Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoite

tutkimiseksi estävä vaikutus pseudolaric happoa B ihonalainen ksenografteja ihmisen mahalaukun adenokarsinooman sekä taustalla molekyylitason mekanismeja sen monilääkeaineresistenssin.

Methods

ihmisen mahalaukun adenokarsinooman SGC7901 soluja ja lääkkeille vastustuskykyisiä SGC7901 /ADR-soluja ruiskutetaan nude-hiiriin perustaa ihonalaisen ksenograftimallissa. Vaikutukset pseudolaric happoa B kanssa tai ilman adriamysiinikäsittelylle verrattiin määrittämällä kasvaimen kokoa ja painoa. Syklo-oksigenaasi-2, proteiinin kinaseC-α: n ja P-glykoproteiinin ilmentyminen tasot määritettiin immunohistokemialla ja Western blot.

Tulokset

Pseudolaric hapon B merkittävästi tukahdutti kasvaimen kasvun aiheuttama SGC7901 solujen ja SGC7901 /ADR-soluja. Yhdistelmä pseudolaric hapon B ja perinteinen kemoterapia huumeiden adriamysiini esiintyi voimakkaampi inhiboiva vaikutus kasvuun mahasyövän in vivo kuin hoito joko pseudolaric hapon B tai adriamysiinin yksin. Proteiinin ekspressiotasot syklo-oksigenaasi-2, proteiinin kinaseC-α: n ja P-glykoproteiinin inhiboi pseudolaric happoa B yksin tai yhdessä adriamysiinin in SGC7901 /ADR-solu-ksenografteissa.

Johtopäätös

Pseudolaric happo B on merkittävä estävä vaikutus ja lisäainetta estävä vaikutus yhdessä adriamysiinin kasvuun mahasyövän in vivo, joka kääntää monilääkeaineresistenssin mahalaukun kasvain kemoterapiaa huumeiden vähen- tämisessä Cox-2 /PKC-α /P- gp /MDR1-signalointireitin.

Citation: Sun Q, Li Y (2014) estovaikutus Pseudolaric Acid B mahasyövän sekä monilääkeaineresistenssin kautta Cox-2 /PKC-α /P-gp Pathway. PLoS ONE 9 (9): e107830. doi: 10,1371 /journal.pone.0107830

Editor: Soumitro Pal, lastensairaalassa Boston Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 15, 2014; Hyväksytty: 20 elokuu 2014; Julkaistu: 24 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Sun, Li. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Science Program Foundation Shenyang Kunnan Science and Technology Bureau (1091136-9-02). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mahalaukun syöpä on yksi maailman yleisimmistä syövistä [1], ja kemoterapiaa on tärkeä strategia vastaan ​​mahasyövän [2]. Koska useita kemoterapeuttiset lääkkeet Eri luokkien hoidetaan mahalaukun syövän, herkkyys syöpälääkkeiden syöpään pienenee vähitellen, ja vastustuskyvyn monia erilaisia ​​lääkkeitä eri kemialliset rakenteet ja eri toimintamekanismeja voi esiintyä. Tämän tyyppinen vastus kutsutaan moniresistenssin (MDR) ja merkittävästi vähentää tehokkuutta hoidon mahalaukun syöpä. MDR on tulossa merkittävä ongelma onnistuneen syövän hoitoon [3]. On havaittu, että suurin syy MDR syövän on yli-ilmentyminen P-glykoproteiinin (P-gp), tuote ihmisen MDR1-geenin. P-gp on ATP-riippuvainen effluksipumpun joka voi vähentää lääkkeen kertymistä syöpäsoluissa. On ehdotettu, että P-gp, hyvin hyväksytty biomarkkeri MDR, olisi myös pidettävä molekyylikohteessa in monilääkeresistenteistä syöpä [4]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että syöpäsolut MDR ekspressiotasot syklo-oksigenaasi-2 (COX-2) ja isoformi proteiinin kinaseC (PKC-α) ovat molemmat voimistunut, ja niiden inhibitio voidaan kääntää neoplastisten MDR [5] – [10].

Pseudolaric happoa B (PAB, kuva 1), joka on diterpeenin happo eristetty juuresta ja runko kuori puun

Pseudolarix kaempferi

Gordon (Pinaceae), käytetään perinteisen kiinalaisen lääketieteen sen laaja kirjo biologisia ominaisuuksia, kuten anti-sieni vaikutukset ja anti-hedelmällisyyttä vaikutuksia. Lisäksi, sen anti-angiogeeninen vaikutus on myös vähitellen tunnustettu viime vuosina [11], [12]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että PAB indusoi kasvun estäminen, solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Lisäksi PAB kääntää monilääkeresistenssin syövän soluihin [13], [14]. PAB tukahduttaa kasvun mahalaukun neoplastisen AGS solulinja ja indusoi sen apoptoosin [15]. Aiemmat tutkimuksemme osoitti, että PAB on myös dramaattinen estävä vaikutus ihmisen mahasyövän SGC7901 solujen kasvua in vitro [16]. Kuitenkin in vitro tutkimukset syövän vastaisen vaikutuksen PAB ovat harvinaisia, eikä in vivo tehokkuus tämän uuden Yrttiseos vastaan ​​kasvaimia eikä sen tarkkaa molekyylitason mekanismi vastaan ​​MDR on tutkittu perinpohjaisesti.

Tavoitteena esillä olevan tutkimuksen tarkoituksena on arvioida anti-neoplastisia vaikutus PAB in vivo, mukaan lukien käänteinen MDR käyttäen ksenograftimallia nude-hiirissä, ja tutkia, PAB toiminnallinen molekyyli mekanismi liittyy esto MDR kautta Cox-2 /PKC-α /P-gp: n kautta.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

RPMI-1640-viljelyalustaa, ja naudan sikiön seerumia (FBS) ja soluviljelmää hankittiin Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA. Kanin anti-COX-2-monoklonaalinen vasta-aine, hiiren anti-PKC-α ja hiiren anti-P-gp: n monoklonaalisia vasta-aineita ostettiin Santa Cruz Corporation, CA, USA. Toissijainen vasta-aineita kanin ja hiiren vasta, streptavidiini-peroksidaasilla (SP) sarjat, ja 3,3′-diaminobentsidiini (DAB) saatiin Beijing Zhongshan Biotechnology, Kiina. BCA-proteiinin määritys sarjat ja SDS-PAGE-geeli valmistelu sarjat saatiin Beyotime Biotekniikan instituutti, Shanghai, Kiina. PAB ostettiin Liaoningin Institute for Drug Control Kiina nro 201003 (puhtaus: 98%). Adriamysiinin (ADR) saatiin Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Kiina No. 120906. Tween80 ja polyetyleeniglykoli ostettiin Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA.

Soluviljely

Ihmisen mahalaukun adenokarsinooman SGC7901 soluja viljeltiin Keski laboratoriossa Shengjing sairaalan Affiliated China Medical University [16], ja adriamysiini kestävä SGC7901 /ADR-soluja lahjakas Institute of Digestive Diseases in Xijing Hospital Sidoksissa neljäs Military Medical University [17]. Ihmisen mahalaukun adenokarsinooman SGC7901 solujen ja adriamysiini kestävä SGC7901 /ADR-soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä), jossa oli 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C ° C. ADR (1 ug /ml) lisättiin SGC7901 /ADR soluviljelyalustaa auttaa ylläpitämään niiden MDR. Solut logaritmisessa kasvuvaiheessa sentrifugoitiin ja laimennettiin RPMI-1640-alustassa valmistamiseksi yksisoluiset suspensiot, jonka pitoisuus oli 2,5 x 10

6 /ml kylvö.

perustaminen nude-hiirten ksenograftimallia

kasvaimia in vivo torjuvaa vaikutusta PAB tutkittiin hiiren ksenograftimallissa. Jotta malli, 4-6 viikon ikäisiä uros ja naaras immuunivajaissa BALB /c (nu /nu) hiiriin, joiden paino 18-22 g, hankittiin Beijing HFK Bioscience Co., Ltd. (Kiina) ja säilytetään valtuutettujen tilat standardiolosuhteissa jyrsijöiden (SPF grade) laitoksella Laboratory Animal Science. Viisikymmentä hiiret valittiin ja satunnaistettiin kahteen ryhmään (25 ryhmää kohden). Yhteensä 25 hiiriä injektoitiin subkutaanisti 2,5 x 10

6 /ml SGC7901 solua 0,2 ml: ssa RPMI-1640-väliaineessa vasempaan kainaloiden, ja toinen 25 hiiriin injektoitiin SGC7901 /ADR-solut oikeaan kainalon alle alkio-tilassa.

Kokeellinen ryhmät ja lääkitys

Seitsemän päivän kuluttua soluistutusryhmä, kasvaimet tuli kouraantuntuva (noin 3 mm x 3 mm halkaisijaltaan), ja sen jälkeen, kaksi ryhmää pistetään kahdella eri solutyyppejä jaettiin satunnaisesti viiteen alaryhmään (5 hiirtä ryhmää kohti): normaali suolaliuos (NS) kontrolliryhmä, TWEEN kontrolliryhmään, ADR ryhmä, PAB ryhmä, ja PAB + ADR ryhmä. Sillä PAB ryhmät, PAB (25 mg /kg /d 0,1 ml) liuotetaan vesipitoiseen liuokseen, jossa oli 6% polyetyleeniglykolia, 3% etanolia ja 1% Tween80 annettiin vatsakalvonsisäisesti (i.p.) päivittäin 20 päivää [13]. Identtinen tilavuus vesiliuosta tai NS injektoitiin TWEEN kontrolliryhmässä tai NS kontrolliryhmään, vastaavasti. Jotta ADR ryhmä, ADR (1,25 mg /kg 0,1 ml) laimennettuna NS annettiin i.p. päivittäin 20 päivää [18]. Kasvain hiirille annettiin sekä PAB (25 mg /kg /d) ja ADR (1,25 mg /kg /päivä) i.p. saman ajanjakson aikana PAB + ADR ryhmä. Hoidon jälkeen hiirtä kustakin ryhmästä lopetettiin, ja kasvain näytteet kahdenvälisiä kainalon alueita punnittiin ja toistoleikattiin immunohistokemiallista ja western blot-analyysit. Tämä tutkimus suoritettiin tiukasti noudattaen suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden että Shengjing sairaalan Affiliated China Medical University (Luvan numero: 2013PS144K). Hiiret tapettiin alle 10% kloraalihydraatti anestesian, ja kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Mittaus- ja laskeminen kasvaimen tilavuuden ja painon

Paino seurattiin päivittäin, ja kaksi kohtisuorassa halkaisijaa (pituus ja leveys millimetreinä) kasvainten mitattiin kahden päivän välein työntömitoilla koko hoitojakson ajan. Kasvaintilavuudet arvioitiin käyttäen kaksiulotteista mittaukset ja lasketaan seuraavasti: kasvaimen tilavuus (mm

3) = pituus (mm) x leveys

2 (mm) /2. Suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV) laskettiin seuraavasti: RTV = (kasvaimen tilavuuden hoidon aikana) /(keskimääräinen kasvaimen tilavuus alussa hoidon). Antituumorivaikutukset on PAB ja /tai ADR arvioitiin kanssa keskimääräinen esto (IR) kasvaimen kasvua käyttäen seuraavaa yhtälöä: IR (%) = [(1-keskiarvo RTV huumeiden käsitellyn ryhmän /keskiarvo RTV NS kontrolliryhmän ) x 100] [19]. Suhteellinen hiirten kehon painon laskettiin W

t /W

0 indeksi, jossa W

t oli kehon painoa päivänä mittaus-, ja W

0 oli kehon paino ensimmäisenä hoitopäivänä. Muutos ruumiin paino päivinä 1 ja 20, joka edustaa alku ja loppu kokeen vastaavasti käytettiin arvioida ja analysoida huumeiden vaikutuksista painoon [20].

immunohistokemiallinen värjäys ilmentämiseen Cox-2, PKC-α: n ja P-gp

Kasvaimen näytteet kiinnitettiin paraformaldehydillä, käsitellään rutiininomaisesti parafiiniin, ja sitten viipaloitu 4-um: n leikkeitä. Seuraavat hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys, solujen mahasyövän ksenograftit havaittiin valomikroskoopilla. Ilmentymistasojen Cox-2, PKC-α: n ja P-gp korjattu kasvaimen solut määritettiin käyttäen SP-menetelmällä. Lyhyesti, kun se on vahat poistettu ja nesteytyksestä, laseja inkuboitiin 0,3% H

2O

2 ratkaisu ja kuivataan mikroaaltouuni sitruunahappopuskuriin 15 minuuttia hakea antigeenejä. Leikkeet estettiin normaalilla vuohen seerumilla 30 min ajan 37 ° C: ssa ja tutkittiin kanin monoklonaalisella vasta-aineella Cox-2 ja hiiren monoklonaalisia vasta-aineita PKC-α: n ja P-gp 4 ° C: ssa yön yli (kaikki vasta-aineet laimennettiin 1 :300). Biotinyloitua anti-kani-IgG ja anti-rotta-IgG lisättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ennen kuin entsyymi on konjugoitu HRP-streptavidiini, lisättiin. Lisäksi, 3, 3′-diaminobentsidiini (DAB) käytettiin kromogeenina. Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu alkoholiin, ja asennettu neutraali balsam. Kontrollit valmistettiin käyttämällä sekundaarisia vasta-aineita vain. Viisi kenttiä kunkin osan jokaisesta hiiren kustakin ryhmästä valittiin kuvakokoelman. Tulokset analysoitiin ja verrattiin tilastollisesti käyttäen NIS-elementit Br 3.0 ohjelmisto, ja keskimääräinen optinen tiheys saatiin määrällisesti ekspressiotasoja Cox-2, PKC-α ja P-gp: n.

Western blot Cox -2, PKC-α ja P-gp nude-hiirissä ksenografteissa

yhteensä 100 mg tuoretta jäädytetty tuumorikudoksista vähintään kolme hiirtä kustakin ryhmästä punnittiin ja täydennettiin radioimmunosaostuskoe (RIPA) hajotuspuskuria [joka sisälsi 100 ug /ml fenyylimetaanisulfonyylifluoridia (PMSF)]. Sen jälkeen jauhettu saksilla, uutteet homogenisoitiin ultraäänellä. Sen jälkeen kun oli sentrifugoitu 14000 rpm: ssä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan, supernatantti näyte jäädytettiin -80 ° C: ssa western blottauksella. Proteiinipitoisuus uutteet määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa (BCA) proteiinin määritys kit. Yhteensä 100 ug proteiinia per hiiri denaturoivissa olosuhteissa (100 ° C, 5 min) suoritettiin elektroforeesi käyttäen natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) 8%: n erotuksen geeliä ja sähköllä PVDF-kalvoja käyttäen märkää siirron järjestelmä 100 V (Cox-2, PKC-α, β-aktiini 100 min, ja P-gp: ssa 3 h). Kun oli salvattu 5% rasvatonta kuivamaitoa 1 x TBST (Tris-puskuroitu suolaliuos, joka sisältää 0,1% Tween 20: tä) 90 minuutin ajan, kalvot inkuboitiin sitten primaarisen vasta-aineen [kanin monoklonaalista vasta-ainetta Cox-2 (1:400) tai hiiren monoklonaalisia vasta-aineita PKC-α (1:200) ja P-gp (1:200), jossa β-aktiini sisäisenä kontrollina Proteiinilisäyksen] yli yön 4 ° C: ssa. Vasta-aine sitoutuminen visualisoitiin käyttäen peroksidaasi-kytketty toissijaisen vuohen anti-kani-vasta-aine (1:2000) ja vuohen anti-hiiri-vasta-aine (1:2000) 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten kalvot visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssi- (ECL) reagenssi. Tulokset analysoitiin käyttäen Image J ohjelmisto.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvoina ± keskihajonta, ja useita vertailuja minkä tahansa kahden käsiteltyjen ryhmien arvioitiin yksi- tapa ANOVA käyttämällä SNK ja LSD menetelmiä SPSS 17.0 ohjelmistolla. Välinen suhde ruumiinpainon muutos ja kasvaimen tilavuuden analysoitiin Pearsonin korrelaatio analyysi. p-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

estävä vaikutus PAB kasvuun ihmisen mahasyövän

Kasvaimet kaikissa hoidetuissa ryhmissä muodostuu helposti jälkeen kiinnittymisestä yksisoluiset suspensiot ja muodostuminen oli 100%. Kun ksenografteissa tuli esille, ei ollut merkittäviä eroja keskimääräisessä tilavuuden ksenografteista kesken eri ryhmissä (taulukko 1), ja kasvaimen tilavuudet seurattiin eri ajankohtina kaikissa ryhmissä. Käyrät kasvaimen kasvun kahden solulinjan piirrettiin (kuvio 2A, 2B). Kuten taulukosta 1, että SGC7901 solu-hoidetuilla ryhmillä, ei havaittu merkittävää eroa välillä PAB ryhmä ja ADR ryhmä keskimääräinen suhteellinen tilavuudet ksenograftien (p 0,05), ja IR oli 56,4% ja 59,0%, vastaavasti. Lisäys ADR PAB johti korkeampi antituumorivaikutus kuin PAB yksinään tai ADR yksinään (p 0,05) IR on 88,1%. Inhiboiva vaikutus PAB ryhmässä oli vahvempi verrattiin ADR-ryhmästä ksenografteista on SGC7901 /ADR-solut, ja IR-arvot olivat 64,1% ja 21,9%, vastaavasti (p 0,05). Kasvaimen kasvun estäminen oli selvempää hoidettujen hiirien PAB yhdistettynä ADR, jossa IR on 85,8%. Havainnot Kasvaimen paino eri ryhmissä tukee lisäksi tuloksemme koskien volyymin hiirten ksenograftien. Kuvio 2C ja 2D osoittaa muutokset suhteellisen kehon painon hiiristä kymmeneen ryhmään. Kehon paino oli samankaltainen kontrolliryhmien ja PAB-käsiteltyjen ryhmien. Kuitenkin painon laski yhdistelmä-käsiteltyjen ryhmien ja ADR ryhmiä, ja lasku ADR ryhmistä oli selvempää (p 0,05). Lisäksi, kuvio 3 on suora vertailu kasvaimen koot SGC7901 solujen ja SGC7901 /ADR-soluja eri ryhmiin. Välinen suhde ruumiinpainon muutos ja kasvaimen tilavuuden eivät olleet merkittäviä (p 0,05). Testattuina annoksina olivat hyvin siedettyjä, että hiiret, eikä eläin kuolleisuutta ei havaittu kokeen aikana.

V: kasvukäyrä SGC7901 solun ksenograftien B: kasvukäyrä SGC7901 /ADR solu ksenografteissa C: suhteellinen ruumiinpainon muutos hiirten SGC7901 cell ksenografteissa D: suhteellinen ruumiinpainon muutos hiirten SGC7901 /ADR solu ksenograftit. SGC7901 solut ja SGC7901 /ADR-soluja (2,5 x 10

6 /ml) injektoitiin ihon alle kainalon alueita nude-hiirten, ja kun ilmeistä havaittu kasvaimia, hiiret saivat päivittäisen annoksen 25 mg /kg pseudolaric happoa B ja /tai 1,25 mg /kg adriamysiinin tai fysiologista suolaliuosta (kontrolli) /tween-liuosta (kontrolli) (n = 5 ryhmää kohden). Kasvaintilavuudet seurattiin eri ajankohtina (Day1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19). IR kasvaimen kasvua lääkettä saaneissa ryhmissä verrattiin että kontrolliryhmissä lopussa kokeen yksisuuntaisella ANOVA. *

p

0,05 kontrolliryhmään verrattuna.

V: eristetty kasvaimet SGC7901 soluja (yllä) ja SGC7901 /ADR-solut (alla) B: ihonalainen ksenografteja of SGC7901 solulinjan nude-hiirissä C: ihonalainen ksenografteja of SGC7901 /ADR solulinja nude-hiirissä. (Ryhmä 1): NS kontrolliryhmässä (ryhmä 2): TWEEN kontrolliryhmässä (ryhmä 3): ADR ryhmä (ryhmä 4): PAB ryhmä (ryhmä 5): PAB + ADR ryhmä.

immunohistokemiallinen värjäys ilmentymisen Cox-2, PKC-α: n ja P-gp

Kaikki kasvaimet kunkin ryhmän kautta immunohistokemiallisella värjäyksellä, näkyy positiivinen ekspressio Cox-2, PKC-α ja P- gp proteiineja. Cox-2: n ja PKC-α ilmentyminen määritettiin positiiviseksi, jos värjätään alueen kasvainsolujen oli sytoplasmassa, ja P-gp-värjäys katsotaan positiiviseksi, jos värjäytyminen havaittiin kalvon ja sytoplasmaan. Proteiinit värjättiin keltainen tai ruskea mukaisesti optisella mikroskoopilla havainto (kuvio 4). Sillä SGC7901 /ADR-solulinja, värjäytyminen näiden proteiinien kontrolliryhmissä oli vahvempi kuin muissa ryhmissä (p 0,05). PAB hoito vähensi solunsisäisen värjäys Cox-2, PKC-α: n ja P-gp verrattuna ADR-hoidetussa ryhmässä (p 0,05). Sen jälkeen PAB ja ADR hoito, solunsisäinen värjäys näiden proteiinien oli harvemmassa ja heikompi verrattuna muiden ryhmien. Sillä ksenografteissa kahden NS kontrolliryhmää, värjäytymistä P-gp on SGC7901 soluissa oli merkittävästi pienempi kuin SGC7901 /ADR-soluja (p 0,05). Analyysi värjäytymisen intensiteetti Cox-2, PKC-α: n ja P-gp ilmentymisen paljasti samat tulokset (taulukko 2).

: ilmaus Cox-2 hiirissä ksenografteissa B: ilmaus koostuu PKC α hiirillä ksenografteissa C: ilmaus P-gp hiirillä ksenografteissa D: negatiivinen kontrolli E: ksenografti HE F: normaali mahalaukun kudoksen HE. Kudokset kiinnitettiin, upotettu, asennettu ja värjätään SP menetelmällä tai HE värjäämällä käyttäen standardimenetelmiä. Mittakaava, 25 pm.

vaikutus PAB on Cox-2, PKC-α, ja P-gp ilmentymistä hiirissä ksenografteissa

Valaistaan ​​molekyylimekanismin mukana on käänteinen vaikutus PAB on SGC7901 /ADR-ksenograftien in vivo, ilmaus Cox-2, PKC-α, ja P-gp kasvaimissa eri reagenssin-käsiteltyjen ryhmien määritettiin western blot -analyysillä. Kuten on esitetty kuviossa 5, että NS kontrolliryhmässä, ilmentymisen tasojen Cox-2, PKC-α, ja P-gp on SGC7901 solun -ksenografteja pienempi kuin kuin ne, jotka SGC7901 /ADR kasvaimet (p 0,05) . Sillä kasvaimia SGC7901 /ADR-soluja, ekspressiotasoja kolmen kiinnostavia proteiineja NS kontrolliryhmässä ja TWEEN kontrolliryhmässä olivat merkittävästi korkeampia verrattuna muihin ryhmiin (p 0,05), eikä ollut mitään merkittävää eroa kaksi ryhmää (p 0,05). Ilmentymistasojen Cox-2, PKC-α, ja P-gp on PAB-hoidetussa ryhmässä oli merkitsevästi pienempi verrattiin ADR-hoidetussa ryhmässä (p 0,05). Ilmaisu on β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina, ja ekspressiotasot Cox-2, PKC-α, ja P-gp laskivat peräkkäin joukossa Kontrolliryhmiin ADR ryhmä, PAB ryhmä ja PAB + ADR (p 0,05 kontrolliryhmään verrattuna.

Keskustelu

PAB on yksi tärkeimmistä biologisesti aktiivisia komponentteja juuri kuori lääkekasvin

Pseudolarix kaempferi

ja näyttää huomattavaa sytotoksisuutta kohti useita syöpäsolun linjat. In vitro tutkimukset ovat myös osoittaneet, että se kumoaa MDR karsinooman estämällä yliekspressio P-gp ilman selvää sivuvaikutuksia [13], [15], [20], [21]. On myös osoitettu, että PAB on antituumorivaikutusta hiirillä ksenograftimalleja ihmisen paksusuolen syöpä ja hepatosellulaarinen karsinooma [13], [20], ja ei ole tunnettuja sivuvaikutuksia PAB eläinten on raportoitu. Edellisessä tutkimus osoitti, että PAB on voimakas inhiboiva vaikutus SGC7901 solulinjassa in vitro ja indusoi apoptoosia mahalaukun syövän solujen kautta kaspaasi-reitin [16]. Nykyinen in vivo tutkimus antaa lisänäyttöä siitä, että PAB on suojaava vastaan ​​mahalaukun kasvaimia hiiren ksenograftimalleissa käyttäen SGC7901 soluja ja SGC7901 /ADR-soluja. Alustavan kokeet ovat osoittaneet, että PAB 25 mg /kg ei ainoastaan ​​inhiboi kasvua mahalaukun syövän, mutta on myös hyvin siedetty hiirillä. Lisäksi olemme sisältyi TWEEN kontrolliryhmän jättää vaikutuksesta vesiliuosta, jota käytettiin liuottamaan PAB kasvaimiin [13]. Arkaluontoisten solujen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on PAB ei tuottanut merkittäviä eroja verrattuna ADR, perinteinen kemoterapia huume. Lisäksi PAB on biologisesti aktiivinen yhdiste, joka aiheutti sen kääntää vaikutus vastaan ​​SGC7901 /ADR solulinja kasvaimia kohdistamalla signalointireitille aktivoidaan P-gp yli-ilmentymisen in vivo.

P-gp on 170 kDa kalvolla proteiini, joka toimii lääkeaineen effluksipumpun, jolloin jatkuva vika solunsisäiseen kertymiseen lääkkeiden [22]. Usealle fenotyyppi on merkittävä syy kasvaimen kemoterapian epäonnistumisen ja on pääasiassa tuotteen yli-ilmentyminen P-gp useimmissa syöpien, mukaan lukien maha- kasvaimet [23]. Lisäksi inhibitio tämän reitin saattaa olla tapa kääntää MDR mahalaukun syövän soluihin [3], [24].

Cox-2, indusoituvan entsyymin, joka katalysoi arakidonihapon prostanoideiksi ( PG) ja osallistuu useita fysiologisia ja patologisia tapahtumia, indusoituu erilaisten tulehdustautien ja mitogeenisten ärsykkeiden [25]. Vahva assosiaatio MDR ja yli-ilmentyminen Cox-2 on raportoitu monia erilaisia ​​kasvaimia. Nämä aiemmat tulokset viittaavat siihen, että Cox-2 moduloi ilmentymistä ja aktiivisuutta P-gp ja on mukana kehittämässä MDR-fenotyypin [26] – [28]. Lisäksi kertynyt näyttöä siitä, on osoittanut, että Cox-2-estäjät voivat herkistää syöpäsolut anti-proliferatiiviset vaikutukset kemoterapeuttisten muuttamalla aktiivisuutta ATP-sitovaa kasetti proteiinia. Cox-2-inhibiittorit voivat jopa kääntää MDR estämällä COX-2-välitteisen kasvu MDR1 ilmaisun ja toimintaa syöpä, sekä in vitro ja in vivo [6], [7], [29]. Sen vuoksi oletamme, että Cox-2 voi säädellä ilmentymistä P-gp kasvainkudoksissa, ja että estävä tämä reitti on suuri merkitys käännetään vastus syövän kemoterapeuttisten.

Olemme löytäneet, että sen SGC7901 /ADR kasvaimet, ilmentymisen tasojen Cox-2: n ja P-gp NS kontrolliryhmässä olivat ilmeisesti suurempi kuin varten vierassiirrännäisiä SGC7901 soluja. Injektion jälkeen PAB, selvää vähenemistä näissä ekspressiotasoja havaittiin. Kuitenkin haittavaikutus oli vähemmän tehokas tukahduttaminen Cox-2 ja P-gp ilmentymisen tasot SGC7901 /ADR solu ksenograftit, ja yhdistettynä PAB, pienemmällä proteiineihin havaittiin. Niinpä ehdotetaan, että modulaatio Cox-2 ilmentyminen PAB voivat heikentää ilmentymistä ja aktiivisuutta P-gp, estävät kasvua ja indusoivat apoptoosin, toimimisen lisäksi yhteistyökykykyisiä ADR tukahduttaminen lääkkeille vastustuskykyisten kasvainten ja jopa kääntyminen MDR-fenotyyppi mahasyövän.

PKC on seriini /treoniini-kinaasi mukana signaalitransduktioon tarvitaan solujen lisääntymistä ja erilaistumista [30]. PKC-isoformit, yliekspressio ja lisääntynyt aktiivisuus PKC-α ovat läheisimmin sääntelyn MDR fenotyypin ihmisen mahasyövän [31]. Tässä esitetyt tulokset tukevat käsitystä, että PKC-α fosforyloi P-gp: n, moduloi P-gp: n ulosvirtausta toiminto, ja lopulta johtaa lääkeresistenssi [32]. Esto PKC-α tietyn estäjän tai kaatamalla PKC-α siRNA johtaa vähentyneeseen MDR1 ilmaisua, lisääntynyt myrkyllisyys syöpälääkkeiden, ja käänteinen MDR [8] – [10]. Siksi me spekuloida, että PKC-α signaalitransduktion järjestelmä voisi olla rooli moduloivan MDR1 ilmaisun mahasyövässä.

Normaalioloissa PKC on aktiivinen soluissa, ja sen aktivointi liittyy ylävirran PGE aktivointia. Cox-2 on kytketty kalvoon liittyvä prostaglandiini E2-syntaasi (MPGES-1), ja synteesi PGE näiden proteiinien välittämän kasvaa ja aktivoi alavirran PKC-α-reitin [33]. On osoitettu, että selektiiviset Cox-2-inhibition spesifisiä inhibiittoreita tai siRNA on terapeuttinen vaikutus ekspression inhiboimiseksi PKC-α: n ja P-gp, samalla samaan aikaan, kääntää MDR [26], [34]. Tutkimus on osoittanut, että PGE2 välittää induktio MDR1 ilmaisun kautta PKC-reitin [35]. Tulokset Meidän kokeet osoittivat, että PAB voi estää PKC-α ilmentymistä ksenograftien on SGC7901 /ADR-solulinja, joiden vaikutus oli voimakkaampi kuin ADR. Lisäksi kun PAB yhdistettiin ADR, PKC-α ilmentymisen eston tehokkuus oli vieläkin voimakkaampi. Vaihtelu taipumus PKC-α ilmentyminen on yhteneväinen Cox-2: n ja P-gp eri reagenssin-käsiteltyjen ryhmien lääkeaineresistenttien SGC7901 /ADR kasvaimia. On osoitettu, että PAB indusoi kasvun pysähtymisen ja apoptoosin kautta estämällä Cox-2-reitin syöpäsoluissa [20], [21]. Oletamme, että PAB estää ilmentymisen Cox-2 SGC7901 /ADR-solujen ksenografteissa ja että kytkentä Cox-2 ja MPGES-1 vähentää synteesi PGE, joka vähentää aktivoinnin alavirran PKC-α. Koska fosforylaation P-gp on estetty, lisää lääkkeitä kerääntyvät syöpäsolujen myrkyllisyyttä ADR on parannettu, ja MDR on käänteinen. Nämä tulokset tarjoavat tietoa uudesta strategiasta, joissa käytetään PAB estävän MDR ihmisen syöpien.

Yksi painopiste kokeilu on estävää vaikutusta pseudolaric happoa B ihonalainen ksenografteja ihmisen mahalaukun adenokarsinooman ja vertailun anti-kasvain lääkkeiden vaikutuksia eri hoitoryhmissä. Lisäksi ominaisuus SGC7901 solujen ja SGC7901 /ADR-solut ovat erilaisia. Kautta kaksi pre-koe ja muodollinen kokeessa me kaikki havaittu tuumorin tilavuus SGC7901 /ADR-soluja ei ollut suurempi kuin SGC7901 soluja. Oletamme kasvaimen tilavuuden saattaa liittyä solupitoisuus, kasvun aika, joka on solujen ja muunlaisia ​​tekijöitä. Siksi emme ole verrata kasvaimen tilavuuden välillä SGC7901 solun ksenografteissa ja SGC7901 /ADR solu ksenograftit. Lisäksi olemme spekuloida, että ruumiinpainon muutos hiirten ehkä liittyi pääasiassa myrkyllisyyden huumeita, ja ei ole merkittävää suhdetta kasvaimen tilavuuden meidän kokeessa.

Toinen painopiste kokeilu on taustalla molekyylitason mekanismeja usealle lääkkeelle resistenssiä. Niinpä olemme vasta suunniteltu NS kontrolliryhmä SGC7901 solun ksenograftien kontrastin ja vahvistaa ilmauksia kolmenlaisia ​​proteiinin SGC7901 /ADR solu ksenografteissa ovat todellakin merkittävästi korkeampi kuin päässä SGC7901 solusta ksenografteista. Sitä paitsi, koska vaste SGC7901 solujen syöpälääkkeiden on pikemminkin herkempi kuin SGC7901 /ADR solujen sekä perus- ja kliinisiä kokeita, miten parantaa herkkyyttä monilääkeresistenttisyyden solujen syöpälääkkeiden on meidän tutkimuksen painopiste. Siksi emme ole verranneet ilmaisuja Cox-2, PKC-α ja P-gp varten kasvainten SGC7901 ja eri hoitoja Tämän ryhmän paitsi NS kontrolliryhmän Western blot ja immunohistokemiallisella värjäyksellä.

Tutkimuksemme havaitsi, että kasviperäisten diterpenoidinen PAB paitsi merkittävästi tukahdutti mahasyövän SGC7901 soluihin in vivo, vaan myös ilmeiseen estovaikutusta kohti kasvaimia lääkeaineresistenttien SGC7901 /ADR-soluja. Lisäksi yhdistelmä PAB ADR voisi estää kasvun mahasyövän ja kehittäminen nude-hiirissä. On syytä mainita, että eräänlaisena perinteisen kiinalaisen lääketieteen, vaikutus PAB kehon painon nude-hiirten oli varsin alhaisempi kuin ADR meidän kokeessa, joka on ilmeinen etu, joka tekee PAB varmemman ja siedettävä lääke syövän hoidossa. PAB ehkä ole ainoastaan ​​uusi tehokas lääke estyminen kasvun mahasyövän ja käännetään sen MDR, mutta se voidaan myös käyttää erinomaisena adjuvanttia perinteisiä kemoterapeuttisten ja kirurginen hoito lisäksi seuraavat kehittämiseen ja tutkimukseen.

Tässä tutkimuksessa selvitimme, ensimmäistä kertaa, inhiboiva vaikutus PAB ihmisen mahasyövän ja sen kääntyminen vaikutus MDR in vivo vierassiirrännänmallissa nude hiirimallissa. Olemme todenneet, että sen esto MDR on välittämien Cox-2 /PKC-α /P-gp-reitin, joka muodostaa ratkaisevan teoreettinen perusta koskee molekyylitason mekanismeja mahalaukun syövän hoidossa. Emme kuitenkaan ole tutkineet MDR mekanismin suhteen geenien ilmentymisen ja sääntelyä. Koska molekyylitason mekanismeja peruutettaessa MDR ovat erittäin monimutkaisia ​​ja useita erityyppisiä proteiineja, geenejä ja tekijät voivat olla mukana, silmukka ehdotimmekin voi olla vain osa mekanismia kääntää MDR. Syvällisempää ja konkreettisia sääntelyn mekanismeja on selvitetty tulevissa tutkimuksissa.

Johtopäätöksenä PAB on merkittävä estävä vaikutus mahalaukun syövän in vivo ja voi kääntää MDR mahalaukun syövän kemoterapiaa huumeita. Mekanismi vastaan ​​MDR välittyy ainakin osittain läpi Cox-2 /PKC-α /P-gp: n kautta. Tutkimuksemme tarjoaa laaja tulevista tutkimuksia PAB mahalaukun syövän hoidossa.

tukeminen Information

tarkistuslista S1.

ARRIVE suuntaviivat tarkistuslista.

doi: 10,1371 /journal.pone.0107830.s001

(DOC) B