Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Se oli hyvin tiedossa, että kliiniseen käyttöön kemoterapeuttisten rajoittaa vakavia haittavaikutuksia ja huumeiden vastukset. Siten on tarpeen selvittää strategiaa lisätä erityinen anti-kasvain tehokkuutta kemoterapeuttisten. Apigenin, eräänlainen flavonoideja, on raportoitu omaavan syövänvastaisia ​​toimintaa hyvin sytotoksisuus normaalia kudosta.

Menetelmät /Principal Havainnot

tulokset solunelinkykyisyysmääritys, western-blotit ja TdT -välitteisen dUTP-biotiini nick end merkinnät (TUNEL) määrityksessä osoitti synergistisen proapoptoottisten vaikutuksia pienellä annoksella apigeniiniä ja paklitakselin ihmisen syöpäsolujen linjat. Analysoida taustalla olevaa mekanismia, tutkimme reaktiivisen hapen (ROS) värjäys jälkeen soluja käsiteltiin yhdistelmällä apigeniini ja paklitakselin, tai jokainen niistä yksinään. Tiedot virtaussytometrialla osoitti, että superoksideja mutta ei vähentäminen peroksidien kertynyt HeLa-soluissa on käsitelty apigeniini tai yhdistelmä apigeniini ja paklitakseli. Apigenin ja paklitakselin aiheuttama HeLa-solujen apoptoosin liittyi tasoon ROS soluissa. Arvioimme lisäksi aktiivisuus ja proteiinin taso superoksididismutaasi (SOD). Apigenin ehkäisi merkittävästi SOD aktiivisuutta mutta ei muuttanut SOD-proteiinin taso viittaa siihen, että apigeniiniä edistetään ROS kertymistä kautta tukahduttamalla entsyymiaktiivisuutta SOD. Lisäksi Zn

2 +, Cu

2+ ja Mn

2+ solun lysaatit estyy apigeniiniä vaikutuksista SOD toimintaan. Samaan aikaan, tiedot kaspaasi-2 yli-ilmentyminen ja tippuu alas kokeet osoittivat, että kaspaasi-2 osallistui apigeniiniä ja paklitakselin aiheuttama HeLa apoptoosin.

Johtopäätökset /merkitys

Taken yhdessä, meidän tutkimus osoitti, että apigeniiniä voi herkistää syöpäsolut paklitakselille aiheuttaman apoptoosin kautta tukahduttaa SOD aktiivisuuden, mikä sitten johti kertymistä ROS ja pilkkominen kaspaasin 2, mikä viittaa siihen, että yhdistetty käyttö apigeniiniä ja paklitakselilla oli tehokas tapa vähentää paklitakselin otettu.

Citation: Xu Y, Xin Y, Diao Y, Lu C, Fu J, Luo L, et ai. (2011) Synergistinen vaikutus Apigenin ja paklitakselilla apoptoosi syöpäsolujen. PLoS ONE 6 (12): e29169. doi: 10,1371 /journal.pone.0029169

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 22 marraskuu 2011; Julkaistu: 21 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Nature Science Foundation of China (nro. 81072433 ja 31071000), Jiangsu Major Nature Science Foundation High Education (nro 07KJA18026) ja rahoittama projekti Priority Academic ohjelmasuunnitteluosastolle Jiangsun korkeakouluissa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kemoterapia on eräs laajimmin käytetään syövän hoitomuotoja. Kuitenkin monet kemoterapeuttiset lääkkeet voivat tuottaa epämiellyttäviä sivuvaikutuksia, erityisesti kun suuria annoksia. Yksi kemoterapeuttisten, paklitakseli, joka on mitoosi estäjä, voi johtaa yliherkkyysreaktioita [1], neutropenia [2], neurotoksisuus [3], sydämen rytmihäiriö [4] ja muita sekalaisia ​​myrkyllisiä vaikutuksia [5], joka vakavasti pahentaa elämänlaatua syöpäpotilaiden ja johtaa annoksen pienentämistä ja hoidon lopettamista. Sen vuoksi on tärkeää vähentää haitallisia sivuvaikutuksia kemoterapeuttisten aineiden kliinisissä syövän hoitoon. Lisäksi lääkeresistenssin kliinisessä usein häiritsee tehokkuutta solunsalpaajalääkeaineiden.

reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sisältäen superoksidiradikaalia, vetyperoksidia (H

2O

2), hydroksyyli radikaali, typpioksidi, ja erilaisia ​​typpioksidin peräisin reaktiivisia nitro lajien (RNS) on muodostettu luonnon sivutuotteet normaalin aineenvaihdunnan hapen ihmisen soluissa ja kudoksissa. Koska niiden erittäin reaktiivisia luonteeltaan, ne yleensä osallistua ei-toivottuja reaktioita, jotka aiheuttavat vahinkoa soluille ja lopulta johtaa sairauksiin. Syöpäsolut osoittavat lisääntynyttä Glykolyysivaiheen yhdessä alennetuin hengitystä ja näiden muutoksia aineenvaihduntaan on osoitettu liittyvän tehostetun oksidatiivista stressiä [6] – [8]. Suuri solu redox tila voisi stimuloida kasvaimen muodostumisen luomalla parannetun soluproliferaatioon ympäristö, asiakkuutta DNA-vaurioita, ja sammuttamalla tuumorisuppressiogeeneksi toiminnot [9], [10]. Kasvaimen kasvu ja muuttoliike voitiin estää

in vitro

jonka muuttaminen ympäristönsä kasvainsolujen entistä vähentää yksi. Vastakohtana tälle, korkea solu redoksitilassa tukisi myös voimistunutta apoptoosia, mikä estää kasvaimen muodostumista. Niinpä syöpäsolut, korkea redoksitilassa voisivat parantaa heidän sietokyky ympäristön häiriötekijöille ja kemoterapeuttiset lääkkeet. Kasvainsolujen ilmaistuna korkeamman tason MnSOD osoittavat huonoon ennusteeseen [11], [12]. On osoitettu, että ROS on kyvystä käsitellä kaspaasi-2 [13], [14], joka on initiaattorin kaspaasi johti mitokondrion kalvon läpäiseväksi [15], ja se on myös tärkeä jäsen apoptoosin signaalin vahvistuksen silmukan [16]. Lisäksi aikaisemmat tutkimukset kaspaasin 2 tippuu-out hiirillä ovat osoittaneet, että kaspaasi-2 aktivaatio oli liittyvät ROS kertymistä [17]. Alennettu apoptoosin nopeus havaittiin myös

kaspaasi-2

– /-

varhaismunasolujen [18].

Apigenin (4 ’, 5, 7-trihydroxyflavone) on laajalti sisältyvät paljon hedelmiä ja vihanneksia. Äskettäin raportoitiin, että apigeniiniä oli potentiaalinen antituumorivaikutuksia useisiin ihmisen syöpäsolujen linjat sytotoksisuus eikä mutageenista vaikutusta. [19] – [21]. Apigenin voisi lisätä kertymiseen solun ROS ja oli pro-hapetin potentiaalia [22], [23] ja vähentää SOD aktiivisuuden keuhkosyövän soluihin [24].

Tässä työssä olemme osoittaneet, että apigeniiniä voisi herkistää syöpäsolut paklitakseli indusoi apoptoosia estävä SOD aktiivisuutta ja johtaa kertyminen ROS ja lohkaisu kaspaasi-2, mikä viittaa siihen, käyttö yhdessä apigeniini ja paklitakselilla oli tehokas syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja transfektio

ihmisen kohdunkaulan epiteelikarsinoomasolulinja HeLa, ihmisen keuhkojen epiteelikarsinoomasolulinja A549, ihmisen neekerinsukuista maksasolujen masolulinjassa Hep3B, ja ihmisen alkion munuaisen 293A (HEK293A) saatuja soluja Institute of Biokemian ja Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, PR Kiina), ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (Invitrogen), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Hyclone) ja antibiootteja (100 ug /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä) 5% CO

2 37 ° C: ssa. Ohimenevä transfektio suoritettiin modifioidulla kalsiumfosfaattimenetelmällä tai käyttämällä Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikissa tapauksissa kokonaismäärä DNA normalisoitiin tyhjä kontrolli plasmidit.

Vasta-aineet, Regents ja DNA-konstrukteja

Hiiren monoklonaalinen vasta-aine Flag-tag ostettiin Sigma. Kanin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan, poly ADP-riboosi-polymeraasi (PARP), kaspaasi-3- ja β-aktiini saatiin Cell Signaling Technology. Hiiren polyklonaalisia vasta-aine kaspaasin 2 tuli Santa Cruz Biotechnology. Kanin polyklonaalisia vasta-aineita lohkaistaan ​​kaspaasi-3 tuli Bioworld Technology, Inc. Mouse monoklonaalinen vasta SOD1 ja kanin polyklonaalisia vasta-aineita SOD2, Endo G ja AIF saatiin Abcam. Kaspaasi-2-estäjän bentsyylioksikarbonyyli-Val-Asp (OMe) -Val-Ala-Asp (OMe) -fluorom ethylketone (z-VDVAD-fmk) saatiin yhtiöstä Calbiochem. ROS detektioreagensseja (CM-H

2DCFDA ja dihydroethidium (DHE)) ja apoptoottinen havaitsemiseksi valtionhoitaja (FITC-anneksiini V ja propidiumjodidin puskuri) olivat Molecular Probes ™ (Invirogen). Dimetyylisulfoksidi oli peräisin Amresco. Apigeniini, paklitakselin ja DETC hankittiin Sigmalta.

pcDNA3.1-flag-caspase2 (WT) ja pRNAU6-caspase2 konstruoitiin käyttäen standarditekniikoita. pcDNA3.1 pilkottiin XhoI ja KpnI. Alukkeet (sense: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sense: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG) suunniteltiin tuottamaan pcDNA3.1-flag-caspase2 (WT).

kaspaasi-2

(NM_032982.2) geeni syntetisoitiin Invitrogen. pRNAU6 pilkottiin Bam HI ja Hind III, ja hehkutettu kohdistaminen oligonukleotidit ACAGCTGTTGTTGAGCGAA varten

kaspaasi-2

ligoitiin vektoriin [25].

Solujen elinkelpoisuus ja TUNEL-määritystä

arvioimiseksi paklitakselin aiheuttama sytotoksisuuden, kolorimetrinen Sytotoksinen 96 ei-radioaktiivista sytotoksisuusmääritys (Promega) suoritettiin valmistajan protokollan. Solujen elinkelpoisuus havaita mittaamalla endogeenisen laktaattidehydrogenaasin kvantitatiivisesti.

TdT-välitteisen dUTP-biotiini nick end merkintöjä (TUNEL) analyysi suoritettiin HeLa-soluissa käyttämällä Guava® TUNEL Kit kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Solut havaitaan Guava EasyCyte ™ System, ja tulokset analysoitiin käyttämällä Guava TUNEL Software (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). Kaikki määritykset suoritettiin kolme toistoa.

anneksiini V /PI määritys

anneksiini V /PI määritys käyttämällä anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäys kiinnittämättömiä soluja, erottelee varhainen apoptoottisia soluja ja myöhäinen apoptoottiset /nekroottisia soluja. Sekä kellumaan ja kiinnitetään solut suspendoitiin 500 ul: aan sitovaa puskuria (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl

2, 0,1% BSA). Anneksiini V-FITC: tä (5 ui) ja PI (5 ui) lisättiin sitten kuhunkin näytteeseen. 15 min kuluttua inkubaation pimeässä, virtaussytometrianalyysissä analyysi suoritettiin käyttäen guava EasyCyte ™ System. Kunkin näytteen 5000 solut analysoitiin. Tiedot analysoitiin käyttämällä guava TUNEL Software (guava Technologies, Hayward, CA, USA).

ROS havaitseminen

HeLa-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja sen jälkeen 24 h, soluja inkuboitiin kanssa ROS erityisiä väriaineet, dihydroethidium (dhe, 5 uM) tai CM-H

2DCFDA (5 uM), 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin apigeniini (15 uM), paklitakseli (4 nM) tai molemmat niistä vielä 30 minuuttia. ROS havaittiin käyttämällä Guava EasyCyte ™ ja analysoitiin Guava Express Pro Software (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). DHE havaittiin alle päästöjen sisällä 580-583 nm (PM1) ja CM-H

2DCFDA havaittiin alle päästö 525 nm (PK3).

eristäminen mitokondrioissa ja mittaus mitokondrion kalvon potentiaalia ( MMP) B

Ehjä mitokondrioissa erotettiin sytosolin osa HeLa-solujen edelleen proteiinin analyysin avulla Mitochondria Isolation Kit Thermo-Pierce Dounce homogenisoinnin ja differentiaalisentrifugointia suoritettiin mukaan valmistajan protokollaa.

mitokondrioiden kalvon potentiaali (MMP) HeLa-solujen mitattiin käyttämällä Guava EasyCyte ™ MitoPotential Kit (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) kohti valmistajan ohjeiden. Fluoresenssi- pohjainen väriaine 5, 5 ’, 6, 6′-tetrakloori-1, 1’, 3, 3 ’-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine jodidi (JC-1) käytettiin arvioimaan MMP muutoksia. Solu läpäisemätön väriaine 7-AAD käytettiin mittaamaan samanaikaisesti solukalvon läpäisevyyden muutoksia. Värjätään solut analysoitiin guava EasyCyte ™ System.

määritys superoksididismutaasi toiminnan

Entsyymiaktiivisuus SOD HeLa-soluissa mitattiin käyttämällä kaupallisia kittejä mukaan valmistajan protokollaa. Tässä määrityksessä, tetratsoliumsuolan käytettiin havaitsemiseen superoksidiradikaalien syntyy ksantiinioksidaasin ja hypoksantiini. Mitata MnSOD aktiivisuutta, solulysaateista sentrifugoitiin 10000 x g: erottaa MnSOD päässä CuZnSOD, ja CuZnSOD estyi, kun läsnä oli kaliumsyanidia.

RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä korkean Pure RNA Isolation Kit (Roche) protokollan mukaisesti valmistaja on kuvannut. RT-PCR suoritettiin käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Invitrogen), jossa osoitetun alukkeita (

kaspaasi-2

, sense: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sense: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG; GAPDH, sense: CATATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC, anti-sense: GAATTCTTACTCCTTGGAGGCCATGTGG). PCR suoritettiin Tm 58 ° C: ssa 30 sykliä reaktioseokseen 25 ml erikseen kutakin proteiinia. Sitten PCR-tuotteet eroteltiin 1% agaroosigeeleillä ja värjättiin etidiumbromidilla. Talon GAPDH käytettiin kontrollina.

Western-blot-analyysi

Solulysaatit sentrifugoitiin (15000 g) 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [27]. Vasta-aine-antigeeni-kompleksit tehtiin näkyviksi LI-COR Odyssey Infrared Imaging System mukaan valmistajan ohjeiden avulla IRDye800 flurophore konjugoitu vasta-aine (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

määritys Synergia

lääkeyhdistelmä määritettiin Chou-talalay menetelmällä. CI laskettiin Chou-Talalay yhtälö, jossa otetaan huomioon sekä teho (IC

50 tai D

m) ja jyrkkä annos-vaikutus-käyrä (m-arvo) [28], [29 ]. Klassinen isobolgram (CI = 1) saadaan: (A) B

nimittäjiä, (D

x)

1 ja (D

x)

2 ovat pitoisuuksia D

1 (apigeniiniä) ja D

2 (paklitakseli) käyttää yksin, jotka antavat x% estäminen, kun taas osoittajat, (D)

1 ja (D)

2 ovat annokset apigeniini ja paklitakselin käyttää yhdistelmänä että isoeffectively estävät x%. CI 1, CI = 1, ja CI 1 ehdottaa synergismiksi lisäaine ja vihamielisyys, vastaavasti.

Valitse mediaani-vaikutus yhtälö Chou ja Chou et al. [29], [30] (D

x)

1 ja (D

x)

2 voidaan helposti laskea. (B) B

Tässä D

m on mediaani vaikutuksettoman annoksen, joka on saatu anti-log X-leikkaus mediaani-vaikutus juoni, X-log (D) versus Y = log [f

a /(1-f

a)] tai D

m = 10

– (Y-akselin leikkauspiste) /m, ja m on kulmakerroin mediaani-vaikutus juoni. Automatisoitu laskettaessa m, D

m, D

x, ja CI-arvot ovat myös sallittuja tietokoneohjelmistojen.

Tilastollinen

Data edusti keskiarvona ± SD. Studentin t-testiä sovellettiin analysoida tilastollista merkitystä varianssi pareittain vertailu. Kaikissa analyyseissä, P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Yhdistelmä hoitoon apigeniiniä paklitakselilla merkittävästi sytotoksisuutta tehostavan ihmisen syöpäsoluja

Koska paklitakselin toksisuus on kytketty sen antituumorivaikutus ja apigeniiniä on raportoitu olevan kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta alhainen myrkyllisyys, ensin havaittu yhteistyössä vaikutukset comcination paklitakselin kanssa apigeniiniä. HeLa-soluja käsiteltiin eri annoksilla apigeniini, paklitakselista tai molemmat ja sitten elinvoimaisten solujen havaittiin. Kuten on esitetty kuviossa. 1A ja B, sekä apigeniini ja paklitakselin annosriippuvaisesti indusoidun sytotoksisuuden noin 29%: n vähennys solujen elinkelpoisuuden aiheuttama apigeniini annoksella 25 uM (Fig. 1A) ja 24%: n vähennys aiheuttama paklitakselin annoksella 10 nM (kuvio. 1B), vastaavasti. Kun käsitelty HeLa-solujen kanssa 15 uM apigeniini ja 4 nM paklitakselia, yli 50%: n lasku solujen elinkelpoisuuden havaittiin kuitenkin vähemmän kuin 20% lasku solujen elinkelpoisuuden havaittiin soluissa, joita käsiteltiin apigeniini tai paklitakselia vastaavasti (Fig. 1 C). Suoritimme Chou-Talalay laskelma vahvistaa synergiavaikutuksen apigeniiniä ja paklitakselin HeLa-soluissa. Yhdistelmä-indeksi (CI) oli 0,3918 ± 0,0436 annoksella 15 uM apigeniiniä ja 4 nM paklitakselia osoittaa synergistiset vaikutukset apigeniiniä ja paklitakseli. Nämä tulokset osoittivat merkittävästi lisääntynyt sytotoksisuutta kun apigeniiniä ja paklitakselin ylläpitäjä HeLa-solut samanaikaisesti. Myös kuviossa. 1C, yhdistelmä apigeniiniä paklitakselin aiheuttama samanlaisia ​​tuloksia syöpäsoluissa muu kuin HeLa-soluissa kuten Hep3B ja A549-soluja. Kuitenkin 15 uM apigeniiniä, 4 nM paklitakselia tai niiden yhdistelmä ei aiheuttanut sytotoksisuutta HEK293A soluissa (Kuva. 1 C). Nämä tiedot viittasivat oli synergistiset vaikutukset apigeniini ja paklitakselin nimenomaan tappaa syöpäsoluja

A, HeLa-soluja käsiteltiin kohonneet pitoisuudet apigeniini (0-100 uM) 24 tunnin ajan. Solujen elinvoimaisuus mitattiin. Koe itsenäisesti toistettiin kolme kertaa ja tietoja näytetään keskimääräisenä ± SD. B, HeLa-soluja käsiteltiin kohonneet pitoisuudet paklitakselin (0-50 nM) 24 tuntia. Cell elinvoimaa havaittiin ja analysoitiin, kuten on kuvattu julkaisussa A. C, HeLa, A549, Hep3B ja HEK293A solut altistettiin hoitoon apigeniini (15 uM) ja paklitakselin yhdistelmän (4 nM), 24 tunnin ajan. Cell elinvoimaa havaittiin, kuten on kuvattu julkaisussa A. D, HeLa-soluja käsiteltiin apigeniini tai paklitakselia vastaavasti, paitsi, muissa ryhmissä, apigeniini lisättiin HeLa-soluihin 2 tuntia ennen tai jälkeen paklitakselihoidolla tai apigeniini ja paklitakselia lisättiin HeLa-solut samaan aikaan. TUNEL värjäys suoritettiin ja tunnistettiin Guava® TUNEL Kit. Numerot kuvattu prosenttiosuus Tunel-positiivisten solujen. E, solut joko jätettiin hoitamatta tai käsitellä, kuten edellä on kuvattu D. Tällä määritettynä ajankohtana, solut värjättiin anneksiini V /PI-väriainetta. Analyysit suoritettiin 5000 solua kussakin polku. F, HeLa-soluja käsiteltiin kohonneet pitoisuudet apigeniini tai paklitakselin vastaavasti, tai molemmat niistä 24 tuntia. Sitten solulysaatit altistettiin Western blot määrittää proteiinin tason kaspaasi-3 ja PARP. V edustaa ajoneuvo (dimetyylisulfoksidi). * P 0,05 verrattuna käsittelemättömän ryhmän; ** P 0,01 verrattuna käsittelemättömän ryhmän.

On raportoitu, että sekä paklitakseli [31], [32] ja apigeniiniä [21] voi aiheuttaa solujen apoptoosin. Me seuraavaksi tarkistaa, onko yhdistelmä käyttö apigeniiniä ja paklitakselin voisi aiheuttaa enemmän akuutteja apoptoosin HeLa-soluissa. Verrattuna potilailla, joita hoidettiin apigeniiniä tai paklitakselia yksinään, apigeniiniä ja paklitakseli co hoidetuissa ryhmissä osoitti enemmän TUNEL positiivista värjäytymistä soluissa. Määrien TUNEL positiivista värjäytymistä solut huomattavasti nousi 17,95% vuonna paclitacel hoidetussa ryhmässä ja 19.65% apigeniini hoidetussa ryhmässä noin 40% ryhmissä käsitellään niiden yhdistelmään (Fig. 1 D). Määrällisesti apoptoosin FACS-analyysi suoritettiin sen jälkeen, kun värjäämällä solut FITC-anneksiini-V plus propidiumjodidi (PI). Data on esitetty kuviossa. 1E osoitti, että määrä eloonjääneiden solujen väheni vähitellen jälkeen yhteistyössä hoidon apigeniiniä ja paklitakselin ja vain alle 60% oli selvisi 24 tunnin kuluttua apigeniiniä ja paklitakselihoidolla.

Koska kaspaasien aktivaatio on tärkeä syy apoptoosin olemme lisäksi havainneet pilkkoutuminen kaspaasi-3 ja PARP western blot -analyysiä käyttämällä. Kuten on esitetty kuviossa. 1F, sekä pilkkoutuminen kaspaasi-3 ja PARP merkittävästi parantaa apigeniiniä /paklitakseli co-hoitoa verrattuna apigeniiniä tai paklitakselihoidolla yksinään. Nämä tulokset vahvistivat, että apigeniini /paklitakseli co-hoito indusoi merkittävän apoptoottisen kuoleman HeLa-solujen viittaa siihen, että yhdistelmä käyttö apigeniini ja paklitakselin tuottaisi paremman kasvainten vastaisen vaikutuksen kuin käyttö apigeniini tai paklitakselia yksinään.

ROS tuotettu by apigeniini on välttämätöntä apigeniini /paklitakseli-indusoidun HeLa-solujen apoptoosin

Samalla flavonoideja, mukaan lukien apigeniini laajalti tunnustettu antioksidantteja, niiden pro-hapetin ominaisuudet, on myös raportoitu [33]. Me spekuloitu anticancer vaikutuksia yhdistelmä apigeniiniä /paklitakseli saattaa liittyä tuotanto ROS HeLa-soluissa aiheuttamien apigeniiniä. Siksi havaittiin tasoa HeLa-soluissa, joita käsiteltiin kanssa apigeniini, paklitakselin tai molemmat niistä. Kaksi ROS-erityisiä väriaineita, DHE ja CM-H

2DCFDA näkyy superoksidi lajien ja H

2O

2 kohdesoluissa vastaavasti [24]. CM-H

2DCFDA pääasiassa hapetetaan vety- peroksidien (H

2O

2) ja hydroksyyli radikaali, DHE hapetetaan superoksidianionien (O

2

-). HeLa-solut värjättiin DHE ja CM-H

2DCFDA seuraa virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 2, DHE-erityisiä ROS kasvoi (Fig. 2A), kun taas CM-H

2DCFDA erityisiä ROS pienentää (Fig. 2B) HeLa-soluissa käsitelty apigeniiniä sisällä 30 minuuttia. Mitään muutosta ei havaittu soluissa, joita käsiteltiin paklitakselia yksinään. Samanlainen suuntaus ja merkittävämpi muutos ROS aseman havaittiin niissä soluissa, joita käsiteltiin yhdistelmällä apigeniiniä ja paklitakselin verrattuna soluihin hoidettiin apigeniiniä yksinään (Fig. 2). DHE värjäytyminen havaittiin näissä kokeissa johtui hapettumiselta superoksidi lajeja viittaa siihen, että apigeniini lisääntynyt superoksidi lajia, jotka liittyvät ROS HeLa-soluissa.

A, HeLa-soluja käsiteltiin apigeniini (15 uM) yksin tai yhdessä paklitakselin (4 nM), ja osoitti aikoja. DHE (5 uM) lisättiin soluviljelmiin 30 minuuttia ennen käsittelyä. DHE värjäys soluissa havaittiin ja analysoitiin Guava EasyCyte ™ System. DHE värjäytyminen käsittelemättömiä soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. B, CM-H

2DCFDA (5 uM) värjäys suoritettiin ja analysoitiin, kuten on kuvattu julkaisussa A.

Seuraavaksi arvioidaan, onko apigeniini /paklitakseli-indusoitua apoptoosia oli riippuvainen ROS kertymistä. N-asetyyli-L-kysteiini (NAC), joka on hyvin hyväksytty ROS scavenger, on käytetty antagonisoinut ROS. Esikäsittely HeLa-solujen kanssa 100 uM NAC ehkäistä tehokkaasti tuottaa superoksidin lajien (Fig. 3A) ja merkittävästi inhiboi solun indusoiman apoptoosin apigeniini ja paklitakseli co-hoitoa (Fig. 3B). Edellä tiedot osoittivat, että ROS olivat oleellisia apigeniini /paklitakseli-indusoidun HeLa-solujen apoptoosin.

Tämän jälkeen solut kerättiin ja havaita guava EasyCyte ™ System, kuten on kuvattu kuviossa. 2A. B, HeLa-soluja käsiteltiin NAC (100 uM) 2 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin apigeniini (15 uM) ja paklitakselin (4 nM), 24 tunnin ajan. Apoptoosia mitattiin TUNEL-määritys, kuten on kuvattu kuviossa. 1.

Apigenin indusoi ROS kertymistä kautta tukahduttaa toiminnan SOD

Havaitsimme, että kun HeLa-soluja käsiteltiin apigeniiniä, runsaasti superoksidi lajien kasvoi taas H

2O

2 väheni. Ottaen huomioon SOD oli soluentsyymin joka voi muuntaa superoksidi H

2O

2, me arveltu, että apigeniiniä saattaa vähentää aktiivisuutta SOD heikennetään kertyminen superoksidi lajeja. Sitten tutkittiin vaikutusta apigeniini proteiinin tasolla sekä entsyymin aktiivisuutta SOD. Merkittävä poistaminen sekä CuZnSOD (SOD1) ja MnSOD (SOD2) aktiivisuus havaittiin HeLa-soluissa 30 minuutin jälkeen, apigeniini tai apigeniini /paklitakseli, mutta ei paklitakselihoidolla (Fig. 4A). Kuitenkin, ei havaittu selvää muutosta havaittu proteiinin taso CuZnSOD ja MnSOD jälkeen apigeniiniä annon (Fig. 4B). Näin ollen se oli todistusvoimaa, että apigeniini tukahdutetaan SOD toimintaa ja siten indusoi kertyminen ROS.

A, HeLa-soluja käsiteltiin apigeniini (15 uM), paklitakseli (4 nM), tai molemmat niistä 30 minuuttia . SOD aktiivisuus mitattiin Cayman SOD havaitseminen pakki. Koe itsenäisesti toistettiin kolme kertaa ja tiedot esitetty keskiarvo ± S.D. * P 0,05 verrattuna kontrolliryhmään; ** P 0,01 verrattuna kontrolliryhmään. B, HeLa-soluja käsiteltiin apigeniini (15 uM) ja paklitakselin (4 nM) 30 minuutin ajan. Solulysaatit altistettiin Western-blot proteiini tasojen määrittämiseksi SOD1 ja SOD2. C, HeLa-soluja käsiteltiin apigeniini (15 uM) 30 minuutin ajan ja hajotettiin sonikoimalla. Solulysaatteja inkuboitiin sitten CuCl

2 (8 uM), ZnCI

2 (8 uM) ja MnCl

2 (8 pM) 30 minuuttia jäillä. SOD-aktiivisuus mitattiin ja analysoitiin, kuten on kuvattu julkaisussa A. D, HeLa-solut hajotettiin sonikoimalla ja solulysaateista inkuboitiin sitten edellä mainittujen metalli-ionien kanssa 30 minuuttia jäillä. SOD-aktiivisuus mitattiin kuten edellä on mainittu. * P 0,05 verrattuna apigeniiniä saaneiden ryhmässä; ** P 0,01 verrattuna apigeniiniä saaneessa ryhmässä.

Kuten edellä tulokset osoittivat, että apigeniiniä tukahdutetaan SOD aktiivisuuden, ja se oli ilmoitettu, että apigeniiniä voisivat muodostaa stabiileja kompleksinmuodostus metalli-ionien

in vitro

[34], me näin määritettyjen jos apigeniiniä voisivat muodostaa kompleksinmuodostus metalli-ionien ja tukahduttaa SOD aktiivisuuden ehkäisemällä SOD koota sen kofaktoreita. HeLa-soluja käsiteltiin 15 uM apigeniini 30 minuuttia ja lysaatit soluista, inkuboitiin 8 uM ZnCI

2 (aq), CuCI

2 (aq) tai MnCl

2 (aq) vastaavasti jäillä vielä 30 minuuttia. Aktiivisuus SOD mitattiin käyttämällä Cayman superoksididismutaasi Assay Kit kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Kuten odotettua, apigeniiniä merkittävästi tukahdutti toimintaa sekä CuZnSOD ja MnSOD, mutta toiminta CuZnSOD lisääntyi jälkeen Cu

2+, Zn

2+, ja Mn

2+ altistumisen ja aktiivisuus MnSOD myös lisääntynyt selvästi kun Mn

2+ altistus (Fig. 4C). Lisäksi mitään merkittävää muutosta SOD aktiivisuuden havaittiin, kun solujen lysaatit suoraan altistuneet Cu

2+, Zn

2 + tai Mn

2+ ilman apigeniiniä hoitoa (Fig. 4D), mikä osoittaa, että nämä metalli ioneja ei tehostanut pohjapinta SOD activity.These tulokset viittasivat siihen, että apigeniiniä tukahdutti SOD aktiivisuuden todennäköisesti läpi muodostamaan stabiilin kompleksinmuodostus näiden metallien soluissa [34], ja apigeniiniä saattaa olla korkeampi sitoutumisaffiniteetti Mn

2+.

SOD toiminnan vähentämistä on kriittinen apigeniini /paklitakseli-indusoitua apoptoosia

Apigenin inhiboi SOD ja yhdistelmä apigeniini /paklitakseli oli tehokkaampi apoptoosin syöpäsolujen kuin kukin niistä yksin. Sen varmistamiseksi, että apigeniini-indusoitu lasku toiminta-SOD oli kriittinen apoptoosin laukaisee apigeniini /paklitakseli co-hoidon, havaitsimme paklitakselin indusoiman apoptoosin, kun esto-SOD-entsyymin aktiivisuutta. DETC (diethylthiocarbamate), hyvin hyväksytty estäjä sekä CuZnSOD ja MnSOD sovellettiin tämänhetkiseen tutkimuksessa [35]. Samanlaisena kuin apigeniiniä, DETC tukahdutti aktiivisuutta SOD ja tehostetun paklitakseli indusoi apoptoosin samoin (Fig. 5A). Nämä tiedot viittasivat vahvasti siihen, että vähentäminen SOD-aktiivisuuden apigeniini on kriittinen parantamiseksi paklitakselin indusoiman apoptoosin.

A, HeLa-soluja inkuboitiin apigeniini (15 uM) /paklitakseli (4 nM), tai paklitakselia ( 4 nM) yhdessä tai ilman 1 mM DETC (inhibiittori SOD) 24 tunnin ajan ja sitten solut altistettiin TUNEL-määritystä, kuten on kuvattu aikaisemmin. B, HeLa-solut esikäsiteltiin NAC (100 uM) 2 tunnin ajan, jonka jälkeen käsittely apigeniini (15 uM) ja paklitakselin (4 nM), 24 tunnin ajan. Pilkkominen kaspaasi-2 havaittiin Western-blot-analyysi, jossa valvonta β-aktiini. C, HeLa-solut esikäsiteltiin z-VDVAD-fmk (25 gM), joka on spesifinen estäjä kaspaasi-2, ja sitten käsiteltiin apigeniini (15 uM) ja paklitakselin (4 nM), 24 tunnin ajan. Proteiini tasot pilkotun PARP ja prokaspaasi-3 havaittiin Western-blot-analyysi. D, HeLa-solut esikäsiteltiin z-VDVAD-fmk (25 uM) 30 minuutin ajan ja sitten käsiteltiin apigeniini (15 uM) ja paklitakselin (4 nM) 8 tuntia. Sitten solut otettiin talteen ja mitokondrion kalvon potentiaali havaita käyttämällä guava EasyCyte ™ MitoPotential Kit ja analysoitiin guava EasyCyte ™ System. MMP oli näkyi lasken depolarisoituneiden soluja. Koe itsenäisesti toistettiin kolme kertaa ja tietoja näytetään keskimääräisenä ± SD. ** P 0,01 verrattuna käsittelemättömän ryhmän. E, HeLa-soluja inkuboitiin apigeniini (15 uM) ja paklitakselin (4 nM), 24 tunnin ajan, ja sitten solut altistettiin RT-PCR-analyysillä. GAPDH mRNA: ta käytettiin talon maalivahdin geenin.

kaspaasi-2 on tärkeää apigeniini /paklitakseli-laukeaa HeLa-solujen apoptoosin

Mitokondrioiden reitti on tärkeä rooli ROS laukaista apoptoosin [36], [37] ja kaspaasi-2 on pidetty apikaalisella kaspaasi mitokondrion kuoleman signaalin vahvistus silmukka [38], [39]. ROS-indusoidun kaspaasi-2 lohkominen ja palautteen monistumisen apoptoottisen signaalin on myös tutkittu [40]. Vaikutuksen tutkimiseksi apigeniini mitokondrion reitti apoptoosin, kaspaasi-2 prekursori lohkaisu havaittiin apigeniini-käsiteltyjen HeLa-solujen western-blot-analyysi. Co-hoito HeLa-solujen kanssa apigeniiniä ja paklitakselilla oli hyvin alhainen kaspaasi 2 esiaste. Kun HeLa-soluja esikäsiteltiin NAC, kaspaasin 2 esiaste tason talteen (kuvio. 5B). Kaspaasin 2-estäjä Z-VDVAD-fmk vähensi pilkkominen kaspaasi-3 ja PARP HeLa-soluissa käsitelty apigeniiniä yhdistettynä paklitakseliin (Fig. 5C). MMP voi olla syy tapahtuma saostamalla apoptoosin. Tiedot on esitetty. 5D osoittivat, että apigeniiniä mutta ei paklitakseli indusoi kasvua Depolarisaatio MMP viittaa tärkeydestä apigeniiniä in apigeniiniä /paklitakseli indusoi syöpäsolun apoptoosin. Kuten odotettua, z-VDVAD-fmk esti kasvua MMP vuonna apigeniiniä ja apigeniiniä /paklitakselia testiryhmään (Fig. 5D). Kuva. 5E osoitti, että hoito apigeniiniä, paklitakseliin tai apigeniiniä /paklitakselia ei muuttanut mRNA-tasolla kaspaasin 2 osoittaa apigeniiniä /paklitakseli co-hoito kasvoi vain kaspaasi-2.

Vahvista tärkeyden caspase- 2 in apigeniiniä /paklitakseli-laukaisi mitokondrion kalvon läpäiseväksi ja apoptoosin, teemme kaspaasi-2 yli-ilmentyminen ja knock-down kokeiluja ja mitataan AIF, Endo G ja sytokromi c päästämällä mitokondrioissa HeLa-soluissa. Yli-ilmentyminen kaspaasin 2 tehostaa merkittävästi apigeniiniä tai apigeniiniä /paklitakselia aiheuttama lisäys AIF, Endo G ja sytokromi c: in sytoplasmaan murto ja lasku AIF, Endo G ja sytokromi c: in mitokondriofraktiosta (Fig. 6A). Kuten odotettua, kaspaasi-2 knock-down johti vastakkainen apigeniiniä tai apigeniiniä /paklitakselia aiheuttamiin muutoksiin AIF, Endo G ja sytokromi c HeLa-soluissa (kuvio. 6A). Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa. 6B, yli-ilmentyminen kaspaasi-2 ilmeisesti lisääntyi apigeniini /paklitakseli aiheuttaman katkaisun kaspaasi-3 ja PARP ja knock-down kaspaasi-2 esti tällaisen vaikutuksen apigeniini /paklitakseli. Seuraavaksi me havainneet solujen elinvoimaisuutta arvioimaan välittyy vaikutuksen kaspaasin 2 apigeniiniä /paklitakselia laukaisi HeLasoluista apoptoosin. Yli-ilmentyminen kaspaasin 2 aiheutti noin 10%: n lasku solujen elinvoimaisuus sekä apigeniiniä ja yhteistyössä hoitoryhmään, ja kaspaasi-2 hiljaisuus huomattavasti solujen elinvoimaisuutta.