Krooninen sairaus

tiivistelmä

betuliinihappo on pentasyklisestä triterpenoidi joka osoittaa syövänvastainen toimii ihmisen syöpäsoluja. Tämä tutkimus antaa näyttöä, että betuliinihappo on erittäin tehokas vastaan ​​ihmisen kohdunkaulan syöpäsolu HeLa indusoimalla annos- ja aikariippuvainen apoptoosin. Apoptoottisen prosessin tutkittiin tarkemmin käyttäen proteomiikka lähestymistapa paljastaa proteiinin ilmentymisen muutoksia HeLa soluissa betuliinihappoa hoitoa. Proteomiikka-analyysi osoitti, että oli kuusi ylä- ja kolmekymmentä alassäädetty proteiinien betuliinihapon aiheuttaman HeLa-solut, ja nämä proteiinit alistettiin sitten toimivien reittien analyysi käyttäen useita analyysin ohjelmisto. UDP-glukoosi-6-dehydrogenaasin, 6-fosfoglukonaattidehydrogenaasin dekarboksyloiva, A-ketju Horf6-ihmisen uuden peroksidaasientsyymi, että mukana hapetuspelkistysmenetelmää, havaittiin alassäädetty aikana apoptoosin prosessin oksidatiivisen stressin vasteen kautta. Vastaa meidän tuloksia proteiinin tason lisääntymistä solunsisäisen reaktiivisen hapen havaittiin betuliinihappo käsiteltyjä soluja. Proteiinit glukoosin säätelemä proteiini ja rahdin valinta proteiinia TIP47, jotka ovat mukana Endoplasmakalvosto koulutusjakson, kasvoi-säädellään betuliinihappoa hoitoa. Samaan aikaan, 14-3-3 proteiinit, mukaan lukien 14-3-3β ja 14-3-3ε olivat alassäädetty vastauksena betuliinihappoa hoito, joka on sopusoinnussa väheneminen ilmentymistä kohdegeenien

14 -3-3β

ja

14-3-3ε

. Lisäksi todettiin, että antiapoptoottisten

Bcl-2

geeni alassäädetty kun proapoptoottiset

bax

geeni sääteli jälkeen betuliinihappoa hoidon HeLa-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että betuliinihappo indusoi apoptoosia HeLa-soluissa käynnistää sekä endoplasmakalvostossa reitti ja ROS-välitteisen mitokondrioiden reitin.

Citation: Xu T, Pang Q, Zhou D, Zhang A, Luo S, Wang Y, et ai. (2014) proteomiikan Tutkinta betuliinihapon indusoiman apoptoosin Ihmisen kohdunkaulan syövän HeLa Cells. PLoS ONE 9 (8): e105768. doi: 10,1371 /journal.pone.0105768

Editor: Daniela Flavia Hozbor, Universidad Nacional de La Plata, Argentiina

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 26 heinäkuu 2014; Julkaistu: 22 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee taloudellisesti metsäteollisuuden tutkimus- Special Fund for Public Welfare (201004069) ja perustutkimus rahastojen Central yliopistot ( DL13EA02-03). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

betuliinihappo (3β-hydroksi-lup-20 (29) -en-28-happo) (BA) on luonnossa esiintyvä lupane-tyypin triterpene löytyy kuori valkoinen koivu puita. BA on ratkaisevassa asemassa lähteenä mahdollisten syövän vastaisia ​​yhdisteistä [1]. In vitro tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä aine on voimakkaasti tehoaa erilaisia ​​syöpäsoluja, mukaan lukien melanooma, leukemia, paksusuolen karsinooma, keuhkokarsinooma, eturauhasen syöpä ja multippeli myelooma [2] – [8], samaan aikaan, BA ja sen analogeja voidaan käyttää mahdollisina terapeuttisina HIV-1-infektion hoitoon [9], [10]. On tunnettua, että mitokondriot tärkeä rooli sisäisen reaktiotien nisäkkäiden apoptoosin. Pieneneminen mitokondrion sisemmän kalvon läpäisevä potentiaali liittyy BA hoitoon, mikä viittaa siihen, että sisäinen mitokondrioiden reitti on mukana BA: n indusoiman apoptoosin. Mitokondrioiden reitti edeltää reaktiivisten hapen lajien (ROS) ja säätelee Bcl-2-perheen proteiinien, joka koostuu prosurvival (esim, Bcl-2, Bcl-XL ja Mcl-1) ja proapoptoottiset (Bax , Bad ja BH3-vain proteiinit) jäsenet [10], [11]. BA on osoitettu aiheuttavan apoptoosia CD-95 ja p53-riippumattomalla tavalla suora vaikutus mitokondrioissa [4], [12], [13]. Kokoonpanojen ROS ja proteiinin neosynthesis on raportoitu vaaditaan BA-indusoidun solukuoleman [14], [15], [16]. Aiemmassa tutkimuksessa on apoptoosin BA havaittu, että mitokondrioiden polku inhiboitui Bcl-2 /Bcl-x yli-ilmentyminen ihmisen useiden myeloomasolut [15], BA indusoi apoptoosia pääasiassa mitokondrio polkuun kasvainspesifisyys.

kohdunkaulan syöpä on kolmanneksi yleisin kasvain naisilla [17]. Useita hoitoja käytetään kohdunkaulan syöpä, mutta jokainen niistä on vakavia haittavaikutuksia. Siksi on edelleen välttämätöntä löytää turvallisempaa ja tehokkaampaa hoitoa. BA on kasviperäinen pentasyklisestä triterpenoid, joka on myrkyllistä syöpäsoluja, mutta sillä ei ole vaikutusta transformoimattomien solujen [1], [2], [8]. On raportoitu, että BA indusoi lisääntymistä estävä aktiivisuus kohdunkaulan syöpää [18], mutta molekyylitason mekanismeja tässä prosessissa ei täysin ymmärretä.

päätarkoituksena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää taustalla molekyylitason mekanismit mahdollisia syöpää ehkäisevistä vaikutuksista BA ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja. Global Proteomi profilointi pohjalta yksilöitiin useita väyliä, jotka reagoivat BA hoitoa ja auttanut ymmärtämään paremmin BA: n apoptoosiin liittyviä mekanismeja. Tässä työssä olemme tunnettu apoptoosin liittyvän proteiinin profiilia BA-käsiteltyjen HeLa-soluissa käyttäen vertailevan 2-DE proteomiikka lähestymistapa. Molekyyli- toiminnot ja biologisten prosessien mekanismi BA: n indusoiman apoptoosin käsitellään. Muutokset ilmentymistä neljästä geenistä, jotka koodaavat apoptoosia liittyvät proteiinit analysoitiin suorittamalla reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) analyysi.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja proliferaatiomääritystä

BA hankittiin Boyle Chemical CO., LTD (Shanghai, Kiina). Ihmisen syöpäsolu HeLa ostettiin Kasvaimen Center (Beijing, Kiina). Soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Hyclone, Logan, UT, USA), jossa oli 10% FBS: ää (PAA, Itävalta), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Hyclone, Logan, UT, USA). Solut ympättiin 96-kuoppaisille mikrolevyille ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 5% CO

2. 24 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi eri pitoisuuksia BA. Seuraavaksi 30 ui 3 mg /ml MTT: tä (Amresco, USA) PBS: ssä lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja sitten levyä inkuboitiin vielä 4 h. Jäljellä oleva supernatantti poistettiin, ja 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sekoitettiin perusteellisesti liuottamiseksi formatsaanikitei- kiteitä, jotka on muodostettu. 10 minuutin kuluttua inkuboinnin Kunkin kuopan absorbanssi luettiin aallonpituudella 490 nm käyttäen BioTek-ELISA-levyn lukijaa (BioTek Instruments, Winooski, USA). BA: n konsentraatio inhiboimaan solun kasvua 50% (IC50-arvo), laskettiin annos-vaste-käyrät. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Morfologiset muutokset

havaita morfologisia muutoksia, jotka tapahtuivat apoptoosin aikana, tumavärjäystä suoritettiin käyttäen 5 ug /ml Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO , USA) tahra, ja näytteet visualisoitiin käyttämällä Nikon fluoresenssimikroskooppia (ECLIPSE Ti-S, Nikon, Tokio, Japani). [19]

virtaussytometrinen analyysi apoptoosin

BA indusoiman apoptoosin havaittiin anneksiiniV-FITC /PI-värjäys (Beyotime Biotech, Peking, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Virtaussytometria (Partec Virtaussytometriaa, Saksa) käytettiin erojen analysoimiseksi apoptoosin välillä ohjaus ja BA-käsiteltyjen (15 umol /l, 30 mikromol /l ja 50 umol /l) soluilla 48 tuntia hoidon jälkeen. Solut kerättiin ja analysoitiin laskemalla normaalit solut, alkuvaiheen apoptoottisia soluja, ja myöhäisvaiheen apoptoottiset /nekroottisten solujen kolmella näkökenttien mikroskoopin. Tietojen ja analyysiä suoritettiin käyttäen Flomax ohjelmistoa. Soluja käsiteltiin kuten on kuvattu valmistajan protokollan ja analysoitiin kolmena kappaleena.

Protein valmistelu 2-DE

Hela-soluja käsiteltiin 30 umol /L BA kerättiin sen jälkeen, kun 48 tunnin inkuboinnin. Solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, sitten se uutettiin lyysipuskurilla, joka sisälsi 7 mol /l ureaa, 2 mol /l tioureaa, 4% CHAPS, 2% pH 3-10 /4-7 lineaarinen IPG-puskuria (GE Healthcare, USA ), 20 mmol /L dithiothreilol (DTT, Sigma, USA), 40 mmol /l Tris (Sigma, USA) ja täydellinen mini EDTA-vapaa proteaasi-inhibiittori cocktail (Roche, USA). Sen jälkeen, kun sonicating10 kertaa 30 s 30 s taukojen jää-vesihauteessa ja sitten inkuboimalla 4 ° C: ssa 1 h, solulysaateista sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinit saatu supernatantti oli määrällisesti käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä mukainen reagenssi Bradford-menetelmällä (Bio-Rad, Hercules, USA) [19].

Kaksiulotteinen geelielektroforeesilla

Cell proteiini lysaatit (130 ug) sekoitettiin nesteytys, joka sisälsi 7 mol /l ureaa, 2 mol /l tioureaa, 2% CHAPS, 0,5% IPG-puskuria ja 0,002% bromifenolisinistä, ja DTT: tä lopulliseen tilavuuteen 450 ui. Betonielementit 24 cm immobilisoitu pH-gradientti nauhat (IPG, pH 3-10, pH 4-7, GE Healthcare) rehydratoitiin 12 tunnin ajan 30 V erotus koskevasta Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare, Saksa) suoritettiin seuraavat parametrit: 100 V 2 tuntia, 200 V: ssa 1 h, 500 V: ssa 1 tunnin ajan 1000 V: ssa 1 tunnin ajan ja 8000 V: ssa 3 h, jonka jälkeen vaihe-ja-pidä kuvio 8000 V 8 tuntia. Isoelektrisen fokusoinnin jälkeen, liuskoja inkuboitiin 15 min tasapainotusliuoksella I (6 mol /l ureaa, 2% SDS, 30% glyseroli, 1% DTT: tä, 0,002% bromifenolisinistä, 50 mmol /L Tris-HCI, pH 8,8) ja vielä 15 min tasapainotusliuoksella II (1% DTT korvattiin 2,5% jodiasetamidilla). Sen jälkeen IPG nauhat siirrettiin alkuun-polyakryyliamidigeeleillä ja upotettu käyttäen 0,5% (w /v) agaroosigeelissä, joka sisälsi bromifenolisineä. Kaksiulotteinen SDS-PAGE suoritettiin 25 ° C: ssa ja 3,5 w /geeli 30 minuutin ajan ja sitten 17,5 w /geeli 4 h 30 min, kunnes bromifenolisinistä väriainetta edessä saapui alaosassa geelien avulla Ettan DALT kuuden järjestelmä (GE Healthcare). Geelit kiinnitettiin seoksessa, jossa oli 40% etanolia ja 10% jääetikkaa yön yli. Proteiinit saatiin näkyviin hopeavärjäyksellä, ja geeli kuvat hankittiin käyttäen ImageScanner (GE Healthcare) Image Master 2D Platinum Software Version 7.0 (GE Healthcare). Saadakseen luotettavia tuloksia 2-DE kuvaa, täplät hyvin ratkaistu kolmen biologisen toistojen. Mittaus suoritettiin kunkin biologisen kaksoiskappaleanalyysiä, ja normalisoitu tilavuudet laskettiin käyttäen koko paikka äänenvoimakkuuden normalisointi menettely ohjelmiston. Normalisoitu tilavuus kunkin täplän oletettiin edustaa sen ilme runsaus. Vain ne kohteet, jotka muuttivat johdonmukaisesti ja merkittävästi (yli 1,5-kertainen ja

p

0,05) valittiin massaspektrometriaa analyysi.

Massaspektrometria ja proteiini luokittelu

peptidi MS ja MS /MS suoritettiin ABI 5800 MALDI-TOF /TOF Plus massaspektrometriin (Applied Biosystems, USA). Tiedot hankittiin positiivisella MS heijastin käyttäen CalMix5 standardin kalibroida (ABI5800 kalibrointi Seos). Sekä MS ja MS /MS-tiedot yhdistettiin ja käsitellään käyttämällä GPS Explorer v3.6 ohjelmisto (Applied Biosystems, USA) oletusparametrit. Perustuen yhdistetty MS ja MS /MS-spektrit, proteiinit onnistuneesti tunnistettujen Yhteensä 95% tai suurempi luottamusväli niiden tulokset on MASCOT V2.3search moottori (Matrix Science Ltd., UK), käyttäen seuraavia hakuparametrit: NCBInr-humandatabase ; trypsiinillä kuten pilkkovan entsyymin; osunut katkaisukohdan; kiinteät muutoksia karbamidometyyli (C); osittaisia ​​muutoksia Asetyyli (Protein N-termi), deamidoidun (NQ), Dioxidation (W), hapettuminen (M); 100 ppm lähtöaineiden ioni suvaitsevaisuuden ja 0,5 Da ioniosan toleranssi.

Perustuu PANTHER luokitusta (versio 7.2, https://www.pantherdb.org/), molekyyli- funktio ja biologisen prosessin vastaavan tunnistettu proteiinit luokiteltiin [20]. Proteiini vuorovaikutusverkosto generoidaan STRING (versio 9,05, https://string-db.org) paljasti välineiden yhteyksiä eri proteiinien [21], [22].

Measurement oksidatiivisen stressin

solunsisäiset ROS määritettiin käyttäen ROS määrityskittiä (Beyotime Biotech, Kiina) seuraten valmistajan protokollaa. Solut kerättiin 48 tunnin jälkeen ja 30 umol /l BA hoitoon ja pestiin sitten kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin DCFH-DA (10 umol /l) 37 ° C: ssa 40 minuutin ajan pimiössä kädessä virtaussytometrialla. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

RNA: n eristys ja qRT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, USA). Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen PrimeScriptTM käänteistranskriptaasia (Takara, Tokio, Japani), ja transkriptit alistettiin sitten qRT-PCR: llä käyttämällä SYBR Green PCR Reagenssit Kit (Takara, Tokio, Japani). Määrälliset määritykset suoritettiin kolmena kappaleena käyttämällä 1 ui cDNA: ta (1:10 laimennos) ja SYBR Green Master Mix (Takara, Tokio, Japani) ja analysoitiin käyttäen ABI 7500 Sequence Detection järjestelmän (Applied Biosystems, USA). Monistamisen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina, ja normalisoida datan. Yksityiskohtia käytetyt alukkeet on esitetty taulukossa 1 [23].

Tilastollinen analyysi

Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD) kolmesta näytteestä. Tilastollinen analyysi suoritettiin tilasto-ohjelma (SPSS versio 17.0). Data analysoitiin käyttäen yksisuuntaista va- rianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi Bonferronin monivertailuja. Arvo

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

vaikutus BA leviämisen ja apoptoosin HeLa-solujen

HeLa-solut käsiteltiin eri pitoisuus (15 umol /l, 30 umol /l, 50 umol /l), BA 24 h, 48 h ja 72 h. Solun elinkelpoisuus näytetään yleisesti vähentynyt kasvavilla pitoisuuksilla BA keskipitkällä ja hoidon keston analysoitiin MTT-määritys (Fig. 1A). Tämä tulos viittaa siihen, että BA estää proliferaatiota HeLa-solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. IC

50 oli 30,42 ± 2,39 uM, kun HeLa solut käsiteltiin BA 48 tuntia.

(A) vaikutus BA kohti Hela-soluissa määritettynä MTT-määritystä. Soluja käsiteltiin pitoisuuksilla BA (0 umol /l, 15 umol /l, 30 umol /l, 50 umol /l) ja ilmoitettuina ajankohtina (24 h, 48 h, 72 h). Arvot kullekin BA testattu pitoisuus edustavat keskiarvoa kolmesta kokeesta, Datas esitetään keskimääräisiä ± SD; **

p

0,01 verrattuna kontrolliryhmään (0 mikromol /l BA). (B) Hoechst 33258-värjäyksen HeLa-solujen käsiteltiin 15 mikromol /l, 30 mikromol /l BA. Punaiset nuolet osoittavat useita apoptoottisia soluja, joilla on tyypillinen kondensaatiolla kromatiinin.

Sen määrittämiseksi, onko antiproliferatiivinen vaikutus aiheuttama BA HeLa-solujen välittämän apoptoosin induktion, arvioimme apoptoosin morfologiset tutkimus käyttäen fluoresenssimikroskopiaa ja virtaussytometria. Hoidon jälkeen 15 umol /l ja 30 umol /l BA 48 tuntia, HeLa-solut värjättiin 5 ug /ml Hoechst 33258 ja visualisoitiin käyttäen fluoresenssimikroskopialla. Tyypillinen morfologia apoptoosin havaittiin BA-käsiteltyjen HeLa-soluissa (kuvio. 1 B). Tämä osoitti, että oli merkittävä kasvu prosentteina apoptoottisten solujen jälkeen BA hoidon kontrolliin verrattuna soluihin. Lisäksi BA aiheutti annoksesta riippuvaa apoptoosin kuten osoitetaan anneksiiniV-FITC /PI virtaussytometriaa käyttämällä. Kokonaisprosenttiosuus apoptoottisten solujen oli 20,53 ± 0,81% (13,45 ± 0,80% soluista varhaisen apoptoottisten ja 7,07 ± 0,51% soluista myöhään apoptoottisten) ja 38.56 ± 1,79% (30,92 ± 1,22% soluista varhaisen apoptoottisten ja 7,64 ± 0,53% of solut myöhään apoptoottisten) solujen käsiteltiin 30 umol /l ja 50 umol /l BA 48 h, vastaavasti (kuten on esitetty kuviossa. S1).

2-DE-analyysi eroista proteiinin ilmentyminen indusoitiin BA

Proteomiikka on tehokkaan alustan tutkimalla proteiinin ilmentymisen ja muutos vastauksena erityisiin elintoimintojen biologisissa järjestelmissä. Proteomeja ohjaus- ja 30 umol /L BA-käsiteltyjen HeLa-solut analysoitiin 2-DE. Kaksi kaltevuus kantaman IPG nauhat (pH 3-10 ja 4-7) käytettiin ensimmäisenä ulottuvuus. Edustavia 2-DE-proteiinin kuvioita pl alueella 3-10 osoittivat, että proteiinit lähinnä pH-alueella 4,2-7,0 (Fig. 2A). Edelleen erottaa tämän näytteen, kapea-alue pH gradientit (4-7) käytettiin (Fig. 2B), jonka avulla voimme lisätä sekä proteiinin kuormitusta geelit ja resoluutiota proteiinien tällä alueella. Proteiini täplien muutokset yli 1,5-kertainen (

p

0,05) alistettiin sitten proteiinin tunnistamiseen MALDI TOF /TOF-MS-analyysi (taulukko S1). Yhteensä 18 proteiinin spotit monenlaisia ​​IPG-pohjainen 2D geelit (pH 3-10) ja 19 proteiini täplät kapeammalle IPG-pohjainen 2D geelit (pH 4-7) osoitti toistettavissa ja tilastollisesti merkittäviä muutoksia BA-käsiteltyjen näytteiden verrattuna kontrollinäytteisiin (Fig. 2). Proteiinit kaikista proteiinitäplien onnistuneesti tunnistettiin MS ja MASCOT tietokantahakuihin korkea luottamus (taulukko 2). Proteiini profilointi (pH 3-10) paljasti 5 sääteli proteiineja ja 13 alassäädetty proteiinien BA-käsitellyissä soluissa. Lisäksi proteiini profilointi (pH 4-7) paljasti 1 up säätelemä proteiini ja 18 alassäädetty proteiinien BA-käsitellyissä soluissa. Yllättäen oli vain 1 proteiinia (gi4826760) kun päällekkäisyys pH 3-10 (Spot NO. 868) ja pH 4-7 (Spot NO. 626) geelejä.

(A) 2-DE suoritettiin 130 ug proteiinia käyttämällä 24 cm: n pH 3-10 NL IPG nauhat ja 12,5% SDS-PAGE. (B) 2-DE suoritettiin 130 ug proteiinia käyttämällä 24 cm: n pH 4-7 NL IPG nauhat ja 15% SDS-PAGE. Geelit visualisoitiin hopeavärjäyksellä ja analysoitiin Image Master ohjelmisto.

toiminnallinen luokat ilmentyvät eri proteiinien

Paremmin luokitella tunnistettu proteiineja, kaksi riippumatonta luokkaa geenin ontologies käytettiin kuvaamaan toimintaa geenituotteiden: molekyyli-toiminto ja biologisten prosessien, kuten tunnistetaan PANTHER luokittelujärjestelmän. Koska EEF (gi530425157, spot 932) oli päättänyt olla sama kuin EEF2 (gi4503483, spot 673) ja GLOD4 (gi4929769, spot 146) ei tunnistetaan PANTHER luokittelujärjestelmän, 34 muuttunut proteiinit analysoitiin ohjelmiston. Tunnistetut Proteiinit luokiteltu 9 ryhmässä perustuu biologisiin prosesseihin: aineenvaihduntaan (31.90%), solu prosesseja (19.10%), solukomponentti organisaatio tai biogeneesin (14.90%), kehitysprosesseja (10,60%), lokalisointi (10,60%), biologinen asetuksen (4,30%), vaste ärsyke (4,30%), monisoluisista organismin prosessit (2,10%) ja immuunijärjestelmän prosesseja (2,10%) (Fig. 3A). BA hoito esti proteiini kokoontaitettava (spot 81, 655, 1109, 613, 981), joka on tärkeä proteiinin biosynteesiä. Lisäksi Glykolyysivaiheen (spot 372), käännös (spot 673, 885) ja mRNA (spot 868) osallistuvat aineenvaihduntaan ja olivat alassäädetty BA-hoitoa. BA tukahduttaa useimmat biologiset prosessit estää normaalin metabolisia prosesseja, kuten solun prosesseja (spot 361, 128, 1087, 970, 823, 991, 842), kehitysprosesseja (spot 361, 128, 1087, 970), lokalisointi (spot 120, 970, 991), vasteet ärsykkeet (spot 81), monisoluisista organismin prosessit (spot 81), ja immuunijärjestelmän prosesseja (spot 81). Itse asiassa, jotkut proteiinit ovat osallisena useita biologisia prosesseja, ja proteiineja, jotka olivat mukana soluprosesseissa vaikutti myös solukomponenttiin järjestö (spot 361, 128, 1087, 970). Niiden molekyylipainon funktiona, moduloitu proteiinit luokiteltiin 5 ryhmään: katalyyttinen aktiivisuus (36,00%), rakenteelliset molekyylin aktiivisuus (32,00%), joka sitoo (20,00%), käännös säädin aktiivisuus (8,00%), ja antioksidantti (4,00% ) (Fig. 3B). Vuonna katalyyttinen aktiivisuus luokka, proteiini-isomeraasin aktiivisuus (spot 655, 1109) ja oksidoreduktaasi aktiivisuus (spot 542, 526, 1120, jotka ovat mitokondrioiden elektroninsiirtoketju) estyivät BA hoitoa. Samanaikaisesti antioksidantti (spot 542) väheni myös BA hoitoa. Lisäksi useimmat proteiinit, jotka osallistuvat rakenteellinen molekyylin aktiivisuuden (spot 81, 361, 1085, 1087, 970), sitova (spot 128, 573, 868) ja kääntämisen säätimen toimintaa (spot 673, 885) vähenivät merkittävästi BA käsiteltyjen HeLa-soluissa .

Perustuu PANTHER luokittelusta ja geenien luokka, biologisen prosessin (A) ja molekyylien toiminto (B) vastaavaa tunnistettu proteiineja luokiteltiin.

proteiini vuorovaikutusverkosto syntyi MERKKIJONOn joka tarjoaa parannuksen toiminta-analyysi (Fig. 4). Proteiini vuorovaikutusverkosto tarjoaa alustan analysoida tunnistettujen proteiinien toimintoja, proteiini-proteiini vuorovaikutusten, biologisia polkuja ja molekyylien toimintoja. Näin ollen neljä suuret verkot kertyi: (1) neurotrofiinireseptoreiden signalointireitistä, (2) pitkäaikainen masennus, (3) rytmihäiriöitä oikean kammion kardiomyopatia, ja (4) VEGF signalointireitin. MAP2K2 (spot 942), YWHAB (spot 823) ja YWHAE (spot 842) olivat keskeinen proteiineja vuorovaikutuksessa verkkojen ja niiden tasot laskivat BA hoitoa, joka voi olla tärkeä rooli neurotrofiiniryhmän signalointireitin. Tunnistetuista proteiineista, 14-3-3-proteiinit ovat osallisena monissa fysiologisissa polkuja, ja näiden proteiinien on osoitettu olevan vastuussa kasvun ja apoptoottisten kapasiteetti monien pahanlaatuisten kasvainten.

muuttaa proteiinien proteomic analyysi oli ladattu STRING työkalun tunnistamaan toiminnallisia signalointi verkot. Ennustettu toimintayhteydet koostuvat jopa kahdeksan riviä: yksi väri kutakin näyttöä.

ROS sukupolven BA-käsiteltyjen HeLa-soluissa

ROS tärkeä rooli apoptoosin koska se on mukana mitokondrion kalvon läpäiseväksi ja solukuoleman induktio. Mukaan proteiinin profilointi BA-käsiteltyjä soluja, UDP-glukoosi 6-dehydrogenaasin (spot 526), ​​6-fosfoglukonaattidehydrogenaasin (spot 1120) ja peroksidaasientsyymiä (spot 542) olivat mukana biologisen prosessin Oksidaasin stressin vastaus, joka korreloi BA-indusoidun apoptoosin HeLa-soluissa. Taso ROS havaittiin käsittelyn jälkeen HeLa-solujen kanssa BA (15 umol /l, 30 umol /l) 48 tuntia. Taso ROS BA käsiteltyjä soluja kasvoi merkittävästi. Taso ROS BA-käsitellyistä soluista oli 9,28-kertainen ja 12,77 kertaa suurempi kuin taso ROS kontrollisoluissa hoitoihin 15 mikromol /l ja 30 umol /l, tässä järjestyksessä, ja säädelty suuntaus havaittiin kaikkialla kokeen (Fig. 5). Nämä tulokset viittaavat siihen, että BA indusoi apoptoosia aktivoitumisen kautta ROS-välitteisen solukuoleman mekanismeja HeLa-soluissa.

HeLa-soluja käsiteltiin 15 umol /l, 30 umol /l BA 48 tuntia ja sitten inkuboitiin 10 mmol /l DCFH-DA 40 min. Fluoresoiva intensiteetti DCFH mitattiin virtaussytometrialla. (A) Todellinen spektriä edustavasta ainoassa kokeessa. (B) fluoresenssin intensiteetti värjäytyneiden solujen määritettiin virtaussytometrialla. Pylväät osoittavat keskiarvot kolmesta kokeesta (± SD). **

p

0,01 verrattuna kontrolliryhmään (0 mikromol /l BA).

qRT-PCR-analyysi geenien BA aiheuttaman apoptoosin

Koska 14-3-3-proteiinit ovat osallisena monissa fysiologisissa polkuja, mukaan lukien kasvun ja apoptoosin, ilmentyminen muutokset kaksi geeniä, jotka koodaavat tunnistettu 14-3-3 proteiinien perhe valittiin edelleen analyysiä qRT-PCR: llä. Alas-säätely kahden valitun geenit (

14-3-3β

ja

14-3-3ε

) transkriptio- tasolla oli yhdenmukainen 2-DE data. Ilmaisu tasot

14-3-3β

ja

14-3-3ε

merkittävästi alassäädetty BA hoitoa. Geenit

Bcl-2

ja

Bax

tutkittiin edelleen tutkimaan roolit ROS kertymistä BA: n indusoiman apoptoosin, koska mitokondrion reitin säätelee prosurvival Bcl-2 ja proapoptoottiset Bax. Ilmaisu taso

Bcl-2

havaittiin olevan merkittävästi pienempi kuin ohjaus taso. Sitä vastoin ilmaus proapoptoottiset

Bax

lisääntyi merkitsevästi verrattuna valvonnan qRT-PCR (Kuva. 6).

HeLa soluja käsiteltiin 30 mikromol /l BA 24 tuntia ja sitten kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia. Pylväät osoittavat keskiarvot kolmesta kokeesta (± SD). *

p

0,05, **

p

0,01 verrattuna kontrolliryhmään (0 mikromol /l).

Keskustelu

BA, luonnossa esiintyvä pentasyklinen triterpenoid kanssa mahdollisesti tappaa melanoomasolujen [1], on osoitettu aiheuttavan apoptoosia useissa syöpäsolulinjoissa [2] – [8]. BA on raportoitu olevan vailla sytotoksinen vaikutus terveitä soluja. Normaalit solut, kuten ihon fibroblastit, perifeerisen veren lymfoblastit [2], melanosyyttien [14] ja ihmisen astrosyytit [15], on osoitettu olevan vastustuskykyisiä BA hoidon in vitro. Useat tutkimukset ovat tuottaneet merkittäviä käsityksen BA aiheuttamaa sytotoksisuutta. BA myös tukahdutti kasvaimen kasvua in vivo useissa eläinkokeissa. Vuonna ksenografti hiirimallissa munasarjasyövän annon BA huomattavasti elinaikaa [25]. Schettino, M T käytti Ba hoidossa ihmisen papilloomavirus jota pidetään kehittämiseen tarvittavia kohdunkaulan syövän, tulokset viittaavat BA voi olla yksi lupaava huumeiden hoitoon kohdunkaulan syövän [26]. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli valottaa molekyylimekanismin (t) apoptoottisen vaikutusten Ba kohdunkaulan syövän solulinja (HeLa) ja tutkia vaikutuksia BA kasvuun HeLa-soluissa.

määrittää sopivan pitoisuuden BA Proteomiikan kokeissa HeLa-soluja käsiteltiin sarjan BA pitoisuuksien 24 h, 48 h ja 72 h, ja sitten solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä, ja apoptoosin määrä analysoitiin virtaussytometrialla cytometry. Tulos paljasti BA estää proliferaatiota HeLa-solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, ja IC

50 oli 25,93 ± 1,87 uM 72 tuntia, mikä oli yhdenmukainen IC

50 (26,0 ± 2,1 uM) Rita C testattiin HeLa-solut altistettiin BA hoitoon 72 tunnin [24]. Merkittävää kasvun esto ja apoptoosin havaittiin, kun solut altistettiin 30 umol /L BA 48 tuntia. Noudattaa standardin että apoptoosin pitäisi indusoida mutta tarpeeksi elävien solujen tulisi säilyttää myös proteiinien louhinta ja proteomic tutkimus, 30 mikromol /l BA valittiin hoitoon HeLa-soluissa.

Proteomiikka tarjoaa menetelmän tunnistamiseksi joka proteiinit välittävät apoptoottisia reittejä soluissa käsitelty kemoterapia-aineiden [27] – [29]. Koska molekyylitason mekanismi mukana induktio leviämisen estäminen ja apoptoosin BA ei ole vieläkään selvää, toteutimme proteomiikka järjestelmää globaalisti etsiä ilmennetty eri proteiinien HeLa-soluissa vaikutti BA. Useimmat proteiinit (30 täplät) pieneni ja muutaman proteiinin (6 täplät) parannettiin BA hoitoa. Toiminnallinen luokka analyysi viittaa siihen, että muutokset proteiiniekspressiossa jälkeen BA hoidon liittyy erilaisia ​​biologisia prosesseja ja molekyylien toimintoja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että BA-indusoidun apoptoosin HeLa-solujen perustuu pääasiassa inhibitioon liittyvien proteiinien synteesiin ja aineenvaihduntaan.

joukossa viidentoista aineenvaihduntaa liittyvät proteiinit, kaksi säädelty proteiineja (HSPA5, paikalla 613 ja PLIN3, paikalla 248) osallistuvat endoplasmakalvostossa (ER) reitti, joka on mukana monimutkainen apoptoottisen vastauksia. ER stressivaste voi edistää solujen korjaus ja jatkuva selviytyminen vähentämällä kuormitusta kehitettyjen proteiinien globaalien vaimennus proteiinisynteesiä tai ylös-säätely saattajia, entsyymejä, ja rakenneosat ER [30]. Vaikka mekanismi on vielä epäselvä, kun ER stressi on ylivoimainen, solut läpikäyvät apoptoosin [31]. Glukoosi säätelemä proteiini HSPA5 (spot 613), joka on ER-asuva chaperon, vastaa ER koulutusjakson verkoston kautta sääntelyviranomaisten ja uusia mekanismeja, jotka johtavat kasvuun pidätys [32]. Rahdin, mukaan lukien PLIN3 (spot 248), kulkeutua ER ja sitten pieniksi vesicular kantajia, jotka välittävät kuljetus Golgin osastoihin [33]. Toinen up säätelemä proteiini on IL18 (spot 27), uusi proinflammatoristen sytokiinien, joka indusoi ilmentymistä tuumorinekroositekijän a kappale (TNF-a) ja Fas-ligandin sekä tumaansiirtymiseen ydinvoiman tekijä kB (NF-KB) [ ,,,0],34], [35]. NF-KB on keskeinen säätelijä stressin aiheuttama transkriptionaalista aktivaatiota, ja BA on myös raportoitu estävän inflammatoristen NF-KB: n [36]. Tässä työssä, jopa säätelemä proteiini ilmentymistä havaittiin, joka voi välittää ER prosessi BA HeLa-soluissa.

Kaksi alassäädetty antioksidantti proteiineja, UGDH (spot 526) ja PGD (spot 1120) , katalysoivat C6 alkoholien karboksyyli- happoja kahdessa peräkkäisessä NAD

+ – riippuvainen vaiheet ilman vapautumista aldehydivälituotetta, ja nämä proteiinit ovat erittäin tärkeitä elektronin siirto ketju mitokondrioita [37], [38]. Lisäksi antioksidantti proteiinin PRDX6 (spot 542) voi tarjota suojaa nitroxidative stressistä ja korjata oksidatiivisesti vahingoittuneet molekyylejä, ja tämä proteiini on tärkeä rooli huuhteluilmaputkissa ROS fysiologisissa olosuhteissa [39]. Samaan aikaan, taso ROS tuotannon havaittiin virtaussytometrillä lisättiin käsittelyn jälkeen HeLa-solujen kanssa BA, ja tämä tulos on tulosten mukaisesti edellisen oksidoreduktaasin vaikutuksen määritykset ja voi auttaa selittämään apoptoottisen vaikutusten BA. Nämä tulokset osoittavat, että mitokondriot reitti aktivoitiin BA, joka indusoitiin sitten apoptoosin HeLa-soluissa. Oksidatiivisen stressin tiedetään olevan välittäjänä indusoiman apoptoosin erilaisia ​​laukaisee, ja mitokondriot pidetään anturit hapettumista, ja se voi olla tärkeä rooli apoptoosin [40], [41]. Bcl-2-perheen proteiinit voivat säädellä mitokondrioita reitin kautta muuttamalla mitokondrion kalvon läpäiseväksi [42]. Antiapoptoottisten Bcl-2 ja proapoptoottiset Bax ovat erittäin tärkeitä välittäjänä ulomman mitokondrion kalvon läpäiseväksi ja mitokondrioiden reitti apoptoosin [43]. Olemme havainneet, että BA hoito tukahdutti ilmaus

Bcl-2

tekstitystiedostojen helpotti ilmaus

Bax

by qRT-PCR.