGCCUCUUGAUGGAGAUGUCC-3 ’, ja ohjaus siRNA sekvenssi oli 5′-AGGUAGUUCCAGAACUGCGUGUAGUGG-3’. Ne syntetisoitiin kemiallisesti ohimenevää knockdovvn DcR3 soluviljelmässä. Lisäksi, samanlainen sekvenssit insertoitiin pSilencer ekspressiovektoriin vakaa matala-DcR3 ilmaisija. Transfektio suoritettiin Lipofectamine LTX reagenssia (Invitrogen Life Technologies) ja Opti-MEM median mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut ohimeneviä knockdovvn DcR3 käytettiin 3 päivän kuluessa. Vakaa transfektantit valittiin 50 ug /ml hygromysiini B elossa solut yhdistettiin välttää siirtomaa vaihtelua ja käyttää

in vivo

tutkimuksessa.

Apoptosis määrityksissä

apoptoottisia soluja havaittiin 3 määrityksiä. Solut kerättiin 24-48 tuntia ja värjättiin anneksiini V /propidiumjodidia (PI) apoptoottisia soluja tai kiinnitetty 75% alkoholia jonka jälkeen PI värjäystä sub-G1 murto, standardin protokollan valmistajilta. Tulokset analysoitiin virtaussytometrialla. Western blottaus suoritettiin lohkaistun PARP. Kerätyt solut lyysattiin 1% NP-40-Tris-hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita, ja proteiinikonsentraatio lysaattia määritettiin BCA-menetelmällä (Pierce, Rockford, IL). Proteiinia (30 ug) ladattiin 10% SDS-PAGE, elektroforeesi, siirrettiin nitroselluloosamembraanille, inkuboitiin 0,5 ug /ml kanin anti-lohkaistaan ​​PARP tai anti-GAPDH (kuten kuormituksen valvonta), jota seurasi anti-kani-HRP ja visualisoitiin ECL kemiluminesenssisubstraatilla.

eläinten etiikka

Tämä tutkimus suoritettiin tiukasti mukaisesti ja hyväksytty yliopiston Rochester (Rochester, NY) Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC ), University lausuntoa eläinten Resources (UCAR), kuten hahmoteltu

opasta Responsible Care ja käyttö Laboratory Animals

. Kaikki pyrittiin minimoimaan kärsimyksen ja rajoittaa eläinten määrä. Kaikki eläimet, jotka osoittivat merkkejä heikkoudesta ja kuivuminen johtuu hoitoa saanut märkä ruoka ruokavalio. Eläimet, jotka jatkuvasti esittänyt heikkouden merkkejä oli inhimillisesti lopetettiin läpi kaula sijoiltaan.

Kasvaimen kasvu nude-hiirissä

verrokkitransfektantteja tai transfektanttien alhaisen DcR3 ilme (2 x 10

6 0,2 ml suolaliuosta) injektoitiin subkutaanisesti takajalat kateenkorvattomia nude-hiiriä (5-6 viikkoa vanhoja), jossa on 27,5-neula. Kasvainten annettiin kasvaa 7 päivää (noin 0,1 cm

3) ennen käsittelyä. Hiirillä, joilla on kasvaimia muodostettu joko kontrolli-transfektanttien tai transfektanttien alhainen DcR3 ilmaisu jaettiin satunnaisesti 2 ryhmään (8 hiirtä /ryhmä), käsiteltiin suolaliuoksella kontrollina tai gemsitabiinin (IV 100 mg /kg) kahdesti viikossa 4 viikon ajan. Sillä kasvaimen kasvukäyrä, kasvaimen koko mitattiin kahdesti viikossa noniusmittaharppia. Kasvainten tilavuuden laskettiin seuraavan kaavan mukaan

(L x W2) /2

mittaamalla kasvaimen pituus (L) ja leveys (W). Lopussa kokeen, kasvaimet poistettiin ja punnittiin. ELISA käytettiin arvioimaan DcR3 taso kasvaimen homogenaattia (30 ug). Western-blottaus suoritettiin DcR3: n, TRAILin ja pilkottiin PARP.

Tilastolliset analyysit

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD), joka on vähintään 3 määritystä, ellei toisin mainita. Erot välillä tai ohjaus- ja hoitoryhmien määritettiin Studentin

t-

testi tai varianssianalyysillä (ANOVA).

P

0,05 osoitti tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

DcR3 sitoutuu Trail

TRAIL on kalvoon sitoutunut kuolema ligandi heikosti normaaleissa viljelyolosuhteet ja DcR3 on erittyvä valereseptori. Vaikka FasL, TL1A, ja LIGHT on tunnistettu ligandeja DcR3 [14], [15], [16], [17], [18], vuorovaikutus DcR3 TRAILin kanssa ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti. Koska TRAIL osakkeita toiminnallisesti samanlainen verkkotunnuksia FasL, TL1A, ja LIGHT, me arveltu, että DcR3, joka sitoutuu FasL TL1A, ja LIGHT, voi sitoutua TRAIL.

Voit selvittää DcR3 sitoutuu TRAIL, me toteutettiin uusinta Biacore sitova analyysi. Rekombinantti puhdas DcR3 oli kovalenttisesti virtaus sirun pinnalle ja puhtaan yhdistelmä-TRAIL ja LIGHT (positiivisena kontrollina) huuhdottiin pinnan läpi eri pitoisuuksina. Kuvio 1 esittää sitoutumisen käyrä TRAIL DcR3 eri pitoisuuksina (1-2048 nM). Kuten taulukosta 1, vaikka ohjaus tasapainovakio (

K

ekv

) rekombinanttia ihmisen LIGHT DcR3 oli 13,2 nM, yhdistys nopeusvakio (

K

) ja disassociation nopeusvakio (

K

d

) rekombinantti ihmisen TRAILin DcR3 olivat 1,97 x 10

4 1 /Ms ja 1,04 x 10

-3 1 /s, vastaavasti, ja

K

ekv

oli 52,8 nM, mikä osoittaa sitoutumisen välillä TRAIL ja DcR3; kuitenkin, affiniteetti oli alhaisempi kuin LIGHT DcR3.

Biocore määrityksissä, virtaussytometrialla, Western blot ja ELISA-like sitoutumismääritykset suoritettiin määrittämään fyysisen vuorovaikutuksen DcR3 ja TRAIL. (A) Biacore-analyysi. Sitoutuminen käyrä TRAIL DcR3 määritettiin eri pitoisuuksina (1-2048 nM). Ohjaus

K

ekv

rekombinantin ihmisen LIGHT DcR3 oli 13,2 nM, kun taas

K

ekv

TRAILin DcR3 oli 52,8 nM. (B) Virtaussytometria DcR3 TRAILin kanssa solun pinnalla. Keskeytetään AsPC-1-soluja inkuboitiin ensin PBS: llä, TRAIL (5 ug /ml) ilman (kaista 2) tai DcR3: n (kaista 4), rekombinantti-DcR3: n (kaista 3), tai hiiren anti-TRAIL-MAb (1 ug /ml) kanssa DcR3 (kaista 5). Sen jälkeen, 5 ug /ml biotinyloitua anti-DcR3 lisättiin sitoutumisen määrittämiseksi DcR3 solun pinnalla virtaussytometrialla. (C ja D) virtaussytometrialla alttiina TRAIL. Gemsitabiini lisättiin AsPC-1 (0-1000 nM) tai MiaPaca-2 (0-100 nM) soluihin edistää ilmentymistä TRAIL. Soluja käsiteltiin myös PBS, 10 nM DcR3 siRNA (vähentää sitoutumista ja peittämisen TRAIL), tai muita rekombinantti-DcR3: n (estää sisäänpääsyä anti-TRAIL) havaita TRAIL virtaussytometrialla. (E ja F) rinnakkaispaikantumisen DcR3 ja TRAIL. AsPC-1-soluissa hoitaa ilman (kontrollina) tai 500 nM gemsitabiinin (parantaa ilmentymistä TRAIL) värjättiin anti-TRAIL-PE ja anti-DcR3-FITC. Doublestained solut arvioitiin virtaussytometrillä. (G L) immunoprecipitation ja Western blotting DcR3-TRAIL monimutkainen. 70-kDa DcR3-TRAIL monimutkainen 100 pl puhdasta DcR3 ja TRAIL seosta (G ja H), lysaatti (I ja J) tai elatusaineet (K ja L) AsPC-1-soluissa otettuja McAB anti-DcR3 ( G, I, K) tai anti-TRAIL (H, J, L) McAB ja immobilisoitiin 30 ui proteiini A helmiä. Kompleksi McAB-DcR3-TRAIL eluoitiin Laemmli-puskuriin ja altistettiin Western blotting biotinyloidulla anti-TRAIL (G, I, K) tai anti-DcR3 (H, J, L) seuraa SA-HRP ja ECL ilmaisin. (M ja N) Sitovat välinen kilpailu vapaa ja immobilisoitua muotoja DcR3 ja TRAIL. M: Kun 100 ui 1 ug /ml rekombinantti-TRAILin tai FasL immobilisoitiin ELISA-levylle, 1 ug /ml DcR3 lisättiin ilman (ei kilpailu ryhmä) tai 10 ug /ml TRAIL tai FasL (kilpailu ryhmä) tai keitetty TRAIL tai FasL (ei toimintoa proteiini ohjaus), jota seurasi biotinyloitu anti-DcR3 ja SA-HRP ja TMB-substraattia. N: DcR3 immobilisoitiin ELISA-levylle. TRAIL ja FasL käytettiin ligandien kanssa tai ilman keitettyä tai toiminnallisen 10 ug /ml TRAIL tai FasL: n läsnä ollessa DcR3, jota seurasi biotinyloitu anti-TRAIL tai anti-FasL, ja SA-HRP ja TMB-substraattia.

sen määrittämiseksi, sitoutuuko DcR3 TRAIL, me esi-inkuboitiin AsPC-1 ihmisen haimasyövän soluja tai ilman rekombinantti-DcR3: n, TRAIL, tai anti-TRAIL McAB, ja värjättiin sitten ne biotinyloidulla anti-DcR3: n, jota seuraa streptavidiini-FITC. Virtaussytometria (kuvio 1 B) osoitti, että samalla kun biotinyloitu anti-DcR3 ja streptavidiini-FITC: llä yksinään johtaa vähän värjäytymistä DcR3, rekombinantti-DcR3 voi sitoutua solun pinnalla ja voidaan havaita anti-DcR3: n. Koska kilpailu vapaa TRAIL ja kalvoon sitoutuneita TRAIL, yhdistelmä-TRAIL vähensi DcR3 solupintasitomis-. Tämä sitoutuminen pieneni myös preinkuboimalla anti-TRAIL, joka esti saatavuutta DcR3 kalvoon sitoutuneiden TRAIL. Yhdessä tulokset osoittavat, että yhdistelmä-DcR3 sitoutuu Trail pinnalla AsPC-1-soluissa.

Paremmin tarkkailla vuorovaikutusta TRAIL ja DcR3, käytimme gemsitabiini, ensilinjan antipancreatic syöpälääkkeen ja tunnetaan TRAIL indusoija upregulate TRAIL. Johtuen lääkkeen herkkyyden erot, AsPC-1-soluissa (kuvio 1C), joka tarvitaan 10-kertaisesti korkeampi gemsitabiinin lisätä ilmentymistä TRAIL, verrattuna MiaPaca-2-soluissa (kuvio 1 D). Oletimme, että liukoinen DcR3 voisi peittää TRAIL solun pinnalla; Näin ollen, vähentäminen DcR3 vähentäisi maskaus ja parantaa värjäyksen alttiina TRAIL. Tämän hypoteesin testaamiseksi, käytimme DcR3 siRNA lähestymistapaa. Vähentäminen DcR3 vähensi peittämisen TRAILin ja parantunut käytettävyys anti-TRAIL AsPC-1-soluissa (kuvio 1 C), kun taas ohjaus siRNA ei ole tällaista vaikutusta. Samoin, me arveltu, että lisääntynyt DcR3 ympäröivä soluja lisäisi maskeeraus ja vähentää saatavuutta anti-TRAILin TRAIL. Rekombinantti DcR3 lisättiin soluihin, mikä aiheuttaa vähentää TRAIL-värjäyksellä, kuten havaitaan virtaussytometrialla (kuvio 1C). Samanlainen malli havaittiin MiaPaca-2 (kuvio 1 D), mikä viittaa siihen, että ilmiö peittää TRAIL kanssa DcR3 on yleinen testatussa solulinjassa. Nämä tulokset tukevat voimakkaasti käsitystä, että DcR3 liittyy TRAIL solun pinnalla.

edelleen sitoutumisen määrittämiseksi DcR3 TRAIL, käytimme gemsitabiini laukaisemaan yliekspressio TRAIL [19], [20] ja lisätty yhdistelmä-DcR3. Kaksinkertainen värjäys anti-TRAIL-PE (punainen) ja anti-DcR3-FITC osoittautui paremmaksi rinnakkaispaikantumisen (kuvio 1F), verrattuna kontrolliin (kuvio 1 E), viittaa siihen, että DcR3 on fyysisesti liittyy TRAIL.

vahvista fyysinen yhdistys DcR3 TRAILin kanssa, suoritimme immunosaostuksella ja Western blotting. FasL, tunnettu ligandi DcR3, käytettiin positiivisena kontrollina. Tulokset osoittivat, että anti-DcR3-jää DcR3-TRAIL-kompleksia (noin 70 kDa MW lievästi denaturoivissa olosuhteissa) voitiin havaita anti-TRAIL seoksessa puhdasta rekombinantti-DcR3: n ja TRAIL (kuvio 1G), lysaattia (kuvio 1 I) tai medium (kuvio 1K) on AsPC-1-solut, jotka ilmensivät sekä DcR3 ja TRAIL. Samoin anti-TRAIL-jää DcR3-TRAIL kompleksi voitiin havaita anti-DcR3 samassa 3 asetuksia (kuvio 1 H, 1J, ja 1 I). Koska side-by-side positiivinen kontrolli, FasL näytteillä kuvio samanlainen kuin anti-FasL-kiinni DcR3-FasL kompleksi havaitaan anti-DcR3 (kuvio 1 G, 1I, ja 1K), joka tukee voimakkaasti käsitystä, että TRAIL ja FasL sitoutuvat DcR3. On huomattava, että DcR3-TRAIL muodostunut kompleksi ei vain puhdasta proteiinia tilassa (kuvio 1G ja 1H), mutta myös luonnon kunnossa kalvoon sitoutunut muoto (in lysaattia, kuva 1I ja 1J) ja sekretorisen muodossa (in media kuvio 1K ja 1L). Bändit DcR3-TRAIL monimutkainen media oli paljon hienompaa kuin bändejä lysaatin, mikä osoittaa, että kompleksi oli kalvoon sitoutunut. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​saatu virtaussytometrialla.

edelleen varmistamiseksi yhdistys DcR3 TRAILin kanssa, suoritimme ELISA kaltainen määrityksessä. Kun TRAIL tai FasL päällystettiin ELISA-levyt, sitoutumisen DcR3 näihin ligandeihin voitiin havaita anti-DcR3: n ja vähentää lisäämällä vapaan rekombinantti TRAIL tai FasL, jotka kilpailivat DcR3 immobilisoidun TRAIL tai FasL (kuvio 1M) . Sen sijaan, kun DcR3 päällystettiin ELISA-levyt, rekombinantti TRAIL tai FasL sitoutuneena immobilisoituun DcR3 ja detektoitiin anti-TRAIL tai anti-FasL, joka on myös osittain estetty vapaa muoto DcR3 (kuvio 1 N).

kaikissa kokeissa FasL-DcR3 kompleksin toimi side-by-side positiivinen kontrolli ja se osoitti kuvio samanlainen kuin DcR3-TRAIL-kompleksia (kuvio 1G, 1I, 1K. 1L ja 1 M), vahvasti tukeminen että TRAIL on todellakin uusi ligandi DcR3.

muuttaminen DcR3 vaikuttaa gemsitabiinin indusoiman apoptoosin

tutkia biologisen toiminnan DcR3 haimasyövän, mittasimme taso DcR3 jonka kvantitatiivinen ELISA DcR3 [21] in AsPC-1 ja MiaPaca-2 haimasyövän soluja. Verrattuna SW480, ihmisen paksusuolen adenokarsinooman solulinja, joka on tunnettu ilmaisemaan korkeita DcR3, verrattuna muihin 13 solulinjat [22] AsPC-1 ja MiaPaca-2-soluissa oli vieläkin korkeampi DcR3 (kuvio 2 A), joka on yhdenmukainen muiden raporttien [23], [24]. Sekä DcR3 ja TRAIL ilmaistu korkealla tasolla samalla soluihin, mikä viittaa siihen, että antiapoptoottisten ja proapoptoottiset molekyylit ovat tasapainossa korkealla tasolla torjua toisiaan. Luonnollinen ilmaus korkeita molempien molekyylien tekee tutkimuksen niiden vuorovaikutusta paljon helpompaa.

(A) DcR3: n ekspressio AsPC-1, MiaPaca-2, ja SW480-solut (positiivisena kontrollina). DcR3-tasolla 100 ui vakioitua elatusainetta soluista, jotka kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä (4 ml) mitattiin ELISA: lla. (B ja C) Gemsitabiini pienentää DcR3 ilme. AsPC-1 ja MiaPaca-2-soluja käsiteltiin gemsitabiinin ilmoitettuina pitoisuuksina 48 tuntia. DcR3 taso mitattiin 100 ui elatusainetta kustakin ryhmästä. (D) siRNA tippuu alas DcR3 ilme. -Soluja (1 x 10

5) 6-kuoppalevyillä transfektoitiin 10 nM DcR3 siRNA tai ohjata siRNA Transfectin LTX (6,25 ul /kuoppa). 24 tunnin kuluttua DcR3 elatusaineissa mitattiin ELISA.

määrittämiseksi interaktiivinen vaikutus DcR3 ja TRAIL syöpäsolujen, gemsitabiinia ja siRNA DcR3 käytettiin säätelemään tasoa DcR3. AsPC-1 ja MiaPaca-2-soluja käsiteltiin eri annoksilla gemsitabiinin 48 tuntia, ja taso DcR3 median mitattiin ELISA: lla. Tulokset osoittivat, että gemsitabiini vähentää DcR3: n annoksesta riippuvalla tavalla molemmissa solulinjoissa (kuvio 2B ja C). Samanlainen väheneminen havaittiin siRNA (kuvio 2D).

Jos toiminto gemsitabiinin pienennetty DcR3 on kärki balanssia apoptoosin, sitten lisäämällä DcR3 peruutusmatkan gemsitabiinia indusoiman apoptoosin. Näin ollen, AsPC-1 ja MiaPaca-2-soluja käsiteltiin eri annoksilla gemsitabiinin kanssa tai ilman rekombinantti-DcR3: ssa 48 tuntia, ja sitten apoptoottisten solujen mitattiin anneksiini V-värjäyksellä. Tulokset osoittivat, että 5-8% soluista oli apoptoottisia valvonnassa, joka kasvoi noin 30% vuonna gemsitabiinin ryhmässä. Tämä gemsitabiinin indusoiman apoptoosin pelkistettiin lisäämällä rekombinantti-DcR3: n (0, 0,5, 1, ja 2 ug /ml), annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3A ja 3B). Samoin gemsitabiinin aiheuttama lisäys kaspaasi 3 aktiivisuuden purettiin DcR3 (kuvio 3C ja 3D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DcR3 on ratkaiseva rooli apoptoosin ja että gemsitabiinin aiheuttama väheneminen DcR3 voi liittyä sen kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta.

Gemsitabiini lisättiin tiedotusvälineet AsPC-1 (500 nM) tai MiaPaca-2-solut (50 nM) inkuboitiin 0, 0,5, 1, tai 2 ug /ml rekombinantti-DcR3: ssa 24 tuntia. Sitten solut altistettiin virtaussytometrialla varten osa-G1 fraktion (A ja B) tai entsyymi määrityksen kaspaasi 3: n aktiivisuuden (C ja D). Gemsitabiini laukaisema apoptoosin väheni lisäämällä DcR3 annoksesta riippuvaisella tavalla (

P

0,01).

alassäätely DcR3 siRNA edistänyt TRAIL-välitteisen apoptoosin vitro

Voit testata, jos paljastumisen TRAIL voisi lisätä saatavuutta sen reseptoriin ja parantaa tämän kuoleman reitin, tutkimme vaikutus DcR3 TRAIL-välitteisen apoptoosin. DNA pirstoutuminen (sub-G1) määritys osoitti, että kun AsPC-1-soluja käsiteltiin FasL tai LIGHT plus kontrolli-siRNA tai DcR3 siRNA, apoptoosin ei kasva merkittävästi. Kuitenkin, kun käsitellään TRAIL ja DcR3 siRNA, AsPC-1-solut osoittivat dramaattisia apoptoosin lisääntyminen, verrattuna soluihin, käsiteltiin TRAIL plus ohjaus siRNA (kuvio 4A). MiaPaca-2-solut osoittivat samanlaista mallia (kuvio 4C). Parannettu apoptoosi vahvistettiin edelleen lisääntynyt lohkaista PARP, määritettynä Western blottauksella (kuvio 4B ja 4D). Tulokset osoittavat, että vähensi DcR3 voisi parantaa huomattavasti proapoptoottiset vaikutusta TRAIL näissä 2 haimasyövän solulinjoissa (verrattuna FasL ja LIGHT), kun taas DcR3 hyödynnetään näiden solujen vastustamaan proapoptoottiset vaikutusta TRAIL.

AsPC-1 tai MiaPaca-2-solut transfektoitiin 10 nM ohjaus siRNA tai DcR3 siRNA, vastaavasti. 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin yhdistelmä-FasL, LIGHT, tai TRAIL (100 ng /ml AsPC-1 ja 20 ng /ml MiaPaca-2-solut) 24 tunnin ajan. Solut kerättiin ja alistettiin virtaussytometria varten osa-G1 fraktion (A ja C) tai Western-blottaus ja pilkotun PARP (B ja D). DcR3 siRNA merkittävästi parannettu TRAIL: n indusoiman apoptoosin (

P

0,05).

DcR3 vaikuttanut gemsitabiinin-välitteistä apoptoosia in vitro

DcR3 siRNA ja gemsitabiinin vähensi ilmentymistaso DcR3 (kuvio 3 ja 4). Halusimme selvittää, onko edelleen downregulation DcR3 kautta näiden yhdistelmä 2 tekijät voivat tehostaa proapoptoottiset vaikutus, verrattuna yksi asia yksin. Sen jälkeen soluja käsiteltiin joko siRNA tai gemsitabiini yksin tai yhdistelmänä, DNA: n fragmentoituminen ja pilkkoa PARP mitattiin. Tulokset osoittivat, että samalla kun gemsitabiini yksin aiheutti lisääntynyttä apoptoosia (kuvio 5A ja 5C), ja pilkotaan PARP tasoilla (kuvio 5B ja 5D), sen yhdessä siRNA entisestään apoptoosin ja pilkotaan PARP tasoilla (kuvio 5). Ilman proapoptoottiset ligandin, joka sitoo ja torjumiseksi, DcR3 siRNA yksinään ei ollut vaikutusta; kuitenkin, kun TRAIL oli voimistuvan gemsitabiini, vähentäminen DcR3 laski peittämisen TRAIL, mikä edistää apoptoosia.

AsPC-1 tai MiaPaca-2-solut transfektoitiin 10 nM ohjaus siRNA tai DcR3 siRNA, vastaavasti . 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin gemsitabiinin (250 tai 25 nM, vastaavasti) 24 tunnin ajan. Solut kerättiin ja alistettiin virtaussytometria varten osa-G1 fraktion (A ja C) tai Western-blottaus ja pilkotun PARP (B ja D). Yhdistelmä DcR3 siRNA ja gemsitabiinin merkittävästi parantanut proapoptoottiset vaikutus.

Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​kuviossa 3. Yhdessä tulokset on esitetty kuvioissa 1 ja 4, tiedot viittaavat siihen, että DcR3 sitovia että TRAIL vähentää TRAIL: n indusoiman apoptoosin ja suojaa kasvainsoluissa, mikä saattaa selittää vastus kasvaimia TRAIL hoitoon.

alassäätely DcR3 tehosti kemoterapeuttista vaikutusta kasvaimen kasvua in vivo

rohkaisemana lupaava

in vitro

tuloksia, halusimme onko vähentämiseen DcR3 voisi tehostaa kemoterapian

in vivo.

AsPC-1-solut transfektoitiin nisäkkään ekspressiovektorilla, joka sisälsi siRNA on pudotus ilmaus DcR3 ja kasettia G418-valinnan. Yhdistetyt vektori mock-transfektiosta solut (kontrollina) tai DcR3 siRNA transfektoidut solut, joilla on alhainen DcR3 ilmentymistä (varmistettiin ELISA) injektoitiin nude-hiiriin, ja vakiintuneita kasvaimia (60 mm3) käsiteltiin sitten gemsitabiinia.