Krooninen sairaus

tiivistelmä

kehitys luonnontuote aineiden kanssa kohdennettuja strategioita lupaava parantaa syöpähoitojen lääkeaineita on heikentynyt -associated sivuvaikutuksia. Resveratrol löytyy punaviiniä, on syövän vastaista aktiivisuutta erilaisissa kasvaintyypeissä. Olemme aiemmin ilmoitettua uuden molekyylitasolla resveratrol, etäpesäke liittyvä proteiini 1 (MTA1), joka on osa nukleosomin remodeling ja deasetylaatio (Nurd) co-repressor kompleksi, joka välittää geenien. Tunnistimme resveratrol säätelijänä MTA1 /Nurd monimutkainen ja uudelleen aktivaattori p53 asetylointi eturauhassyövässä (PCA). Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme onko resveratrolin analogit myös hallussaan kyky estää MTA1 ja kääntää p53 deasetylaatiolla. Olemme osoittaneet, että pterostilbene (PTER), löytyy mustikoita, oli suurempi kasvu MTA1 välittämän p53 asetylointi, vahvistaa ylivoimainen teho yli resveratroli kuten ravinnon epigenetic aineena. Vuonna potilaalle tehdä PCa ksenograftit, resveratroli ja PTER merkittävästi esti kasvaimen kasvua, eteneminen, paikallinen invaasio ja spontaani etäpesäkkeiden. Lisäksi MTA1-knockdown herkistyneet solut näiden aineiden tuloksena lisävähennystä syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Vähennys oli riippuvainen MTA1 signalointi osoittaa lisääntynyt p53 asetylaatio, korkeammat apoptoottinen indeksi ja vähemmän angiogeneesiä

in vivo

kaikissa ksenografteissa käsitelty yhdisteillä, ja erityisesti PTER. Kaikkiaan meidän tulokset osoittavat MTA1 olevan merkittävä eturauhasen kasvain pahanlaatuinen etenemiseen ja käytön tueksi strategioita kohdistaminen MTA1. Vahva prekliinisiä tulokset osoittavat PTER kuin voimakas, selektiivinen ja farmakologisesti turvallinen luonnontuote, joka voidaan testata pitkälle PCa.

Citation: Li K, Dias SJ, Rimando AM, Dharin S, Mizuno CS, Penman AD, et ai. (2013) pterostilbene säädökset kautta Etäpesäke liittyvä proteiini 1 tuumorikasvun, kehittyäkseen ja muodostaakseen etäpesäkkeitä eturauhassyövässä. PLoS ONE 8 (3): e57542. doi: 10,1371 /journal.pone.0057542

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 syyskuu 2012; Hyväksytty: 25 tammikuu 2013; Julkaistu: 01 maaliskuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tutkimus oli osittain tukevat Intramural Research Support Program apurahat (# 59927 ja # 68100231012) University of Mississippi Medical Center ASL. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) käsittely merkitsee edelleen lääketieteellinen tarve. Ruokavalio-johdettu polyfenolit, kuten stilbeenit, ovat houkuttelevia kliininen ehdokkaita ensisijainen ja toissijainen syöpä kemopreventiossa johtuen niiden kyvystä paitsi estää tai estävät aloittamista syövän vaan myös kääntää myynninedistämistarkoituksessa vaiheissa. Jälkimmäinen ominaisuus tekee näistä yhdisteistä lupaavia terapeuttisia aineita. Resveratrolin (Res) ja muut luonnon stilbeenien ovat Fytoaleksiineja, jotka on tuotettu laitoksissa vastauksena ympäristön stressiin [1]. Resveratrol on sydäntä, tulehdusta ja syöpää ehkäisevistä toiminta [2], [3]. Syövän vastainen toiminta resveratrolin sääntelevien useita ja monipuolinen molekyylikohteista ja välittävät solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin [4] – [8] ja angiogeneesin estäminen [9] – [13].

äskettäin havainnut, että resveratroli downregulates etäpesäke liittyvä proteiini 1 (MTA1) PCA [13]. MTA1 yliekspressio korreloi kliinis parametrit, jotka luonnehtivat kasvaimen aggressiivisuus: imusolmuke etäpesäke, korkea kasvain arvosanoja, ja angiogeneesi erilaisissa syövissä [14] – [19]. Ihmisen eturauhasen kudoksissa, korkean MTA1 taso liittyi hormoni tulenkestävät PCa [15]. Me tunnistettiin aluksi MTA1 uutena osallistuja ”noidankehä” Eturauhassyövän luumetastaasin, ja osoitti lisäksi, että värjäytymisen intensiteetti ja ydinvoiman lokalisoinnin MTA1 ihmisen kudoksissa korreloivat aggressiivisuus Eturauhassyövän ja luuston etäpesäkeleesioita [19]. Olemme myös, että MTA1 oli pro-eloonjääminen, anti-apoptoottiset, invasiivisia ja angiogeneesiä ominaisuudet PCA

in vitro

ja

in vivo

[19].

MTA1 on osa nukleosomin remodeling ja deasetylaatiolla (Nurd) co-repressori monimutkainen mukana histoni ja ei-histoni proteiinin deasetylointi ja geenispesifiseen transkription säätelyyn [20], [21]. Kokonaisuuteen sisältyy histonideasetylaaseja 1 ja 2 (HDAC1 ja 2). Osoitimme aikaisemmin, että resveratroli aiheuttama MTA1 hajoamista destabilizes MTA1 /HDAC /Nurd deasetylaatio monimutkainen, mikä lisää asetylaatio /aktivointi kasvaimen p53 PCA-soluissa [13]. MTA1 hiljentäminen kautta RNAi merkittävästi herkistyneet PCA solut resveratrol riippuvaista p53 asetylointi ja apoptoosin. Tämä HDAC estäjä kaltainen aktiivisuus resveratrolin tuki vielä yhdistelmällä kokeiluja kliinisesti hyväksytty HDAC estäjä suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA), jossa resveratrol synergistisesti p53-asetylointi ja apoptoosin [13]. Olemme myös osoittaneet, että MTA1 pudotus solut olivat tukahdutetaan hyökkäyksen ja angiogeeninen aktiivisuus

in vitro

, ja viivästynyt kasvaimen muodostumisen ja kehityksen ihonalainen ksenografteissa [19]. Yhdessä määrittelimme uusi epigeneettiset mekanismi syövän vastaista aktiivisuutta resveratrolin välittyvä negatiivinen epigeneettiset säädin, MTA1.

Huolimatta lupaavia ominaisuuksia, resveratrol nopea aineenvaihdunta ja alhainen hyötyosuus estänyt sen etenemistä kliiniseen käyttöön [2] , [22] – [24]. Rajoitukset resveratrolin ovat saaneet kiinnostusta luonnon- ja synteettiset analogit kanssa parantunut farmakokinetiikka ja erinomainen farmakologinen teho, jotka pitävät enemmän mahdollisuuksia syöpää luonnontuote lääkkeitä [25]. Kuitenkin miten resveratrolin analogeja vertailla keskenään suhteen tehon ja vaikutusmekanismeja ei juuri tunneta.

in vivo

vaikutukset ovat pääasiassa tutkimaton varten resveratroli analogeja, mikä vaikeuttaa valita, mitkä analogiset (s) on paras kliinisen kehityksen.

Nykyisessä tutkimuksessa, toteutimme vertaileva analyysi resveratrolin ja kuusi analogit niiden kyky estää MTA1 ilmaisun ja signalointi, ja keskittyi MTA1 välittämän syövän vastaisia ​​ja etäpesäkkeiden vaikutukset voimakkaimmista analoginen, PTER käyttäen potilaalle tehdä PCa ksenograftit. Tuloksemme osoittavat MTA1 voimakas tavoite väliintuloa ruokavalion PTER hoitavina luonnontuote lääkkeen syöpähoidolla ala- ja metastaattisen PCa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kaikki eläin työ tehtiin mukaisesti hyväksytty eläin protokollan # 1272 Institutional animal Care ja käyttö komitea University of Mississippi Medical Center ja akkreditoitu Association for arviointi ja akkreditointi Lab animal Care International noudattaen US Public Health Service politiikka turvattuihin toimiston laboratorion Animal Welfare.

Materiaalit

resveratrolin ja piceatannol (PIC) saatiin kaupallisista lähteistä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ja Calbiochem-Novabiochem Corp. , San Diego, CA, vastaavasti). Pterostilbene syntetisoitiin seuraamalla julkaistuja menetelmiä [26] trimetoksi-resveratrolin (3M-Res) ja (

E

) -4- (3,5-dimetoksistyryyli) aniliinia (DMSA) syntetisoitiin edellä kuvatulla menetelmillä [27 ]. Triasetyyli-resveratrolin (3ac-Res) ja 3,5-diasetyyli resveratrolin (2AC-Res) syntetisoitiin seuraavasti: 18 mg resveratrol liuotetaan 500 ul: aan MeOH: a, 10 tippaa pyridiiniä ja 500 ui etikkahappoanhydridiä lisättiin. Seosta sekoitettiin yön yli huoneenlämpötilassa. Etyyliasetaattia (EtOAc) lisättiin reaktioseokseen, minkä jälkeen se jaettiin veden pyridiinin poistamiseksi. EtOAc-kerros väkevöitiin stream typpi- ja kirjavia on ohutkerroskromatografiassa levy. Levy kehitettiin käyttäen liuotinjärjestelmää 30% EtOAc: 70% heksaani. Siteet 3AC-Res (Rf 0,8) ja 2AC-Res (Rf 0,6) raaputettiin levyltä ja uutettiin EtOAc: llä. Rakenteet 3AC-Res ja 2AC-Res määritettiin ydinmagneettisen resonanssin ja massaspektrometrian. Rakenteet kaikkien muiden stilbeenien on myös vahvistanut spektroskopialla. Puhtaus yhdisteiden määritettiin olevan 99%. Yhdisteet liuotettiin korkealla puhtaudella etanoliin tai DMSO: hon ja säilytetään pimeässä -20 ° C: ssa ennen käyttöä määrityksissä.

Cell Culture

LNCaP ja DU145 PCa-solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). PC3M solut olivat lahjoitus tri R. Bergan (Northwestern University, Chicago, IL) [28], [29], ja RWPE-1, ”normaali” kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen oli lahja Dr. C. Lee ( Northwestern University, Chicago, IL) [30]. Eturauhassyövän soluja kasvatettiin RPMI-1640, joka sisälsi 10% FBS: ää, 5% penisilliini /streptomysiiniä, kuten aiemmin on kuvattu [13], [19]. RWPE-1-soluja kasvatettiin ATCC täydellistä kasvualustaa, joka sisältää emästä keratinosyyttien seerumittomassa väliaineessa, jota oli täydennetty naudan aivolisäkeuutetta ja ihmisen rekombinanttia epidermaalista kasvutekijää. Soluja pidettiin inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2. Media korvattiin fenolipunaista RPMI-1640 5% hiilellä erotettua seerumia 16-18 tuntia ennen resveratrol /analogeja hoitomuotojen steroidi-free pohjalla.

Western blot -analyysi

Western blot-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [13], [19]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla resveratrolin tai analogit, 24 tunnin ajan. Solut pestiin kylmällä PBS: llä, ja hajotettiin RIPA lyysi- ja uuttopuskuria, joka sisälsi Halt fosfataasi ja Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific). Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssia (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Yhtä suuret määrät proteiinia (40-70 ug) ratkaistiin 7-10% Tris-TGX Ready geelit ja siirrettiin PVDF-kalvolle Mini Trans-Blot Elektroforeesilaitteet siirtojärjestelmä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Sitten membraanit blokattiin TBS-Tween ja 5% kuivamaitoa 2 tuntia huoneen lämpötilassa ja tutkittiin MTA1, AR, p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai Ac-p53 (K381) (Abcam) vasta-aineita. Jälkeen blotit tutkittiin β-aktiini-vasta-aineilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), kuten latauskontrollina. Signaalit visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin. Densitometria tehtiin käyttäen Image J. Efektiivinen annos (ED

50) arvot laskettiin Chou-Martin-menetelmällä CompuSyn varten lääkkeen yhdistelmät ja General Dose-Effect Analysis ohjelmisto (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ).

Generation of Stable Cells tagi Luciferase

MTA1-knockdown DU145 solut aiemmin vahvistettu käyttämällä Expression pidätys GIPZ lentiviral shRNAmir ilmentävät MTA1shRNA tai ei-äänenvaimennusjärjestelmien tyhjän vektorin (EV, Open Biosystems) ja olivat tunnettu

in vitro

ja

in vivo

[13], [19]. Vektorit sisälsivät vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) ja puromysiiniresistenssigeenin. Vaikka solut osoittivat korkean GFP signaaleja

in vitro

,

in vivo

kokeet epäonnistuivat johtuen korkeasta tausta signaaleja eläimen kudoksista. Kuten bioluminesenssi on korkea signaali-kohina verrattuna fluoresenssiin, me transdusoidut solut lentiviruksen lusiferaasin (Luc) rakentaa (lahja tri R. Graeser, Lääketieteellisen Oncology, Freiburg, Saksa) ja valitaan stabiileja klooneja käyttäen puromysiinissä. Klonaalisia populaatioita soluja laajennettiin

in vitro

ja testataan niiden lusiferaasiaktiivisuudet (katso alla). Useita kirkas klooneja toistuvasti valittu uudelleen ja keskittää yhteen solujen korkea lusiferaasiekspressio käytettäväksi

in vivo.

In vitro

ja

in vivo

Bioluminescent Imaging

in vitro

ja

in vivo

bioluminenssina (BL) suoritettiin käyttäen IVIS spektri (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Kuvia ja havaitseminen BL signaaleja hankittiin ja analysoitiin käyttäen Living Image Software V. 4.1. Sillä

in vitro

kuvantaminen, solujen koodattu lusiferaasin laimennettiin sarjoittain musta, kirkas pohja 96-kuoppalevylle (Costar, Corning, NY). D-lusiferiinin (150 ug /ml) lisättiin kuoppiin, levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 10 minuuttia, jonka jälkeen kuvat on otettu. Sillä

in vivo

BL kuvantaminen, nukutettu hiiriin ruiskutettiin intraperitoneaalisesti (i.p.) 150 mg /kg D-lusiferiini (Etu) ja sijoitettu kamera laatikkoon 10 min. Jatkuva altistuminen 2% isofluraania jatkuvaa sedaatiota kuvantamisen aikana. Hakuaika oli yleensä enintään 3 min automaattinen valotus riippuen BL kasvaimia. Mittaukset lähetetyn valon suoritettiin kiinnostavat alueet (ROI) ja määrällisesti kuin fotonivuon (fotonit /sec /cm 2 /sr). Normalisointi tehtiin kaikkien kuvien lopussa kokeen. Harmaasävykuvien hiiriä kerättiin myös jokaisessa istunnossa. Metastaasin havaitsemiseksi kokeen aikana oli saastuttamaa voimakas ensisijainen signaali johtaa väärien positiivisten signaalien. Näin ollen lopussa kokeilussa yksinäinen ensisijainen signaalin leikkaamalla eturauhasen ja ympäröivän lihaskudoksen paljastaa elinten vatsaonteloon. Munuaiset, maksa ja keuhko /heart kustakin hiirestä eristettiin ja

ex vivo

kuvantaa lisäämällä laatikointi ja F /stop.

Orthotopic PCa ksenoqraftit

Seitsemän viikon ikäisiä nude-hiiriä (Fox n1nu, Harlan) syötettiin phytoestrogen vapaa AIN-76A ruokavalio päivästä vastaanotettu. Eläimet jaettiin sattumanvaraisesti kahteen pääryhmään ennen leikkausta ja sen jälkeen injektoitiin joko DU145-EV-Luc (EV) tai DU145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) soluja. Leikkauksen aikana hiiret nukutettiin 2% isofluraani, joka on 7-9 mm vatsan keskiviivan viilto tehtiin, ja eturauhasen paljastui. 2.5 x 10

6 solua kunkin solulinjan, 20 pl PBS: ää ja Matrigel, injektoitiin anteriorisen eturauhanen. Haava ommeltiin, ja iho suljettiin autoclips. Eläimiä seurataan tarkasti leikkauksen jälkeen ja leikkeet poistettiin 10. päivänä Kasvaimet asuttaneet ja kasvoi 14 päivää. Hiiret, kehittyi kasvaimia kussakin ryhmässä satunnaistettiin kolmeen alaryhmään (n = 6), jossa päivittäin i.p. anto 10% DMSO huijausta ohjaus (Ctrl); 50 mg /kg resveratrolia tai PTER. Molemmat yhdisteet olivat liukoisia 10% DMSO kun lämmennyt avulla vesihauteessa. Joka viikko tuoreet liuokset valmistettiin injektioita varten. Kehon painot ja BL signaaleja seurattiin viikoittain. Hiiret tapettiin viikolla 8 soluinokulaation jälkeen. Ruumiinavauksessa, prostates ja muut elimet irrotettiin,

ex vivo

kuvaamisen ja kiinnitettiin 10% neutraaliksi puskuroidulla formaliinilla (Richard Allan Scientific, Kalamazoo, MI). Seerumi kerättiin myös ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

histopatologia ja immunohistokemia

neljä uM: n paksuisia leikkeitä valmistettiin formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin kasvaimia ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H W DB-5 kapillaarikolonnia (0,25 mm sisähalkaisija, 0,25 um kalvon paksuus, 30 mm pitkä; Agilent Technologies , Foster City, CA). GC Lämpötila Ohjelma oli: alustava 190 ° C pidettiin 1 min, nostettiin 244 ° C nopeudella 30 ° C /min ja pidettiin tässä lämpötilassa 0,5 minuutin ajan, nostettiin 246 ° C nopeudella 0,5 ° C /min ja pidettiin 0,5 minuutin ajan, nostettiin 280 ° C nopeudella 20 ° C /min ja pidettiin 2 minuuttia, sitten lopulta nostaa 300 ° C nopeudella 30 ° C /min ja pidettiin 0,8 minuuttia. Kantokaasu oli ultrahigh puhtaus helium, 1 ml /min virtausnopeudella. Ruiskutusaukon pidettiin 250 ° C: ssa, GC-MS-liitäntä 230 ° C: ssa, ja ionisointikammio 230 ° C: ssa. Tilavuus injektio oli 2 ui (splitless injektio). Massaspektri hankittiin valituilla ioni-seuranta -tilassa, elektronitörmäyksellä 70 eV. Pterostilbene seurattiin m /z 328, 313 ja 297 (retentioaika 11,6 min). Resveratrol seurattiin m /z 444, 428 ja 414 (retentioaika 13,7 min). Kvantifiointi suoritettiin käyttämällä ulkoisia standardeja kaupallisen näytteen resveratrolin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ja synteettinen näyte PTER [31].

Tilastollinen analysointi

Arvot ilmaistaan keskiarvona ± SE tai rasiakuvaajien mittausten. Opiskelijan yksisuuntainen pariksi t-testiä käytettiin analysoitaessa

in vitro

tietoja. Erot kasvain BL voimakkuus

in vivo

analysoitiin joko sijoitus-pohjainen tai kaksisuuntainen ANOVA seurasi Bonferroni post hoc analyysi tai Kruskal-Wallisin testiä. Joillekin analyysi data-arvoja log-muunnettiin. Erot katsottiin merkitsevä p 0,05.

Tulokset

pterostilbene on voimakas estäjä MTA1 Expression PCA Solut

Havaitsimme äskettäin, että resveratroli inhiboi epigeneettiset muokkaaja MTA1 , joka lopulta johtaa lisääntyneeseen p53 asetylaatio ja apoptoosin PCa soluihin [13]. Tässä testasimme kuusi resveratrolin vastineita (Fig. 1) onko heillä olisi paremmat syövän vastaista aktiivisuutta estämällä tätä erityistä molekyylikohteena. Analogien, PTER, piceatannol (PIC) ja trimetoksi-resveratrolin (3M-Res) ovat luonnossa esiintyviä taas dimethoxystyrylaniline (DMSA), diacetylstilbene (2AC-Res) ja triacetylstilbene (3AC-Res) ovat synteettisiä johdannaisia. Tutkimme näiden vaikutukset analogien on MTA1 ilmentymistä kolmessa PCa solulinjoissa, jotka edustavat eri vaiheissa PCa etenemistä. Solut ilmentävät MTA1 eri tasoilla, kohtalaisen korkea androgeeniresponsiivinen LNCaP ja androgeenin kestävä DU145 hyvin korkeiksi metastaattisessa PC3M soluissa (kuvio. 2A). Käsittelimme soluja erilaisilla annoksilla (5-100 uM) resveratrolin /analogien 24 tunnin ja eristetty proteiini Länsi-blotit. Oli alas-säätely MTA1 ilmentymisen yhdisteellä käsiteltyjen verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen (Fig. 2). Resveratroli ja tätä analogit inhiboivat MTA1 proteiinin tasojen annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta eri tehot. MTA1-inhibitio analogit oli solu-spesifinen: kun estävää vaikutusta PTER oli verrattavissa resveratrolin LNCaP-soluissa (kuvio. 2B), ja DU145-soluissa, 3AC-Res, PIC ja PTER olivat tehokkaampia kuin resveratroli, mutta vain PTER oli ED

50 arvo matalan mikromolaarisella alueella (13,9 uM) (Fig. 2C). Vuonna PC3M soluissa, 3M-Res ja PTER osoittaneet korkeampi teho kuin resveratrol, ja jälleen kerran, PTER oli alhaisin ED

50-arvo (41,6 uM; Fig. 2D). Näin ollen kuudesta analogit testattiin, PTER osoitti tehokkain MTA1-inhibitio kaikilla kolmella solulinjoissa. Pterostilbene alun perin eristettiin santelipuu ja myöhemmin löydettiin viinirypäleet ja mustikat [31], [32]. Kuten resveratroli, PTER on voimakas antioksidantti ja tulehdusta aine chemopreventive ja syövän vastaista aktiivisuutta [33] – [42]. Vuonna DU145 soluissa, PTER, osoitti suurinta MTA1-inhibitiotehoa (yli seitsemän kertaa suurempi kuin resveratroli). Tärkeää on, PTER osoitti suurempaa kasvua MTA1 välittämän p53 asetylointi, etenkin MTA1-taintumisen herkistyneet solut (Fig. 3), mikä ylivoimainen teho yli resveratroli ruokavalion epigeneettisellä agentti, joka valvoo posttranslational muutoksia proteiinien.

resveratrolin ( Res),

trans

-3,5,4′-trihydroksistilbeeni; Pterostilbene (PTER),

trans

-3,5-dimethoxystilbene; Trimetoksi-resveratrolin (3M-Res),

trans

-3,5,4′-trimethoxystilbene; Piceatannol (PIC),

trans

-3,5,3’4′-tetrahydroksistilbeenin; Dimethoxystyrylaniline (DMSA),

trans

-4- (3,5-dimetoksistyryyli) aniliini; Diasetyyli-resveratrolin (2AC-Res),

trans

-3,5-diacetylstilbene; Triasetyyli-resveratrolin (3AC-Res),

trans

-3,5,4′-triacetylstilbene.

. Solulinjat edustavat eri vaiheissa PCa etenemistä: RWPE-1, ”normaali” kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolut; LNCaP, androgeenien reagoiva soluissa; DU145, androgeeni-resistenttien solujen; PC3M, aggressiivinen metastaattisen soluja. Soluja kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja antibiootteja. 75 ug proteiinia erotettiin 10% geeliä, siirrettiin kalvolle ja tutkittiin MTA1 vasta-aineita. β-aktiini oli latauskontrollina. Pterostilbene on korkein teho estämisessä MTA1. B. Annoksesta riippuva vaikutus Res /analogien annetun MTA1 proteiinin tasot LNCaP; in DU145 (C) ja PC3M (D) soluja. (I) soluja käsiteltiin 5-100 uM Res /analogien 24 tunnin ajan ja analysoitiin immunoblottauksella. (Ii) graafinen esitys tuloksista. Ctrl on asetettu 1 ja MTA1 tason muutokset ilmaistaan ​​prosentteina Ctrl. Keinot ± SE neljästä itsenäisestä kokeesta on esitetty. • p 0,05, # p 0,01, * p 0,001. (Iii) tehokkaan annoksen (ED

50) laskettiin Chou-Martin-menetelmällä.

DU145-EV ja DU145-MTA1shRNA solut (Fig. S1) käsiteltiin 50 uM Res tai PTER 24 tuntia ja analysoitiin MTA1, p53, Ac-p53 Western blot kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. Edustava blot näytetään. Kvantitointi Ac-p53 /p53-suhde suoritettiin Image J ohjelmisto ja data näytetään keskimääräisenä ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Vaikutukset resveratrolin ja pterostilbene päälle Orthotopic kasvaimen kasvun eteneminen ja Metastasis: osallistuminen of MTA1

Olemme aiemmin osoittaneet, että endogeeniset tasot MTA1 edistää kasvainten kehittymistä ihonalaisen malli Eturauhassyövän [19]. Kuitenkin rooli MTA1 PCA kasvuun, etenemiseen ja etäpesäkkeitä jää tuntemattomaksi ja vaikutukset resveratrolin ja PTER ei ole arvioitu potilaalle tehdä PCa malleissa. Vertaamaan

in vivo

tehoa resveratrol ja PTER, sekä tutkia roolia MTA1 eturauhasessa kasvaimen kasvua ja etenemiseen, me hyödyntää kliinisesti merkittäviä potilaalle tehdä hiirimallissa, jossa ihmisen PCa soluja, jotka ilmentävät tai vaimentaa MTA1 voi kasvaa ympäristössä liittyvät heidän kudosalkuperää. Tavoitteena Tämän kokeen oli kolme: 1) arvioida tehoa resveratrol ja PTER estämisessä potilaalle tehdä PCa kasvua ja etenemistä; 2) arvioida roolia MTA1 eturauhasen kasvainten kehittymiseen, etenemisen ja etäpesäkkeiden, ja 3) onko MTA1 vaikuttaa alttiuteen ensisijainen eturauhasen kasvain ja etäpesäke resveratrol ja PTER.

tarkastella MTA1 riippuva vaikutukset, hyödynsimme meidän aiemmin kuvattu ja tunnettu DU145 solujen transdusoitu lentiviruksen kirjanpitoarvoon EV ja MTA1shRNA [13], [19]. Leimasimme nämä solut lusiferaasi ja käyttänyt niitä potilaalle tehdä rokotus (Fig. 4). Ennen elinsiirtoa, validointi lusiferaasiekspressio ja MTA1 knockdown in DU145-Luc soluissa tehtiin käyttämällä bioluminesoiviin määritystä

in vitro

ja Western blot, tässä järjestyksessä (Kuva. S1). Leikkauksissa, hiiret injektoitiin eturauhanen EV-Luc ja MTA1shRNA-Luc-soluja. Vakuuttaa täsmällistä vastausta MTA1-Knockdown ja hoidon yhdisteillä, annoimme kasvaimet asuttaa ja kehittää 14 päivää ennen satunnaistamista. Kasvaimen kehitystä seurattiin BL kuvantaminen viikoittain. Hiiret, kehittyi kasvaimia (12/16 EV ryhmä ja 15/16 MTA1shRNA ryhmä) satunnaistettiin jonka kuvien koko kolmeen alaryhmään ja vehikkeliä ohjaus (10% DMSO), resveratroli tai PTER, ip, samaan 50 mg /kg /vrk. Pterostilbene annos pidettiin identtinen resveratrol n määrittämiseksi teho eroja. Vaikka ajoneuvo-käsitellyistä hiiristä osoittivat nopeasti syövän etenemisen EV ksenografteissa, resveratroli ja PTER aiheuttanut havaittavaa viivettä kasvaimen kasvua (kuviot. 4A ja B). Resveratroli, mutta enemmän PTER, osoitti kasvaimen inhiboivia vaikutuksia, vaikka tilastollista merkitsevyyttä ei saavutettu, koska pieni määrä hiiriä. -Ksenoqraftit ilmentävät MTA1shRNA osoittivat merkittävästi pienentää kasvaimen kasvua viikolla 5 elinsiirron kanssa marginaalinen merkitys vs. EV-Ctrl (p = 0,05). Lisäksi MTA1-pudotus käsitellyt kasvaimet yhdisteillä oli Jatkovastauksessaan ja erot verrattuna EV-Ctrl tuli erittäin merkitsevä (p = 0,001, resveratroli, p = 0,0004 varten PTER). Siksi MTA1-knockdown herkistyneet solut resveratrol ja erityisesti PTER. Yhdenmukainen voimakas antituumorivaikutuksia, resveratrol- ja PTER-käsitellyt tuumorit oli vähentynyt mitoosi aktiivisuus verrattuna vehikkelillä EV-kasvaimet, kuten on esitetty Ki-67 IHC (Fig. 5A). Tärkeää on, sopusoinnussa vähensi MTA1 aktiivisuus kasvaimissa, loppupään asetyyli-tavoite MTA1, Ac-p53, oli merkitsevästi kohonneeseen kun hoitoja, parhaiten nähdään PTER (Fig. 5B). Niinpä M30 värjäys paljasti suuren kasvun apoptoosin kasvaimia EV yhdisteellä käsiteltyjen hiirten ja MTA1-taintumisen ryhmä (Fig. 5C). Lisäksi pienten suonten alue, joka arvioidaan CD31 Immuunivärjäystä laski ~59% EV-yhdisteillä käsiteltyjen kasvainten ja -67% vuonna MTA1-Knockdown ryhmässä verrattuna EV-Ctrl (Fig. 5D).

Male nude-hiiriin injektoitiin ortotooppisesti kanssa DU145-EV-Luc (EV), tai DU145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) soluja ja käsiteltiin vehikkelillä (Ctrl), Res tai PTER, 50 mg /kg /päivä, joka päivä, ip A. Normalized edustaja BL kuvat hiirtä kustakin ryhmästä on esitetty. B,

jäljellä

, kvantitatiivinen analyysi kasvaimen valon emission kokonaismäärä Flux (fotonit /sec /cm 2 /sr) piirretään ajan funktiona. Keinot ± SE on esitetty (n = 6 alussa), * p = 0,05.

Oikea

, log trendejä kullekin ryhmälle on esitetty. Merkittävää kasvua esto havaittiin EV- vs. MTA1shRNA-kasvaimet ryhminä, ** p 0,01 ja välillä EV-Ctrl vs. MTA1shRNA-Res ja MTA1shRNA-PTER, *** p 0,001.

Vasen,

edustaja IHC kuvia A. Ki-67 (leviämisen); B. Ac-p53 /p53 (MTA1 signalointi); C. M30 (apoptoosin); ja D. CD31 (angiogeneesi) in EV- ja MTA1shRNA-kasvaimet näkyvät.

Oikea,

määrällisesti positiivisesti värjättyä solujen prosentteina koko soluja. Tiedot ovat rasiakuvaajien joukkoa satunnaisesti valittuja viisi kenttää analysoitiin itsenäisesti kaksi tutkijaa. Pairwise vertailu, * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 vs. EV-Ctrl;

# p 0,05 ja

## p 0,001 vs. MTA1shRNA-Ctrl; + P 0,05 ++ p 0,001, yhdisteiden välillä EV ja MTA1shRNA ryhmiä.

Harvat prekliinisissä PCa ksenograftimalleja edistystä etäpesäkkeiden, mikä vaikeuttaa tutkia toiminnallista merkitystä MTA1 metastaasissa. Aikaisemmat tutkimus LNCaP-Luc soluista ei osoittanut etäpesäke kun ortotooppisesti injektoidaan hiiriin (julkaisematon data). Koska aggressiivisempi fenotyyppi DU145 soluja, pohdimme mahdollisuutta spontaani etäpesäkkeiden potilaalle tehdä DU145 ksenografteissa. Alussa viikolla 7, havaitsimme BL signaalien erotuksena ensisijainen lähde (eturauhasen) laparotomiakontrolleissa EV-Ctrl ryhmä (Fig. 4A ja 6A).

Ex vivo

BL kuvia etäpesäkkeiden havaittiin ruumiinavauksessa maksassa, munuaisissa ja keuhkoissa /sydän, ja histologia vahvistettiin sertifioitu patologi (JRL) (Fig. 6B). Suurin esiintymistiheys etäpesäkkeiden havaittiin EV ryhmässä (100%), kun taas MTA1shRNA ryhmä osoitti vain 50-75% ja on suurella heterogeenisuus (Fig. 6C). Laaja macrometastases kaikissa elimissä havaittiin EV-Ctrl inhiboi resveratrol ja PTER. MTA1-pudotus kasvaimia kehittyi pienempiä etäpesäkkeitä, ja vähemmän elimissä. Erityisesti MTA1shRNA kasvaimet yhdisteitä käsitellään joko eivät kehittäneet munuais- etäpesäke tai oli pieniä vaurioita in yksi munuainen (Fig. 6D). Esto etäpesäke vastauksena MTA1-kohdentamisaineita ja MTA1 hiljentäminen osoittaa MTA1 panoksen paikalliseen invaasiota, levittämistä ja etäpesäke. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että MTA1 signalointi on keskeinen rooli kehityksen ja etenemisen metastaattisen eturauhassyövän ja että kohdistaminen MTA1 koulutusjakson ruokavalion polyfenolit voivat olla tehokkaita hidastamaan kasvainprogression ja estää etäpesäkkeiden.

. BL kuvia metastaasin näkyvät. Signaalit jälkeen havaitut eturauhas- poistamisen koostui metastaattisen ja epäspesifisten signaaleja. Poistaminen ihon ja lihasten poistaa ei-spesifisyys. B.

Top, ex vivo

kuvia metastaattisen elimiä.

Ala,

validointi etäpesäkeleesioita (T) munuaisissa (K), maksassa (Li) ja keuhko /heart (L /H) H 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 ovat pareittain vertailuissa vs. EV-Ctrl. D, kvantitatiivinen analyysi elinspesifiseen etäpesäke laskettu lusiferaasin signaalit Yhteensä Flux (fotonit /sec /cm

2 /sr). Värikoodattu histogrammit signaalien kullekin ryhmälle on esitetty. PTER oli tehokkaampi estämään etäpesäkkeiden kaikissa elimissä verrattuna Res EV-ryhmässä.