Krooninen sairaus

tiivistelmä

Havainto, että galektiini-7 (gal-7) on nimenomaisesti ilmaistu rintarauhasen myoepithelial (pohjapinta) solut sai meidät tutkimaan, onko tämä proteiini ekspressoituu tyvisoluista muiden kudosten. Koska rinta- ja eturauhassyöpää on merkittävä taustalla biologinen yhtäläisyyksiä ja koska tärkeitä rooleja tyvisolujen eturauhassyövässä, tutkimme ilmentymiskuviot ja roolia gal-7 ihmisen eturauhassyöpää. Käyttämällä kudosta microarray, olemme havainneet, että vaikka gal-7 helposti ilmaistaan ​​tyvisoluissa normaalissa eturauhaskudoksessa, se on vaimentua eturauhassyövässä (PCa) soluja.

De novo

ilmentymisen gal-7 eturauhassyöpäsoluissa lisää niiden herkkyyttä apoptoosia vasteena etoposidi ja sisplatiini. Arviointi hiilihydraattia (CRD) -defective mutantti muodossa gal-7 (R7S) osoitti, että kyky tämän proteiinin moduloida apoptoosia oli riippumaton sen CRD toimintaa. Toiminta oli myös riippumaton sen kyky translokoituvat että mitokondrioiden ja ydinvoiman osastoja. Kuitenkin, CRD aktiivisuus oli välttämätöntä estää invasiivisen käyttäytymisen eturauhasen syöpäsoluja.

In vivo

, gal-7 yliekspressio PCA soluissa johti vaatimaton mutta merkittävä väheneminen kasvaimen koon, kun taas sen CRD-viallisen mutantin muodossa kasvanut merkittävästi kasvaimen kasvua kontrolleihin verrattuna. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikka

de novo

ilmentymisen gal-7 voi olla mielenkiintoinen keino lisätä kasvaimia fenotyypit Eturauhassyövän soluja, muutoksia CRD tämän proteiinin ajaa fenotyyppiset kytkin rooliaan PCA soluissa. Tämä CRD-riippumaton toiminta edustaa paradigman muutosta ymmärrystämme toimintojen galektiini. R74S malli on hyödyllistä erottaa CRD-riippuvaisen ja CRD-riippumattomia toimintoja gal-7 syövän etenemiseen.

Citation: Labrie M, Vlădoiu M, Leclerc BG, Grosset AA, Gaboury L, Stagg J, et ai. (2015) mutaation Carbohydrate Recognition Domain Ajaa Fenotyyppiset kytkin merkityksestä galektiini-7 Eturauhassyöpä. PLoS ONE 10 (7): e0131307. doi: 10,1371 /journal.pone.0131307

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2015 Hyväksytty: 1 kesäkuu 2015; Julkaistu: 13 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Labrie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Kanadan Institutes for Health Research (Grant No. MOP-89697) ja YSP (http: //www.cihr-irsc. gc.ca/). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Huomaa, että Yves Saint-Pierre on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

galektiini-7 (gal-7) on p53 aiheuttama geeni, joka on pääasiassa ilmaistu kerrostunut epiteelisoluissa [1, 2]. Sen ilmentymistä voidaan saada aikaan myös muut transkriptiotekijät, mukaan lukien mutantti- muodot p53 ja CCAAT /tehostajan sitovan proteiinin beeta (C /EBPβ) [3, 4]. Sen ilmentymistä säätelee myös epigeneettiset mekanismit, mukaan lukien DNA: n metylaatio [5, 6]. Sen rooli UVB aiheuttaman keratinosyyttien apoptoosin [7] ja uudelleen epiteelin sarveiskalvon haavat [8] tukevat ajatusta, että gal-7 on tärkeää säilyttää homeostaasiin epiteelisoluissa. Unsuprisingly, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että dysregulaatio gal-7 ilmentyminen on voimakas vaikutus etenemistä useiden syöpien epiteelisolujen alkuperää. Nisän kudoksissa, esimerkiksi gal-7 on spesifisesti ilmaistu myoepithelial (pohjapinta-solut), ja sen yli-ilmentyminen rintasyövän kudoksissa korreloi resistenssin apoptoosia ja leviämisen metastaasin luun ja keuhkojen [9]. Yli-ilmentymisen gal-7 liittyy myös huono selviytymisen potilailla, joilla epiteelin munasarjasyöpä [6, 10] ja pahanlaatuisuuteen potilailla, joilla on levyepiteelisyövän kielen [11]. Nämä assosiaatiot poikkeuksellisen runsaasti gal-7 ja huonon ennusteen esiintyvät myös ruokatorven ja hypopharyngeal levyepiteelikarsinoomia [12, 13]. Kuitenkin, koska useat tutkimukset ovat osoittaneet, gal-7, samanlainen kuin muut galectins, on kaksijakoinen rooli syövän ja voi olla suojaava rooli tietyissä tapauksissa, erityisesti lisäämällä herkkyyttä syöpäsolujen pro-apoptoottisen ärsykkeen ja vähentämällä solujen kasvua ja angiogeneesiä. Nämä toimet ovat suhteellisen hyvin dokumentoitu mahalaukun, urothelial, ja paksusuolen syövät, sekä kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma syöpä [6, 14, 15]. Itse asiassa havainnot geenimuunnellut kohdunkaulan, maha- ja koolonkarsinoomasoluissa yli-ilmentävät Gal-7 eivät aiheuttaa mahalaukun kasvainten ksenosiirrettyjä hiirillä viittaavat siihen, että epigeneettisellä huumeita tai gal-7-erityisiä geeniterapian voitaisiin tukahduttaa kehitystä tietyntyyppisten syöpä [6, 14, 15]. Koska kasvava suosio epigenetic syövän hoitomuotoja, on siis välttämätöntä selvittää gal-7 on pro- tai anti-kasvain toiminto tahansa syöpätyypin, erityisesti ne epiteelin alkuperä.

eri roolit gal-7 syöpien epiteelin alkuperä on tällä hetkellä epäselvä, ja voi liittyä eri tekijät. On ensin otettava huomioon, että on tärkeää solunsisäisen lokerointi gal-7, joka on löydetty sytosolin, mitokondrioiden ja ydinvoiman osastot [15-17]. Gal-3, esimerkiksi, voi aiheuttaa resistenssin apoptoosia, ja tämä aktiivisuus riippuu sen translokaation päässä sytosolista mitokondrioiden [18]. Onko tällainen solunsisäisen compartimentalization on myös tärkeää gal-7 säädellä apoptoosia ei tunneta. Vaihtoehtoisesti kaksoisrooli gal-7 voi riippua sen sitoutumispartnereihin koska se on hyvin tiedetään sitoutuvan glykosyloituja proteiineja kautta hiilihydraatti-(CRD). On yhä enemmän merkkejä, kuitenkin, että galectins myös vuorovaikutuksessa ei-glykosyloituja proteiineja CRD-riippumattomalla tavalla [19]. Tämä havainto on hyvin dokumentoitu solunsisäisen galectins. Tärkein ominaisuus solunsisäisen galectins voi olla niiden kyky sitoutua suoraan Bcl-2-perheen jäsenten kautta CRD-riippumaton vuorovaikutus. Tämä aktiivisuus on osoitettu monien galectins, mukaan lukien gal-7 [16]. Galektiini /Bcl-2 vuorovaikutuksen siirtää tasapainoa toiminnan välillä pro- ja anti-apoptoottisen jäseniä Bcl-2-perheen säädellä apoptoosia [16, 20, 21]. Muut CRD-riippumaton toimintoja galectins sisältävät RNA käsittely tumassa [22] ja säätelyyn solusyklin etenemisen [23]. Kaikki nämä CRD-riippumattomia toimintoja luottaa proteiini-proteiini vuorovaikutusten. Itse asiassa, tietyt galectins, kuten gal-10, satama merkittävästi alhainen affiniteetti galaktosidit, ja niiden uskotaan toimivan pääasiassa muut tekijät [24]. Nämä CRD-riippumattomat toiminnot edustavat paradigman muutos ymmärrystämme galektiini toiminta ja kehittämisessä galektiini-inhibiittoreiden.

Havainto, että gal-7 on nimenomaan ilmaistu epiteelisoluissa, erityisesti rintarauhasen myoepithelial (pohjapinta ) soluja (mutta ei onteloerityssolut), sai meidät tutkimaan, onko se ilmaistaan ​​tyvisolut muiden kudosten. Koska rinta- ja eturauhassyöpää on merkittävä taustalla biologinen yhtäläisyyksiä [25] ja koska merkittävä rooli tyvisolujen eturauhassyövän [26], tutkimme ekspressiokuviota ja roolia gal-7 ihmisen eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja eläimet

PC3 [27] ja DU-145 [28] solulinjat olivat antelias lahja tri Benoit Ochietti (McGill University, Montreal, QC) ja LNCaP [29] ystävällisesti Dr. Thomas Sandersons (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC. HaCaT solulinja [30] saatiin tohtori Thierry Magnaldo (Génétique et Physiopathologie des Syövät Épidermiques, faculté de Médecine, Nice, Ranska). Kaikkia solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa on alun perin saatu American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). DU-145 ja HaCaT solulinjoja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa . PC3 ja LNCaP solulinjoja pidettiin F-12k ravinneseosta ja RPMI 1640-väliaine, vastaavasti. Viljelyalustassa, johon oli lisätty 10% (v /v] naudan sikiön seerumia, 2 mmol /L L-glutamiinia, 10 mmol /L HEPES-puskuria, ja 1 mmol /l natriumpyruvaattia. Kaikki soluviljelmässä tuotteet hankittiin Life Technologies (Burlington , oN, Kanada). NOD /SCID hiiret saatiin The Jackson Laboratory. Eläimiä pidettiin steriileissä olosuhteissa

mielinmäärin

pääsy ruokaan ja veteen. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Institutional animal Care ja käyttö komitean Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal

immunohistokemia

kudossiruina käytettiin määrittämään 32 kudosnäytteitä eturauhasen adenokarsinooma, 20 liikakasvu, 5 saccular ektasia ja 3 syöpä -adjacent normaalissa eturauhasessa kudoksissa (US Biomax-, Rockville, MD, USA ja elinikä BioSciences, Seattle, WA, USA). immuunivärjäytyminen reaktioita gal-7 tehtiin käyttämällä Discovery XT automatisoitu immunostainer (Ventana Medical Systems). parafiini leikkeitä inkuboitiin solun ilmastointi, pH 8,0 (Ventana Medical Systems), antigeenin haku ja värjätään sitten 60 minuuttia anti-ihmis-gal-7 polyklonaalista vasta-ainetta (R Life Technologies). Kaikki antiseerumit laimennettiin 1% (w /v) PBA, ja kaikki pesuvaiheet suoritettiin PBS: llä. Tumat värjättiin pidentää Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää Reagenssi 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Life Technologies). Soluja visualisoitiin Carl Zeiss LSM780 -konfokaalimikroskoopilla, ja digitoitujen kuvien luotiin käyttäen Carl Zeiss Zen ohjelmisto (Zeiss, Jena, Saksa).

RNA: n eristys ja RT-PCR-

Yhteensä RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ensimmäisen juosteen cDNA valmistettiin 2 ug solu-RNA: n reaktion kokonaistilavuus 20 ui käyttäen Omniscript käänteistranskriptaasia (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada). Sen jälkeen Käänteistransskription ihmisen

gal-7

(geeni ID 3963, sense-aluke: 5′-TCC CAA TGC CAG CAG GTT CCA TGT-3 ’ja antisense-aluketta: 5’-GAA GCC GTC GTC TGA CGC GAT GAT-3 ’) ja

GAPDH

(geeni ID 2597, sense-aluke: 5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′ ja antisense-aluketta: 5′-CAG AAG TGG TGG TAC CTC TTC CGA -3 ’) cDNA: ta monistettiin seuraavissa olosuhteissa: 94 ° C 3 min, sitten 35 sykliä 94 ° C: ssa 40 sekuntia, 60 ° C: ssa 40 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 40 sekunnin ajan ja sitten lopullinen laajennus vaihe 72 ° C: ssa 10 min. PCR suoritettiin lämpösyklilaitteessa (MJ Research, Watertown, MA). Monistetut tuotteet analysoitiin 1% (paino /tilavuus) agaroosigeelissä elektroforeesilla, jota seuraa geelin värjäys SYBR Safe (Life Technologies).

Generation of ekspressoivat stabiilit transfektantit gal-7

saadaan stabiili DU-145 transfektantit ekspressoivat gal-7

paino- tai gal-7

R74S, cDNA: t, jotka koodaavat villityypin tai mutatoidun (R74S) ihmisen gal-7-geeni kloonattiin SRa eukaryoottiekspressiovektoriin (saatiin ystävällisesti Dr. François Denis), kuten aiemmin on kuvattu [17] Ohjaus solut muodostettiin käyttäen tyhjän SRa vektori. Transfektiot suoritettiin Lipofectamine 2000 mukaan valmistajan ohjeiden (Life Technologies). 48 tunnin kuluttua viljelyn, transfektoitujen solujen annettiin kasvaa täydelliseen kasvualustaan, joka sisälsi 2 ug /ml puromysiiniä. Yksittäisiä pesäkkeitä laajennettiin, ja gal-7: n ilmentymistä seurattiin Western blot -analyysillä. Vähintään kaksi kloonia kustakin käytettiin tulosten varmistamiseksi.

Western blot-analyysi

kokosoluekstraktien, solut homogenisoitiin ja suspendoitiin uudelleen radioimmunologisissa määritys (RIPA) puskuria ( Thermo Fisher Scientific, Ottawa, oN, Kanada), joka sisältää proteaasi-inhibiittorit (Roche, Mississauga, oN, Kanada). Mitokondrioita ja tumat eristettiin käyttämällä mitokondrion eristyspakkausta (Thermos Scientific) ja ydinvoiman liuuttovälinepakkausta (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada), vastaavasti, mukaan valmistajan ohjeiden. Yhtä suuret määrät kokosolu-, sytoplasminen mitokondrioiden tai tumauutteita erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Kanada). Membraanit blokattiin ensin 5% (w /v) maito PBS /0,5% Tween 20 (v /v) 60 min ajan huoneenlämpötilassa ja tämän jälkeen blotattiin yön yli liuoksessa, joka sisälsi 3% PBA, 0,5% Tween 20, ja seuraavat vasta-aineet: vuohen anti-hiiri-gal-7 polyklonaalista vasta-ainetta (laimennettu 1: 1000, R Epitomics, Burlingame, CA, USA), hiiren anti-β-aktiini (1: 20000, Sigma-Aldrich), kanin anti-COX IV (1: 1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), joka on kanin anti-tubuliinia (1: 1000; Cell Signaling Technology) tai hiiren anti-Lamin A /C (1: 1000; Cell Signaling Technology) vasta-aine. Toissijainen vasta-aineet sisältyvät piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla aasin anti-kani (GE Healthcare, Baie-d’Urfé, QC, Kanada), aasin anti-vuohi (R kuitenkin, mRNA ilmentyi alhaisella mutta havaittavissa määrin PC3-soluissa (kuvio 1). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että vaikka gal-7 helposti ilmaistaan ​​Tyvisolujen normaalin eturauhasen kudosta, se on täysin poissa eturauhasen syöpäsoluja.

immunohistokemiallinen (IHC) värjäys gal-7 3-um paksu osa formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (A) tervettä eturauhasen kudosten ja (B) kudoksissa, jotka liittyvät patologisiin häiriöihin eturauhasen. (C) Semikvantitatiivinen RT-PCR: llä ja (D) Western blot analyysi gal-7 ilmentymisen DU-145, PC3 ja LNCaP ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. HaCaT keratinosyyttisolulinjan käytettiin positiivisena kontrollina. GAPDH ja β-tubuliinin käytettiin lastaus valvontaa. LC: onteloerityssolut, BC: tyvisolut, ja ECM: soluväliaineen.

tuotanto ja luonnehdinta villin tyypin ja CRD-vialliset gal-7-proteiinin

Tutkiakseen toimintojen gal-7 eturauhassyöpäsoluissa ja määrittää, että on tärkeää sen CRD, me syntyy sarja ekspressoivat stabiilit transfektantit villityypin gal-7 ja mutatoitunut muoto (R74S) proteiinin (kuvio 2A). Tämä mutaatio tiedetään estävän kyvyn gal-7 sitoutua laktoosia ja vähentää translokaatiota päässä sytosolista mitokondrioita ja /tai tumassa [17]. Aikaisemmat analyysi käyttäen liuosta NMR-spektroskopia osoitti, että R74S mutaatio aiheuttama vain rajoitetusti ja paikallisia muutoksia gal-7 taitto. Täsmentämiseksi, missä määrin CRD gal-7 on repinyt R74S mutaatio, vertasimme sen sitovat ominaisuudet kuin villityypin gal-7 käyttäen CFG glykaanitähteen array (versio 5.2) [31]. Koko lista glykaanien testattu ja tulokset sitoutumismäärityksissä löytyy netistä (https://functionalglycomics.org/). Tuloksemme vahvistivat, että R74S mutaatio tukahdutetaan CRD aktiivisuutta riippumatta glykaanirakenteeseen motiivien arvioitiin (kuvio 2B, S1 taulukko). Tämä suppressio CRD aktiivisuus varmistettiin virtaussytometrianalyysillä sitoutumisen FITC-leimattua rekombinantti-gal-7

paino- ja gal-7

R74S pinnoilla DU-145 eturauhassyövän soluissa (kuvio 2C ja 2D) . Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että R74S poistetaan CRD aktiivisuutta ihmisen gal-7.

(A) 3D-näkymä gal-7

paino- ja gal-7

R74S CRD läsnäollessa laktoosia. (B) glykaanitähteen array käytettiin tarkistaa sitoutumisen gal-7

paino- ja gal-7

R74S hyvin monenlaisia ​​sokereita. Käyrä kuvaa sitoutumista gal-7

paino- ja gal-7

R74S sokerit. Vain RFU: t suurempia kuin 10000 on esitetty. Sokerin nimet luetellaan S1 taulukossa. Virhepalkit edustavat SDS (n = 6). Virtaussytometria-analyysi osoittaa sitoutumisen gal-7

paino- ja gal-7

R74S pinnoille DU-145-soluja (C) ilman tai (D) läsnä ollessa 0,1 M β-laktoosia. Sitoutumismääritykset suoritettiin käyttäen esitettyä pitoisuuksia FITC-leimattua rekombinantti-gal-7. MFI: keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

Characterization solunsisäisen lokalisaation villityypin gal-7 ja gal-7

R74S

roolin tutkimiseksi gal-7 ja sen CRD eturauhassyövässä, DU-145 transfektantit joka joko gal-7

paino- tai gal-7

R74S syntyi. Ohjaus transfektantteja (tuotettu käyttäen tyhjä ekspressiovektoreita) ei ilmentänyt havaittavia tasoja gal-7 (kuvio 3A ja 3B). Immunoblottauksella mitokondrioiden ja ydinvoiman fraktiolla osoitti havaittavaa ekspressiota gal-7

paino- sytosoliin, mitokondriot ja tumat DU-145-soluja (kuvio 3C ja 3D). Sitä vastoin ei ollut havaittavaa ekspressiota gal-7 mitokondrioissa transfektanttien ilmentävien gal-7

R74S. Molemmat proteiinit havaittiin solunulkoisen media solujen (kuvio 3E). Elektronimikroskopia analyysi DU-145-soluja vahvisti ilmentymisen gal-7

paino- sytosoliin, ydin, ja mitokondrion ulkokalvon, kun taas ekspressio gal-7

R74S rajoitettiin sytosoliin (S1 kuvio ). Mielenkiintoista, elektronimikroskoopilla analyysi paljasti gal-7

p- ja gal-7

R74S-rikas kohoumia solukalvon (S1 kuvio) yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien, mikä viittaa siihen, että gal-7 kumppaniaan aktiini solun tukirangan säädellä solun liikkuvuus [10, 32, 33].

(A) Western blot -analyysi, joka esittää ilmentymisen gal-7 eri vakaa DU-145 kloonit transfektoitiin ekspressiovektoreilla, jotka koodaavat villityypin ja mutatoidun gal -7. Kontrollit sisälsivät solut transfektoitu tyhjällä SRoc vektoreilla. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) konfokaali kuvantaminen osoittaa solunsisäistä jakelua gal-7 DU-145 transfektantit. (C-D) Western blot-analyysi osoittaa gal-7 ilmentymistä sytosolin, ydin- ja mitokondrion jakeet valmistettu DU-145-soluja. β-tubuliinin, COX IV ja Lamin A /C käytettiin sytosolin, mitokondrioiden ja ydinvoiman markkereita, vastaavasti. (E) Western blot-analyysi osoittaa eritystä gal-7 solunulkoiseen tiedotusvälineet DU-145 soluja, jotka ilmentävät Gal-7

paino- tai gal-7

R74S. p-tubuliinia ilmentymistä seurattiin sulkea pois mahdollisuutta solujen tuhoutumisen. Solunsisäinen proteiini otteita ohjaus DU-145 solu ja HaCaT solusupernatanttien käytettiin positiivisina kontrolleina β-tubuliinin ilmaisun ja gal-7 eritystä, vastaavasti. Kaikki tulokset ovat kolmen erillisen kokeen, mukaan lukien vähintään kaksi itsenäistä DU-145-klooneista.

Gal-7 edistää apoptoosia eturauhassyöpäsoluissa

Useat tutkimukset ovat raportoineet, että ektooppinen ekspressio gal-7 tekee kohdunkaulan, maha- ja paksusuolen syövän soluja herkempiä indusoiman apoptoosin pro-apoptoottinen lääkkeiden [15]. Sen määrittämiseksi, onko tämä toteamus pätee myös eturauhassyövän soluissa, DU-145-transfektantteja käsiteltiin kasvavia annoksia pro-apoptoottisten lääkkeiden ja analysoitiin pilkkomalla PARP-1, joka on yleisesti käytetty merkki apoptoosin [34]. Tuloksemme osoittivat, että ektooppinen ekspressio gal-7 lisäsi pilkkominen PARP-1 indusoi etoposidin kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 4A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun pirstoutuminen tumien apoptoottisten solujen visualisoitiin DAPI-värjäyksellä (kuvio 4B). Kyky gal-7 herkkyyden lisäämiseksi DU-145 solujen apoptoosin havaittiin myös käyttämällä sisplatiinia pro-apoptoottinen lääkkeen (kuvio 4C). Mielenkiintoista, gal-7

R74S oli yhtä tehokas kuin gal-7

paino lisäämään herkkyyttä DU-145 sekä proapoptoottiseen huumeita. Molemmissa tapauksissa, solunsisäinen lokalisaatio gal-7 pysyi muuttumattomana apoptoosin induktion (S2 kuvassa). Käyttäen (

3H] -tymidiinin määritys, myös mitattuna leviämisen transfektanttien puuttuessa tai läsnä sisplatiinin. Huomasimme, että molemmat gal-7

p- ja gal-7

R74S ilmentävien DU-145 solut lisääntyivät samalla hinnat kontrollisoluihin verrattuna normaaleissa olosuhteissa, mutta lisääntynyt hitaammin läsnä sisplatiinin (kuvio 4D), joka on yhdenmukainen sen kanssa, että gal-7 edistää lääkkeen indusoiman apoptoosin. yhdessä nämä tulokset osoittavat, että gal-7 herkistää DU-145-solujen pro-apoptoottisen aineita riippumaton sen CRD toimintaa ja sen solunsisäisen eristämisen.

(A) soluja inkuboitiin 16 h: n osoitetut pitoisuudet etoposidin ja testattiin apoptoosin mittaamalla PARP-1 pilkkominen western blot. (B) apoptoosi vahvistettiin laskemalla solujen hajanainen tuma visualisoitu DAPI-värjäyksellä. (C) analyysi PARP-1 lohkaisu DU-145 soluja käsitellään 16 tuntia jossa ilmoitetun pitoisuuden sisplatiinin. (D) Cell leviämisen DU-145-solut on käsitelty tai ilman 5 uM sisplatiini mitattiin (

3H] -tymidiinin. Kaikki tulokset ovat kolmen erillisen kokeen, mukaan lukien vähintään kaksi itsenäistä DU-145 klooneja. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, ja *** P ≤ 0,001.

Gal-7, mutta ei R74S vähentää invasiivisia käyttäytymistä DU-145-solut

Seuraava olivatko gal-7 voi moduloida invasiivisia käyttäytymistä DU-145-soluissa käyttäen standardia

in vitro

Matrigel invaasiomääritys. Olemme havainneet, että ektooppinen ekspressio gal-7

wt vähensi merkittävästi invasiivisen käyttäytymisen DU-145-soluja verrattuna kontrolliin soluja, joista puuttuu gal-7 (kuvio 5A). Samanlainen ero ei havaittu DU-145 soluja, jotka ilmentävät gal-7

R74S. Koska solu invasiivisen käyttäytymistä saattaa vaikuttaa solun liikkuvuus, käytimme elävien solujen kuvantamiseen mitata solun liikkeitä naarmu haavan paranemista määrityksessä (kuvio 5B). Tuloksemme osoittivat, että DU-145-soluja, jotka ilmentävät gal-7

wt vähentää merkittävästi solun nopeus verrattuna valvoa soluja, joista puuttuu gal-7 tai soluja, jotka ilmentävät gal-7

R74S (kuvio 5C). Nämä gal-7

paino- ilmentäviä soluja oli myös pienempi kertynyt ja euklidinen etäisyydet muuttoliikkeen (kuvio 5D ja 5E). Suuntaavuus DU-145-soluissa ei vaikuttanut ilmaus gal-7

paino- tai gal-7

R74S proteiineja (kuvio 5F). Käyttää standardi tyhjästä haavan paranemista määrityksessä edelleen vahvisti, että gal-7

paino pienentää solun motiliteettia DU-145-soluja. Jälleen Vastaavaa vaikutusta ei havaittu, että gal-7

R74S mutantti (S3 kuvassa).