Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Laaja prostataspesifisen antigeenin seulontaa eturauhassyövän tuottaa suuri määrä tarpeettomien koepaloja ja yli-hoidon riittämättömän eriyttämisen veltto ja aggressiivisia kasvaimia. Oletimme, että siemennesteestä plasmassa on vankka lähde uusien eturauhassyövän (PCA) biomarkkereita, joilla on potentiaalia parantaa päädiagnoosina ja erottaa kehittynyt alkaen indolent sairaus.

Menetelmät /Principal Havainnot

avoimessa tapaus /kontrolli tutkimuksessa 125 potilasta (70 PCA 21 hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu, 25 krooninen eturauhastulehdus, 9 tervettä verrokkia) otettiin 3 keskuksissa. Biomarkkeri paneelit a) PCA diagnoosi (vertailu Eturauhassyövän potilaista ja hyvänlaatuinen tarkastukset) ja b) pitkälle sairaus (vertailu sairastavien potilaiden leikkauksen jälkeen Gleason pisteet 7 vs. Gleason pisteet 7) etsittiin. Itsenäinen kohortteja käytettiin proteomic biomarkkereiden löytö ja testaus suorituskykyä tunnistettu biomarkkereiden profiileja. Uraauurtava plasma profiloitiin käyttäen kapillaarielektroforeesi massaspektrometriaa. Preanalyyttiset vakautta ja analyyttinen tarkkuus proteomianalyysi määritettiin. Tukivektorikone oppimista käytettiin luokitteluun. Vaiheittainen soveltaa kahta biomarkkereiden allekirjoituksia 21 ja 5 biomarkkerit säädetty 83% herkkyys ja 67% tarkkuus PCA havaitsemiseen testissä joukko näytteitä. Paneeli 11 biomarkkereita edenneen taudin syrji potilaalla on Gleason pisteet 7 ja elimeen rajoittunut ( PT3A) tai edistyneen (≥pT3a) sairaus ja 80% herkkyys ja 82% tarkkuus alustavassa validointi ympäristössä. Uraauurtava profiilit osoittivat erinomaista preanalyyttiset vakautta. Kahdeksan biomarkkerit havaittiin fragmentteja N-acetyllactosaminide beeta-1,3-N-asetyyliglukosaminyylitransferaasi, eturauhasen hapan fosfataasi, Stabilin-2, GTPaasi IMAP perheenjäsen 6, semenogelin-1 ja -2. Rajoitettu otoskoko oli merkittävä rajoitus tutkimuksen.

Johtopäätökset /merkitys

Seminal plasma edustaa vankka lähde potentiaalisten peptidi päättäjien ensisijainen PCa diagnoosia. Meidän havainnot takaa edelleen mahdollisille validointi vahvistaa diagnostisten mahdollisuuksia tunnistaa siemen biomarkkereiden ehdokkaita.

Citation: Neuhaus J, Schiffer E, von Wilcke P, Bauer HW, Leung H, Siwy J, et al. (2013) Seminal Plasma lähteenä Eturauhassyöpä Peptide biomarkkereiden Ehdokkaita havaitseminen Laiska ja Advanced tauti. PLoS ONE 8 (6): e67514. doi: 10,1371 /journal.pone.0067514

Editor: Antonia Vlahou, Biomedical Research Foundation, Academy of Athens, Kreikka

vastaanotettu: 24 syyskuu 2012; Hyväksytty: 23 toukokuu 2013; Julkaistu: 24 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Neuhaus et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoitettiin osittain Saksan talousministeriö ja teknologialla BMWi avustuksiin nro KF0362802MD8 jus, JN, PW, ES, JS ja myöntää nro EP110141 ES ja JS. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: ES ja JS ovat työntekijöitä Mosaiques Diagnostics GmbH. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toinen useimmin diagnosoitu syöpä ja kuudenneksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä maailmanlaajuisesti [1]. Käyttöönotto seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) seulonta johti merkittävään lisääntymiseen diagnosoitujen tapausten [2], mutta ei kyennyt osoittamaan tilastollisesti merkitsevä eturauhassyövän kuolleisuus hyötyä [3]. Yhdeksänkymmentä viisi prosenttia miesten PSA-havaittu syövän jotka seurattiin 12-vuotiaat eivät kuole PCA, vaikkei tarkkojen hoito, kuten eturauhasen, sädehoito tai hormonihoito [3].

Tämä on merkittävästi liioiteltu nykyinen kyvyttömyys tehdä näyttöön perustuvia suosituksia hoitovaihtoehdoista mukaan kasvaimen käyttäytymisen, eli kliinisesti merkityksetön, tai veltto tauti ja kliinisesti merkittäviä tai edenneen taudin [4]. Siksi uudet seulonta yksityiskohtaiset tarvitaan kiireesti vähentää miehiä, jotka vaativat koepala ja parantaa syrjiviä tarkkuutta välillä veltto kasvain, joka on suotuisa kliininen ennuste ilman väliintuloa, ja sairaus, joka on todennäköisesti jo kliinisesti kehittyneet, jotta vähentää yli-diagnoosin ja yli-hoitoa.

proteomiikan biomarkkereiden seulonta on tullut suosittu viime vuosikymmenen aikana. Veri, virtsa, eturauhasen nesteitä, ja eturauhaskudoksessa on arvioitu biomarkkerit lähteenä. Useat ehdokas biomarkkereita löydetty näissä tutkimuksissa otettiin käyttöön biomarkkereina yritetään käsitellä kliinisiä tarpeita syrjinnän laiska ja edenneen taudin [5] – [7]. Kuitenkin kaikki yhden biomarkkerit tällä hetkellä käytettävissä, puuttuu diagnostinen tarkkuus rutiini kliinisissä sovelluksissa. Korkea biologinen vaihtelevuus eturauhassyövän viittaa siihen, että erilliset selkeästi määritelty biomarkkereiden, eikä samalla biomarkkereiden, voi olla tehokkaampaa tarkasti arvioida taudin. Viimeaikaiset tekniset edistysaskeleet, erityisesti massaspektrometria ja laskenta, mahdollistaa soveltaa proteomic profilointi löytö useiden proteiinin biomarkkereiden.

Viime aikoina olemme tunnistettu ja validoitu Proteomisten kuvio 12 luonnossa esiintyviä, virtsan peptidi biomarkkerit kapillaarielektroforeettisesti massa spektrometria (CE-MS), joka pystyy havaitsemaan PCa käyttäen ensin virta virtsaan, 90% herkkyys ja 61% tarkkuus [8], [9]. Nämä kokeet ehdotti, että eturauhasen nesteet voivat toimia lähteenä biomarkkereita [10]. Sen Näiden havaintojen perusteella, me arveltu, että siemennesteestä plasmassa saattaa tarjota vankka lähde tunnistaa uusia PCa proteiinia maker profiileja. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida järjestelmällisesti preanalyyttiset siemennestettä plasma vakaus ja sen soveltuvuus kehittämiseen PCa biomarkkereiden paneelien.

Tulokset

Potilaiden kliininen tulos

yhteensä 70 potilasta PCA, 21, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH), 25 potilasta, joilla on krooninen eturauhastulehdus (CP) ja 9 tervettä ohjaus (HC) otettiin mukaan tutkimukseen (taulukko 1 ja kuvio 1). CP ja HC ryhmät olivat huomattavasti nuorempia kuin potilaista PCA ja eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) ryhmät (taulukko 1). Kuten odotettua PSA-tasot olivat huomattavasti matalammat CP ja HC verrattuna BPH (0,98-6,70 ng /ml) tai (PCA 2,0-20 ng /ml) sekä, koulutus- ja Koepakettia (p 0,05, Mann Whitneyn testi, kaksi- tailed; taulukko 1). TNM luokittelu paljastui 60 organ rajoitu (≤pT2c) ja 10 kehittyneet (≥pT3a) PCa. Kohdentaminen potilaiden alhaisen ja korkean riskin ryhmiin vaihteli huomattavasti luokitusjärjestelmissä (taulukko 1).

biomarkkereiden löytö yhteensä 125 siemennestettä plasmanäytteistä käytettiin 70 potilasta PCA, 21, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu ( BPH), 25 potilasta, joilla on krooninen eturauhastulehdus (CP) ja 9 tervettä ohjaus (HC). Tämä pooli saatavilla näytteitä käytettiin koostumus vaihtelee kolmessa tutkimuksessa aseita. In tutkimuksessa ”Diagnostic Markers” 50/125 potilaiden kanssa ja ilman eturauhassyövän (22 PCA 14 CP, 9 BPH ja 5 HC) käytettiin biomarkkereiden löytö ja loput 75/125 potilasta (48 PCA 12 BPH, 11 CP ja 4HC) käytettiin diagnostisia testit. Tutkimuksessa B ”Advanced Disease Markers” käytettävissä PCa näytteitä (n = 70) stratifioitiin Gleason. Sillä biomarkkereiden löytö potilaalla on Gleason 7 (n = 21) ja Gleason pisteet 7 (n = 16) verrattiin. Loput 33/70 potilaalla on Gleason pisteet 7 (28 veltto sairaus PT3A ja 5 ≥pT3a edenneen taudin mukaan ELY suuntaviivat) käytettiin testaamiseen kliinistä suorituskykyä. Lisäksi tutkimuksessa C alustava arviointi vakauden ja tarkkuuden lähestymistavan suoritettiin.

proteomiikan profiilit

CE-MS-analyysi tuotti korkean resoluution profiileja (kuvio 2, taulukko S1). Alustavaan profiili kalibrointia käytimme synteettisiä isotoopilla leimattu peptidejä referenssinä. Tämä pre-kalibrointi sallittu määritelmä 287 ”house-keeping peptidit” referenssinä massan ja Muuttoaikoina datapisteitä. Kuten ioni signaalin voimakkuus (amplitudi) osoitti merkittävää vaihtelevuutta, signaalit 46 erittäin runsaasti peptidejä käytettiin sisäisenä standardina peptidien signaalin normalisoinnin (taulukko S2). Nämä peptidit olivat läsnä 97% analysoiduista näytteistä ja osoitti alin signaalin vaihtelua. Menettely käyttää ”sisäinen standardi” varten amplitudi normalisointi, osoitettiin olevan helppo ja luotettava tapa käsitellä sekä analyyttisen ja laimennus vaihtelut yhdessä kalibroinnin vaiheessa [11]. Tandem-massaspektrometrialla [12] – [14] tunnistettiin 141 natiivi uraauurtava peptidejä, jotka edustavat 47 eri vanhempien proteiineja (taulukko S3). Kahdeksankymmentäkahdeksan tunnistetut peptidit (83/141, 59%) oli fragmentteja semenogelin-1 tai -2, ylivoimaisesti yleisin peptidejä alhaisen molekyylipainon siemen proteomin.

Kapillaarielektroforeesi kytketty massaspektrometria profilointi kivutonta uraauurtava plasman paljasti yhteensä 1784 peptidejä. Synteettiset peptidit terästetty näytteet valmiiksi kalibrointia varten on merkitty valkoisilla nuolilla. Normalisoitu molekyylipaino (700-25,000 Da) logaritmisessa mittakaavassa piirretään normalisoitu Muuttoaikoina (15-45 min). Keskimääräinen signaalin intensiteettiä polypeptidin huipun annetaan 3D-kuvaus. Koottu data sarjaa PCa (tapaus) yhdistetty kaikki tarkastukset ja myös erikseen CP (kontrolli), BPH (kontrolli) ja HC (valvonta) harjoituskentältä asetettu näkyvät.

biomarkkereiden löytö

tutkimus V: Diagnostic merkkiaineita.

diagnostinen biomarkkereiden löytö jaoimme käytettävissä 125 näytteet löytö asetettu 22 PCA 14 CP; 9 BPH ja 5 HC näytteitä ja loput 48 PCA 12 BPH, 11 CP, ja 4HC näytteet itsenäiseksi Koepakettia (kuvio 1). Useita testaus tilastot johti 21 syrjivä polypeptidien muuttunut merkittävästi potilaiden välillä ja ilman eturauhassyövän (taulukko 2 ja kuva 3). Kuusi 21: stä polypeptidien havaittiin fragmentteja N-acetyllactosaminide beeta-1,3-N-asetyyliglukosaminyylitransferaasi, eturauhasen hapan fosfataasi, semenogelin-1 ja -2 (taulukko 3). Sen määrittelemiseksi biomarkkereiden ehdokkaille luotettavasti erottamaan PCa ja BPH, vertasimme BPH

vs.

PCA, BPH

vs.

CP HC, ja BPH

vs.

PCa CP HC sopivilla useita testaus tilastoja. Viisi polypeptidit olivat merkittävästi kaikissa kolmessa kokeessa viittaa soveltuvuutta näistä ehdokkaista spesifisesti tunnistaa BPH ja siksi ei esiinny PCa (taulukko 2, kuva 3). Yksi heistä oli fragmentti GTPaasina IMAP perheenjäsenen 6 (taulukko 3).

Normalisoitu molekyylipaino (700-+25,000 Da) logaritmisessa mittakaavassa piirretään normalisoitu Muuttoaikoina (15-45 min). Keskimääräinen signaalin intensiteettiä polypeptidin huipun annetaan 3D-kuvaus. Keskimäärin data sarjaa opetusjoukolla esitetään.

soveltaa kaksivaiheista lähestymistapaa: (i) ensimmäisen paneelin (21 polypeptidejä, 21PP) erottaa PCa ja BPH tulehduksellinen ja terveen eturauhasen; (Ii) toinen paneeli (5-polypeptidejä, 5PP) erottamaan PCa ja BPH. Molemmat allekirjoitukset koulutettiin löytö kohortin (kuva 1) käyttämällä tukivektorikone algoritmeja (SVM) ja saavutti AUC-arvot 100% (95% CI 93% -100%) ja 21PP ja 99% (95% CI 90% -99 %) ja 5PP.

vahvistusta luokituksen suorituskykyä biomarkkereiden allekirjoitukset olemme soveltaneet yhdistelmä 21PP ja 5PP riippumattoman kokeen sarja 48 PCA 12 BPH, 11 CP, ja 4HC (kuvio 1). Näytteitä positiivinen 21PP (yläpuolella luokitus katkaistu) on luokiteltu uudelleen käyttämällä 5PP nimenomaan tunnistaa BPH ilman PCa. Siksi näytteet positiivisia 21PP ja negatiivisia 5PP pidettiin PCa, näytteet positiivinen joko paneelien pidettiin BPH ja näytteet negatiivisia 21PP (alle luokitusta katkaistu) katsottiin CP tai HC kontrollinäytteitä. Tämä lähestymistapa tunnistettu oikein 40 ulos 48 PCa näytteiden [83% herkkyys (95% CI 70% -93%)], 6 12 BPH ja 12 15 ohjaa [67%: n spesifisyys (95% CI 46% -83%)] . AUC-arvo oli 75% (95% CI 64% -83%,

P

= 0,0001). Havaittu diagnostinen suorituskyky oli peräti suorituskykyä PSA referenssinä, joka osoitti 87% herkkyys (95% CI 75% -97%) ja 59% spesifisyys (95% CI 40% -80%).

tutkimus B: Advanced tauti biomarkkereiden.

edenneen taudin biomarkkereiden löytö jaoimme käytettävissä 70 PCa näytteet koulutus asetettu 37 PCa näytteitä (21 leikkauksen Gleason pisteet 7, 16 postoperatiivisesti Gleason pisteet 7). Loput 33 näytteiden leikkauksen Gleason pisteet 7 käytettiin Koepakettia. Vertailu 21 GS 7 potilasta ( PT3A) 16 GS 7 potilasta (11 PT3A, 5 PT3A) käyttää tilastoja korjattu useita testaus johti 11 biomarkkerina ehdokkaita fragmentti Stabilin-2 joukossa (taulukot 2 ja 3). Nämä kuten kuvio (11PP) havaittiin luokitella kohortti AUC on 99% (95% CI 87% -100%, kuva 1).

testaamiseksi suorituskyvyn biomarkkerit liittyy pitkälle edennyt tauti, 11PP levitettiin testipakkauksesta sairastavien potilaiden leikkauksen Gleason pisteet 7, joita ei ole käytetty biomarkkereiden löytö. Niistä 33 näytettä, 9 pisteytettiin kehittynyt (yli luokitus katkaistu) ja 24 kuin veltto kasvain (alle luokitus katkaista).

Kliinisessä käytössä eri luokittelujärjestelmien arvioinnissa on käytetty riski eturauhassyövän etenemisen . Siksi vertasimme suorituskyky meidän biomarkkereiden viiteen yleisesti käytetty järjestelmissä (taulukko S4): 11PP tuloksia merkittävästi korreloi TNM vaiheisiin [rho 0,423 (95% CI +0,093-,669), P = 0,0142], EAU pisteet [rho 0.408 ( 95% CI +0,076-+0,659), P = 0,0183], ja NCCN pisteet [rho 0,365 (95% CI 0,024-0,629), P = 0,0370] (kuva 4A-C), kun taas CAPRA, RTOG ja D’Amico pisteet eivät olleet korreloi (tuloksia ei ole esitetty). Käyttäen EAU luokittelua standardiliuoksena 11PP tunnistettu oikein 4/5 kehittynyt (≥pT3a) ja 23/28 elimeen rajoittunut ( PT3A) kasvaimia, mikä johtaa AUC 83% (95% CI 66% -94%,

P

= 0,0055, kaksipuolinen teho β = 0,84, kuvio 5D). Herkkyys oli 80% (95% CI 29% -97%) ja spesifisyys oli 82% (95% CI 63% -94%)].

(A) .Box ja hiuksenhienosti käyrät saatu 11PP tuloksia testin kohortti Eturauhassyövän potilaalla on GS 7 ryhmiteltynä TNM, (B) EAU, ja (C) NCCN luokitus järjestelmiä. Musta neliö osoittaa mediaanit ja viikset 1,5-kertainen kvartiiliväliä. Sijoitus korrelaatiokertoimet rho, kunkin 95% CI ja P-arvot on annettu edellä. (D) ROC-käyrän (mustat viivat) varten 11PP luokittelu riippumattoman validointi kohortin Eturauhassyövän potilaalla on GS 7 joko veltto (N = 28) tai edistyneen (N = 5) taudista EAU luokittelun vertailustandardina. 95%: n luottamusväli piirretään katkoviivat. Diagonaalinen viiva edustaa arvaamaan todennäköisyys kanssa AUC 0,5. 95%: n luottamusväli (CI) näytetään katkoviivoin.

(A) on keskimäärin 1887 ± 202-polypeptidien havaittiin kullakin 14 mittausten varastoidaan eri aikoina RT: ssa. Keskimääräinen on merkitty lihavoidulla viivalla; keskihajonta on korostettu harmaalla. (B) Tämän lisäksi laadullinen arviointi biomarkkereiden allekirjoitukset levitettiin 14 vakautta replikoituu saadaan kvantitatiivista tietoa ajasta riippuvaa vakautta siemennesteestä plasmaa. Sillä 21PP sijoittui korrelaatio analyysi paljasti merkittävän vähenemisen SVM tulokset ajan mittaan Spearmanin rho of -0,576 (95% CI -0,854–0,07, P = 0,0379). Regressioanalyysi paljasti lasku nopeudella -0,05 A.U. ( 2%) tunnissa. 5PP ja 11PP ei ollut mitään merkittävää aikaa riippuvuutta. (C) Analyyttinen tarkkuus perustettu SVM luokittelijoiden arvioitiin soveltamalla sitä 15 CE-MS aineistoja saadaan riippumaton rinnakkaiskokeeseen näyte 57 vuotias potilas merkittäviä BPH. Mean luokittelu tulokset olivat 0,619 ± 0,07, 2,290 ± 0,81, ja -1,239 ± 0,18 21PP, 5PP, ja 11PP vastaavasti. Kertoimet vaihtelut laskettiin jakamalla keskihajonnat jonka havaittu yleistä valikoiman SVM tulokset [korostusvärillä, 21PP -1,50-+1,50 (3,0 AU), 5PP 4,50-3,0 (7,5 AU), ja 11PP alkaen -1,50 on 1,50 (3,0 au)]. Kertoimet vaihtelu oli 2,2%, 10,8%, ja 6,1%, vastaavasti. Luokittelu cut off edustaa vaakarivillä. Laatikot kuvaavat keinoja ja keskihajonta viikset.

Tutkimus C: arviointi biomarkkereiden vakauden ja toistettavuus.

Seminal plasma osoitti vahvaa preanalyyttiset stabiili huoneenlämmössä. Saadut profiilit olivat hyvin samankaltaisia ​​ilman massiivisia katoaminen tai muodostumisen huonontunut palasia. Keskimäärin 1887 ± 202 peptidit (kuvio 5A) havaittiin 14 rinnakkaista. Tutkiminen 21PP näihin 14 rinnakkaista määrällisesti aika riippuvuus vakaus paljastui huomattava lasku SVM tulokset ajan mittaan Spearmanin rho of -0,576 (95% CI -0,854–0,07, P = 0,0379, kuvio 5B). Regressioanalyysi paljasti lasku nopeudella -0,05 A.U. ( 2%) tunnissa. 5PP ja 11PP ei ollut mitään merkittävää aikaa riippuvuutta. Analyyttinen tarkkuus perustettu SVM luokittelijoiden arvioitiin 15 itsenäistä rinnakkaista. Mean luokittelu tulokset olivat 0,619 ± 0,07, 2,290 ± 0,81, ja -1,239 ± 0,18 tuloksena kertoimien muunnelmia 2,2%, 10,8%, ja 6,1% 21PP, 5PP, ja 11PP, vastaavasti (kuvio 5C).

keskustelu

Oletimme, että siemennesteestä plasmassa on vankka lähde uusien PCa peptidin maker profiileja pystytään parantamaan päädiagnoosina eturauhassyövän ja erottaa kehittynyt alkaen indolent sairaus.

Vastakohtana aikaisempien raportit proteomic profiloinnin uraauurtava plasmaa käyttämällä tryptiselle ruuansulatusta [15], käytimme natiivi siemen plasmaan biomarker Proteomiikan analyysiä. Tärkeimmät edut tässä ylhäältä alas lähestymistapa luonnossa esiintyviä peptidejä ovat kyky suoraan havaita yhdistelmiä translaation jälkeisiä modifikaatioita, kvenssivariantit, ja hajoamistuotteita. Olemme havainneet lähes 2000 eri uraauurtava peptidejä ≤20 kDa. Ne olivat fragmentteja suurempi vanhempien proteiineja, joita osittain myös havaita aiemmin käyttämällä tryptisiin digestioita. Kuitenkin lähestymistapamme myös tunnistaa vielä tuntemattomia uraauurtava ainesosia (taulukko S3).

sukupolvi Näiden luonnossa esiintyvien peptidien riippuu proteolyyttinen nesteyttäminen huudahtaa ja seuraa useita proteolyyttisiä fragmentteja siemen proteiineja. Tauti liittyy muutoksia tässä proteolyyttisten nesteytysmenetelmän voisi selittää havaintomme, että jotkin luonnossa esiintyviä fragmentteja ovat merkittävästi muuttuneet siemen tasoja ja muiden samantyyppisten vanhempien proteiinin eivät. Siksi preanalyyttiset vakautta ja analyyttinen toistettavuus ovat erittäin tärkeitä onnistuneen biomarkkereiden löytö ja kliininen validointi. Ensimmäinen virstanpylväs nykyisessä tutkimuksessa oli kehittää yksinkertainen ja toistettavissa näytteenotto- menettely ottaen kliinisessä rutiinia ympäristössä. Annoimme nesteyttäminen päästä lopulliseen vakaan tilan, dokumentoidaan vakiomäärä havaittavissa polypeptidejä ajan (kuvio 5A), mutta valvottua aika näyte varastointia -80 ° C: ssa olevan alle 60 min häiriön välttämiseksi ajasta riippuva biomarkkereiden epävakautta huoneenlämmössä (kuvio 5B).

Näytteet eturauhasessa, veri, uraauurtava plasma ja virtsan ja ilman eturauhasen hieronta parhaillaan intensiivisesti analysoidaan mahdollisten PCa biomarkkereita [5], [6]. Vaikka kudos odotetaan olevan proksimaalisesti taudin alkuperästä ja korreloivan korkeimmat biologisten merkkiaineiden pitoisuudet, näytteenotto kudoksen on liittyy invasiivisia interventio kaikkia riskejä ja rajoituksia. Sen sijaan erityisesti siemennestettä plasmasta ja virtsasta ovat helposti saatavilla. Kuitenkin proteolyyttinen käsittely on yhä tärkeämpiä hyödyntämistä merkkiaineiden peräisin bodyfluids. Alustavien tietojen siemennesteestä plasma vakauteen (kuvio 5A /B) ei saada näyttöä massiivinen jälkeistä näytteenottoa hajoaminen toisin havaittiin veren seerumin [16] tai plasma [17]. Siksi uraauurtava plasma voisi yhdistää korkea läheisyys eturauhanen kuin kasvaimen vain ylittää suoran eturauhasessa näytteenoton kanssa erinomainen vakaus ja saatavuutta virtsan [18] – [21], mikä tekee siitä erittäin lupaava lähde mahdollisten PCa biomarkkereita.

pystyimme määrittämään ja validoida vankka biomarkkereiden allekirjoitukset diagnosointiin Eturauhassyövän. Herkkyys 83% (95% CI 70% -93%) diagnosoida PCa oli hyvin verrattavissa raportoitu aikaisemmin CE-MS perustuu virtsan biomarkkerit allekirjoitukset (herkkyys 86%: sta 90%). Spesifisyys 67% (95% CI 46% -83%) oli hieman parempi kuin heidän virtsan kollegansa 59% ja 61%, vastaavasti [8], [9].

Lisäksi huomasimme uraauurtava biomarkkereiden allekirjoitus, joka erottaa (

P

= 0,0055) potilailla, joilla on leikkauksen jälkeisen Gleason pisteet 7 kanssa veltto ( PT3A) tai edistyneen (≥pT3a) taudin korkea herkkyys ja spesifisyys 80% ja 82% vastaavasti. Nykyinen kliininen rutiinia käyttäen seerumin PSA ja ennen leikkausta Gleason summa pisteet tunnistaa edenneen taudin edelleen puutteellinen, koska suurin osa seulonnan havaittu PCa on PSA-arvot 4-10 ng /ml ja kohtalainen Gleason summa tulokset 6 ja 7. Tämän vuoksi nämä biomarkkerit, jotka perustuvat leikkauksen jälkeisen tuloksen tietoja standardiliuoksena voisi edustaa tulevaisuuden mahdollisuus, että ei-invasiivisen ennen leikkausta erilaistuminen elin rajoittuu ja kehittynyt kasvain vaiheissa. Lisäksi kasvaimen arviointi ennen leikkausta Gleason luokittelu edellyttää invasiivisia saada kudosnäytteiden, ja vaikeuttavat merkittävästi operaattoreiden välinen vaihtelu ja eroavuudet ennen ja jälkeen leikkauksen tulokset peräti 35% tapauksista [22] . Lisäksi potilailla, joilla on kliinisesti paikallinen sairaus (kasvain vaiheissa T1 ja T2), noin 30% on todettu paikallisesti edennyt kasvaimia seuraavia radikaaleja. Tämän vuoksi on olemassa todellinen vaara alle kohtelun tässä potilasryhmässä, jos hallinnoi valvontaa. Jatkossa biomarkkereiden profiilin voisi auttaa välttämään alle hoitoon näillä potilailla, joilla on epäselvä kliininen esitys.

Yksi differentiaalisesti ilmaisi uraauurtava proteiineihin oli eturauhasen hapan fosfataasi (ACPP), joka on negatiivinen säätelijä solukasvun LNCap-soluja [23]. Säätelyä alaspäin solujen ACPP liittyy androgeeni-riippumaton kasvaimen kasvun ja korkean tuumorigeenisyyden kehittyneiden PCa laadut [23].

havaittu semenogelin-1-fragmentti 316-344 (ID18990) yhtenä 21 säädellään eri tavalla polypeptidien (taulukko 2 ja taulukko 3). Vaikka tämä fragmentti voi suoraan osoitetaan KLK3 (= PSA) pilkkominen työmaalla 315 (SSIY-SQTE), tämä pitää voida sanoa muista havaittu semenogelin fragmentteja. Näitä ei voida selittää KLK3 pilkkomalla yksin syytetään läsnä on monimutkaisempi proteaasiaktiivisuutta verkkoon useita loppupään pilkkominen tapahtumia sen jälkeen, kun alkuperäisen KLK3 pilkkomisen On hyvin tunnettua, että on olemassa keskinäinen aktivointia ja inhibitiota mekanismeja nesteytykseen kaskadin [24], mikä voisi johtaa eri ”alavirtaan” pilkontamallien. Rooli mahdollinen peptidaasien mukana muodostumista spesifisen peptidin fragmentteja ei voida arvioida tällä hetkellä. Muissa kokeelliset tutkimukset mahdollista osallistumista eksopeptidaasit tulisi käsitellä, mikä saattaa edelleen käsitellä alkuperäisen fragmentteja. Kuitenkin nykyinen kirjallisuus ei riitä osoittamaan erityistä pilkkomisalueet semenogelin erillisille eksopeptidaasit [25].

Tutkimuksemme edessään useita rajoituksia. Lahjoitus uraauurtava plasma tekee diagnoosin liittyy useita käytännön kysymyksiä. Nykyisestä tutkimuksessa olemme oppineet, että 30-50% potilaista ovat halukkaita ja kykeneviä lahjoittamaan huudahtaa ennen radikaaleja eturauhasen leikkausta. Uskomme kuitenkin, että hyväksyntä parantavat viestimällä lupaavia tuloksia meidän esitutkimus.

Emme voineet osittain kompensoida puuttuu noudattamista sisällyttämällä terveillä vapaaehtoisilla ja potilailla, joilla on krooninen eturauhastulehdus. Vaikka nämä ikäryhmät meille mahdollisuuden vahvistaa alunperin olettamuksiin siemennesteestä plasma tarjoaa vankan lähde biomarkkereiden, hekin ovat ottaneet käyttöön jonkin verran harhaa liittyvien ikänsä ero verrattuna PCa ja BPH ryhmiä. Lisäksi meidän poikkileikkauksen testi ikäluokat ovat suhteellisen pieniä ja vinossa. Siksi tuleva vahvistava tutkimuksia tulisi mieleen hyvin moottoroidut, tasapainoinen, ja samanikäisiin ohjaus ikäluokat kliinisten tutkimusten tulosten kanssa tietojen PCa alatyyppien seurannan. Perustuen pienimuotoista testi Tässä esitetyt tiedot, otoskoko laskelmat tämäntyyppiseen Tutkimuksen arvion yhteensä otoskoko 200 potilailla, joilla on pitkälle edennyt tai aggressiivinen PCa ja 302 potilasta, joilla oli paikallinen veltto tauti osoittaa minimaalinen herkkyys ja spesifisyys 70% ja 80% pitkälle PCA vastaavasti.

Vaikka käyttämällä state-of-the-art tandemmassaspektrometrian, emme voineet kulkua biomarkkereiden ehdokkaita. Toisin kuin tunnistamiseen emoproteiinien tryptisesti peptidi massa sormenjälkien, natiivi peptidisekvensoinnilla rajoittaa translaation jälkeiset modifikaatiot, mikä vaikeuttaa paitsi peptidifragmentaatiota, mutta myös myöhemmin tietokantahakuihin.

Johtopäätökset

pystyivät vahvistamaan alunperin hypoteesia, että siemennestettä on vankka lähde tunnistamiseksi PCa proteiinin maker profiileja varhaisdiagnoosiin eturauhassyöpää. Tutkimuksemme liittyy kaksivaiheinen kokeellinen lähestymistapa riippumaton löytämisen ja testi näytesarjaa suhteessa postoperatiivisesti kliinistä referenssistandardia. Tämä muotoilu on yhdenmukainen nykyisten suuntaviivojen kliinisen proteomianalyysi [26]. Vaikka ikäluokat ovat suhteellisen pieniä ja valittu, ne olivat sopivia arvioimaan mahdollisuutta uraauurtava profiloinnin ja arvioida mahdollisuuksia uraauurtava peptidejä diagnostisia biomarkkereita. Siksi tässä tutkimuksessa tulisi ymmärtää erittäin ensimmäinen askel alan uraauurtava biomarkkereita. Meidän havainnot takaa lisää vahvistavia tutkimuksia laajentuneen valitsematta mahdollisille validointi kohortteja vahvistaa ja tarkka diagnostinen potentiaali uraauurtava biomarkkereiden ehdokkaat ja heidän (patologis) fysiologista merkitystä.

Materiaalit, Potilaat ja menetelmät

etiikka lausunto

tutkimus hyväksynyt eettinen komitea yliopiston Leipzig (Veronumero 084-2009-20042009) ja suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Tutkimusasetelma ja uraauurtava plasma näytteenotto

Hyödynnettävät siemennesteestä plasmanäytteet otettiin 70 potilasta PCA, 21, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH), 25 kroonista eturauhastulehdus (CP) ja 9 terveillä verrokeilla (HC). Koska kliininen viitestandardi käytimme yhdistelmää histologista loppukäsittelyn eturauhasen yksilöitä varten leikkauksen jälkeisen kasvain luokittelu ja lavastus PCA potilaiden ja negatiivinen 10-12 neula eturauhasen biopsia ytimien ja /tai negatiivinen eturauhasen resektio yksilöiden BPH potilailla. Kaikki potilaat pyydettiin lahjoittamaan siemennestettä ennen radikaali kirurginen resektio eturauhasen aikana hedelmättömyyttä tai urologinen diagnostiikassa. Sillä biomarkkereiden löytö käytettävissä 125 näytteet erotettiin kolmeen tutkimushaaroista, yksi diagnostisia biomarkkerit (tutkimus A), toinen pitkälle taudin biomarkkereita eri koulutusta ja testi sarjaa (tutkimus B), ja biologisten merkkiaineiden vakaus ja toistettavuus (tutkimus C, kuva 1). Tutkimuksissa A ja B, näytteitä käytettiin joko löytö tai suorituskykyä mittaavien testien, mutta ei molempia. Viisikymmentä näytteet (22 PCA 9 BPH, 14 CP, 5 HC) käytettiin opetusjoukolla diagnostisiin biomarkkereiden löytö (taulukko 1A), 75 näytettä sisällytettiin koepaketti diagnostiikkayritykset suorituskyky (48 PCA 12 BPH, 11 CP , 4 HC, taulukko 1 B). Kehittyneen tauti biomarkkereiden löytö jaoimme käytettävissä 70 PCa näytteet koulutus asetettu 37 PCa näytteitä (21 GS 7, 16 GS 7). Loput 33 näytteiden GS = 7 käytettiin Koepakettia (28 PT3A ”veltto”, 5 ≥pT3a ”kehittynyt”).

Vertasimme viisi eri lähestymistapoja riskin arviointi kliinisiä PCa etenemisen : perustuu suuntaviivoiksi AUA [27], joka antoi D’Amico kriteerien [28], National Comprehensive Cancer Network (NCCN) perusteet [29] Sädehoito Oncology Group (RTOG) perusteet [30], Euroopan Association of Urology (EAU) suuntaviivat [31], ja Syöpä eturauhasen Risk Assessment Score (CAPRA) maalin [32] (taulukko S4). Uraauurtava plasmanäytteet sisäisesti koodattu ja analysoitiin sokkona (Koepakettia) todettuaan biomarkkereiden profiilin (opetusjoukolla).

Jotta analysoimiseksi preanalyyttiset vakaus uraauurtava plasma saadaan tällä näytteenottomenettelyllä, yksittäinen näyte potilaan kätkeminen PCa sulatettiin ja valmistettiin kaksi riippumatonta näytteitä (tutkimus C). Loput näytettä inkuboitiin huoneenlämpötilassa. Kuusi tuntia tunnin välein kaksi rinnakkaista olivat valmiit. Kaikki 14 valmistetut rinnakkaista lyofilisoitiin pian valmistuksen jälkeen ja uudelleen keskeytettiin välittömästi ennen CE-MS-analyysia.

Analyyttinen tarkkuus perustettu SVM luokittelijoiden arvioitiin soveltamalla sitä 15 CE-MS aineistoja saadaan riippumaton rinnakkaisnäytettä näyte 57 vuotias potilas merkittäviä BPH. Eturauhasen tilavuus oli 120 cc ja seerumin kokonais-PSA 4,3 ng /ml. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ja keskihajonta. Kertoimet vaihtelut laskettiin jakamalla keskihajonnat jonka havaittu yleistä valikoiman SVM tulokset [21PP -1,50-+1,50 (3,0 AU), 5PP -4,50-+3,0 (7,5 AU), ja 11PP -1,50-+1,50 (3,0 AU)].

Sample hankinta ja proteomiikka-analyysi

siemensyöksyn kerättiin ja annettiin luonnon nesteyttäminen tapahtuvan proteolyysin huoneenlämmössä 15-30 min. Tämän jälkeen näytteet sentrifugoitiin 4000 rpm: ssä 10 min erottaa siittiöitä peräisin siemennesteestä plasmasta. Sitten supernatantti jaettiin 50 ul: n eriä ja pakastettu -80 ° C: ssa jatkokäsittelyyn saakka.

Näytteen valmistus

Välittömästi ennen valmistusta, siemennesteen plasmanäytteet sulatettiin ja proteiinikonsentraatio säädettiin arvoon 2 mg /ml. 10 ui-toistojen lyofilisoitiin, säilytettiin 4 ° C: ssa.