Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sagopilone, optimoidun täyssynteettinen epotiloni, on mikrotubulia stabilointiainetta, joka on osoittanut korkean

in vitro

ja

in vivo

aktiivisuutta laajaa Humaanituumorinäytteiden malleja. Analysoimme ero vaikutusmekanismi sagopilone ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat

in vitro

. Sagopilone esti leviämisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat alemmilla nanomolaarisella pitoisuus. Käsittely sagopilone aiheutti voimakasta häiriöitä solun tukirangan organisaation. Kaksi pitoisuudesta riippuvainen fenotyypit havaittu. 2,5 nM sagopilone tai 4 nM paklitakselia aneuploidi fenotyyppi tapahtua taas mitoosi pidätys fenotyyppi aiheutettiin 40 nM sagopilone tai paklitakselia. Mielenkiintoista, hoito 2,5 nM sagopilone tehokkaasti estivät solujen lisääntymistä, mutta – verrattuna suuria pitoisuuksia (40 nM) – vain marginaalisesti aiheuttamaa apoptoosia. Hoito, joilla on korkea verrattuna alhainen pitoisuus sagopilone tai paklitakselin säätelee ei-päällekkäisiä joukko geenejä, mikä osoittaa, että molemmat fenotyypit olennaisesti eroavat toisistaan. Geenit mukana G2 /M faasimuutoksen ja karan kokoonpano tarkastuspiste, kuten sykliini B1 ja bubR1: tä oli voimistunut käsittelemällä 40 nmol sagopilone. Yllättäen myös osallistuvat geenit DNA-vaurioita vastaus oli voimistunut kyseisen hoidon. Sen sijaan hoidossa A549-solut, joilla on alhainen pitoisuus sagopilone paljasti säätelyä suoran transkription kohdegeenien TP53, kuten CDKN1A, MDM2, GADD45A, FAS. Knockdovvn TP53, joka esti transkription induktio TP53 kohdegeenien, johti merkittävään kasvuun apoptoosin induktio A549-soluja, kun niitä käsitellään, joilla on alhainen pitoisuus sagopilone. Tulokset osoittavat, että aktivointi TP53 ja sen alavirran efektorien, kuten CDKN1A mukaan pieninä pitoisuuksina sagopilone vastaa suhteellista apoptoosin vastus A549-solut ja ne voivat edustaa resistenssimekanismi sagopilone.

Citation: Winsel S, Sommer A, Eschenbrenner J, Mittelstaedt K, Klar U, Hammer S, et ai. (2011) Molecular Vaikutusmekanismi ja rooli TP53 että Herkkyys Novel epotilonin Sagopilone (ZK-EPO) A549 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 6 (4): e19273. doi: 10,1371 /journal.pone.0019273

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 elokuu 2010; Hyväksytty: 31 maaliskuu 2011; Julkaistu: 29 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Winsel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ rahoittivat Bayer Healthcare (www.bayerhealthcare.com). Rahoittajat oli rooli tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen. Kaikki kirjoittajat ovat entisiä työntekijöitä Bayer Healthcare. Grant tuki yksityiskohtaisesti: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt Vastaanotetut kaupallinen tutkimus avustusta Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann ovat nykyisiä tai entisiä työllistää Bayer Healthcare ja patentteja Bayer Healthcare sekä osakkeiden Bayer.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja on seuraavat ristiriitoja: yhtiö oli rooli tässä tutkimuksessa tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista ja valmistelu käsikirjoituksen. Kaikki kirjoittajat ovat entisiä työntekijöitä Bayer Healthcare. Grant tuki yksityiskohtaisesti: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt Vastaanotetut kaupallinen tutkimus avustusta Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann ovat nykyisiä tai entisiä työllistää Bayer Healthcare ja patentteja Bayer Healthcare sekä osakkeiden Bayer. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi johtavista syistä syövän kuoleman maailmanlaajuisesti, koska se on usein vain diagnosoitu myöhemmissä vaiheissa ja näyttää suurta vastustusta solunsalpaajahoitojen käytetty. [1] – [5]. Sagopilone (SAG) on täyssynteettinen epotiloni, parhaillaan kliinisessä kehityksessä että optimoitiin rajoitusten voittamiseksi liittyy usein taksaanien, tavanomaisten tubuliinia sitovia aineita (TBAs) kuten esimerkiksi MDR välittämä kestävä mekanismien [6]. SAG on osoittanut korkea

in vitro

ja

in vivo

aktiivisuus erilaisia ​​kasvainmuotoja verrattuna paklitakseliin (PAC) ja muiden yleisesti käytettyjen kemoterapeuttisten aineiden [6]. Vahvoja antituumorivaikutus ole havaittu NSCLC (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä) solulinjoja

in vitro

ja ensisijainen ihmisen NSCLC hiiren ksenograftimalleja, SAG voi tarjota uuden mahdollisen hoidon mahdollisuudet NSCLC [7].

Useat tutkimukset kuvaavat ennustavan markkereita vasteen NSCLC solulinjat, kuten ilmaus Leikkauskorjauksessa rajat komplementaatioryhmässä 1 (ERCC1) geenin platinan yhdisteet [8], tai epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) mutaatiostatuksesta tila että EGFR tyrosiinikinaasin-estäjät (gefitinibi ja erlotinibi) [9]; [10]. Mitä kestävyys TBAs, raportteja solulinjat valitaan PAC resistenssin pitkän aikavälin kulttuuri läsnä lääkeaineen osoitti kohonneita TUBB3 (beta III tubuliinin) proteiinin ilmentymisen [11]. Sen sijaan niiden patupilone (epotiloni B) kestävät vastine, inkuboitiin samalla tavalla, oli pieni TUBB3 proteiinin ilmentyminen [11]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että TUBB3 edistää solujen vastustusta PAC, mutta ei epotiloni. Tämän seurauksena on olemassa tarve muille merkeille, jotka voivat ennustaa SAG vastauksen.

Mutaatiot kasvaimen synnyssä, jolla on keskeinen rooli soluvastetta DNA vaurioita, solusyklin säätelyssä, ja apoptoosin [12] , havaittiin noin 50% kaikista NSCLC tapauksissa [13]. Kuitenkin rooli TP53 vastauksena TBAs kuten PAC on asetettu kyseenalaiseksi: Jotkut ryhmät eivät ilmoittaneet korrelaatiota TP53 mutaatiostatuksesta riippumatta ja herkkyys PAC [14]; [15], kun taas toiset havaittiin, että puute TP53 aktiivisuuden lisännyt kemosensitiivisyys PAC [16]; [17]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että TP53 mutaatiostatuksesta riippumatta ja muuttunut TP53 aktiivisuus saattaa vaikuttaa herkkyyttä solujen SAG. Käsitellä tätä kysymystä, olemme analysoineet vaikutuksen TP53 kykyyn SAG apoptoosin käytettäessä NSCLC malli

in vitro

.

tunnistaminen ositus biomakers tai huumeisiin tai huumeiden tavoite -aiheiset vastaus markkereita voisi parantaa huomattavasti tuloksen hoidon ja johtaisi siirtyminen kohti räätälöityjä hoitoja vastaan ​​tietyn taudin tyypit [18]. Optimaalinen hoito potilaille, jotka kärsivät NSCLC jatkossa yhä enemmän biomarkkereiden analyysiin tunnistaa potilasryhmää, jotka hyötyvät eniten tietyn mono- tai yhdistelmähoitoa. Kuitenkin biomarkkereiden tunnistamiseen ja validointi on edelleen suuri haaste [19] ja sen vuoksi on tärkeää seurata uusien terapeuttisten aineiden potilaille NSCLC tutkimukseen potilaan kerrostuminen ja tunnistamista ja tunnustamista kliinisten biomarkkereita, jotka ennustavat vastaus. Osana tätä prosessia, on tärkeää ymmärtää, miten toiminta lupaavia uusia aineita vaikuttavat muutokset keskeisten solureiteillä, ja päinvastoin.

tavoitteena meidän translaation ohjelma oli tutkia aktiivisuuden SAG

in vitro

paneelissa NSCLC solulinjojen, analysoida tarkemmin sen vaikutusmekanismi ja verrata sitä vaikutuksia PAC ja selvittämään mahdollisia resistenssimekanismit sekä ennustavia hoitovaste geeniekspressioprofilointi.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja yhdisteet

Ihmisen keuhkojen sinoomasolulinjoja (A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522, NCI-H226, NCI- H460) saatiin American Type Culture Collection (ATCC), ja niitä viljeltiin mukaan suositellaan protokollia. SAG syntetisoitiin Bayer Healthcare Laboratories kautta kokonaissynteesi. PAC ostettiin Sigma-Aldrich (München, Saksa). Yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä ZVAD.fmk hankittiin Bachem, (Heidelberg, Saksa). Kaikki media ja ravintolisät soluviljelmässä hankittiin Biochrom AG (Berliini, Saksa). Kantaliuokset valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Valintaan transdusoitu stabiilisti solulinjojen Hygromysiini ostettiin Roche (Mannheim, Saksa).

kasvain-solujen lisääntymisen määrityksessä

vaikutus SAG tai PAC proliferaatioon keuhkosyöpä arvioitiin käyttämällä soluproleferaatiomäärityksessä perustuu värjäämällä solut kristallivioletilla, kuten aiemmin on kuvattu [20]. IC50-arvot laskettiin kolmen erillisen kokeen avulla Sigmaplot ohjelmistoa (SPSS, Friedrichsdorf, Saksa).

In vitro

analyysi vaikutuksia solun tukirangan, solusyklin ja apoptoosin

A549-soluja inkuboitiin ajoneuvon (etanoli 0,1%), 2,5 nM tai 40 nM SAG 20 h, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin monoklonaalisella hiiren anti-α-tubuliinin-vasta-aine (1:1000) (Sigma-Aldrich ), Alexa Fluor® 488-kytketty vuohen anti-hiiri-IgG sekundääristä vasta-ainetta (1:250) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) ja DRAQ5 (Biostatus, Leicestershire, UK), standardimenetelmien mukaisesti. Kiinteät ja värjätään solut analysoitiin käyttämällä Zeiss LSM 510 META mikroskooppi (Carl Zeiss, Jena, Saksa) varustettu Plan-Apochromat® 63x /1.4 (öljy DIC) tavoite. Zeiss LSM-ohjelmiston (versio 3.0 SP3) on käytetty konfokaalisella kuvantamiseen.

Fluoresenssi-soluerottelijaa (FACS) analyysi suoritettiin sen määrittämiseksi solusyklin jakautumisen SAG- tai PAC-käsitellyt solut. Soluja inkuboitiin SAG ilmoitettuina pitoisuuksina tai ajoneuvon 18 h, kiinnitettiin 70% etanolilla, ja värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia (PI) (Sigma-Aldrich). Solun DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä BD FACSCalibur ™ (Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, USA) ja tiedot analysoitiin CellQuest ™ -ohjelmistoa (Becton, Dickinson and Company). Tutkia apoptoosin FACS: llä, A549-soluja inkuboitiin jatkuvasti 72 tunnin ajan kanssa ilmoitettuina pitoisuuksina SAG tai ajoneuvon, trypsinoitiin ja värjättiin DiOC

6 (3) (3,3′-dihexyloxacarbocyanine jodidi) (Invitrogen Inc.) ja PI aiemmin kuvatulla [21].

Quantitative Real-Time PCR ja Western Blot

RNA uutettiin käyttäen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa), cDNA muodostettiin käyttäen SuperScript First Strand Synthesis System (Invitrogen Inc.). Reaaliaikainen PCR suoritettiin geenin ilmentymisen määrityksissä Applied Biosystems: p21 (# Hs00355782_m1), TP53 (# Hs00153340_m1), sykliini B1 (# Hs00259126_m1), bubR1: tä (Hs00176169_m1), FAS (Hs00163653_m1), GADD45A (Hs00169255_m1), MDM2 ( Hs00242813_m1), ja HPRT (# 4326321E) kuin endogeeninen kontrolli. Reaktiot perustettiin kolmena kappaleena käyttäen TaqMan FAST Universal PCR Mastermix ja kirjattu 7500 Fast Real-Time PCR-System (Applied Biosystems). Suhteellinen ilmentyminen Jokaisen geenin oli määrällisesti käyttäen vertailevaa kynnyssykli menetelmä (ΔΔ

Ct menetelmä) yhtä vahvistus hyötysuhteet kohde ja potilaan oman valvonnan.

Proteiinit uutettiin käyttäen M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce, Perbio Science, Bonn, Saksa). Proteiinikonsentraatiot lysaatit määritettiin BCA Protein Assay Kit (Pierce) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yhtä suuret määrät proteiineja erotettiin 4-12% Bis-Tris geeli (Invitrogen) kanssa XCell SureLock sähköforeesikammion (Invitrogen) on täytetty MOPS SDS ajopuskurissa ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Blokkaamisen jälkeen epäspesifinen sitoutuminen sivustoja, kalvo oli tuotettu vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä CDKN1A (Abcam, # 16767), TP53 (BD ​​Pharmingen, # 15801A), BUB1B (BD Transduction Laboratories, # 612502), sykliini B1 (BD Pharmingen, # 554176 ), γH2AX (upstate, # 05-636), PARP (BD Pharmingen, # 551024), fosfori-Ser /Thr-MPM-2 (upstate # 05-368), ja GAPDH (Advanced immunokemiallisin # RGM2 /Clone 6C5) lastauksen valvonta.

RNA geeniekspressioanalyysiä varten

A549-soluja ympättiin 10 cm: n solu- viljelymaljoille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Solut käsiteltiin sitten alustalla, joka sisälsi joko 2,5 nM SAG, 40 nM SAG, 4 nM PAC tai 40 nM PAC, vastaavasti, ajoneuvon (etanoli 0,1%), tai jätettiin käsittelemättä 18 tunnin ajan. Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa), joka sisältää DNaasi I (Qiagen) vaihe poistaa genomista DNA: ta. Kokonais-RNA eheys tarkistetaan käyttäen RNA LabChips on Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Inc., Palo Aito, CA, USA) ja pitoisuus määritettiin Nanodrop spektrofotometrillä (Peqlab, Erlangen, Saksa). Kaikki RNA-näytteet oli korkea RNA eheys numerot [22] suurempi kuin 9,5.

Affymetrix GeneChip® analyysi

One-Cycle Eukaryotic Target Labeling Kit (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA ) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 2 ug korkealaatuisia kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä T7 merkitty oligo-dT-aluketta, että ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi reaktio. Sen jälkeen RNaasi H -välitteisen toisen juosteen cDNA-synteesi, kaksijuosteinen cDNA puhdistettiin ja toimi templaattina myöhemmässä

in vitro

transkription reaktio, joka tuottaa biotiini-leimattu komplementaarinen RNA (cRNA). Biotinyloidun cRNA sitten siivottu, hajanainen ja hybridisoitiin GeneChip- HGU133Plus2.0 ilmaisun paneelit (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA.), Jotka sisältävät 54675 koetinsarjojen. GeneChips pestiin ja värjättiin streptavidiini-fykoerytriinilla on GeneChip- Fluidics Station 450 (Affymetrix). Pesun jälkeen taulukot skannattiin koskevasta Affymetrix GeneChip- 3000 skanneri automaattilataajan. Yhteensä 30 HGU133Plus2.0 paneelit käsiteltiin n = 5 biologinen rinnakkaisnäytteiden kaikissa hoitoryhmissä.

Expression-analyysit suoritettiin Expressionist Pro 4.0-ohjelmisto (Genedata AG, Basel, Sveitsi). Laatu tiedostojen (CEL formaatti), jossa koetin taso ekspressiotietojen tarkistettiin ja puhdistettu käyttäen Expressionist puhdistamolla ohjelmisto (Genedata AG). Puhdistajan prosessi suoritettiin ryhmittely näytteitä on ominaisuus intensiteetillä. Tämä mahdollistaa mahdollisten harha on ominaisuus intensiteetillä. Myöhemmin puhdistettu CEL tiedostoja kondensoitiin MAS5.0 algoritmin (Affymetrix) ja LOWESS normalisoitu käyttäen kaikissa kokeissa referenssinä. Normalisoitu ilmaisu aineistoja ladattiin COBI tietokantaan (Genedata) ja analysoitiin Genedata Expressionist ohjelmisto. Periaate Component Analysis (PCA) ja hierarkkinen klusterointi suoritettiin Expressionist Analyst Pro 4.0-ohjelmisto (Genedata). Kelvollinen arvo suhteessa analyysi suoritettiin kullekin ryhmälle (4 5 koetinsarjojen oli osoitettava signaali) ja tuloksena ryhmät koetinsarjojen yhdistyivät. Nämä tiedot tehtiin useita pareittain vertailuissa käyttämällä Expressionist Analyst Pro 4.0-ohjelmisto (Genedata). Tilastolliset analyysit sisältyvät pareittain vertailut SAG- tai PAC käsiteltyjen näytteiden ja vehikkelillä käsiteltyjen näytteiden. Koetinsarjojen katsottiin säänneltävä jos he olivat ulkopuolella ellipsoidin alue Volcano juoni soveltaen seuraavat kynnysarvot: Volcano juoni: 5x-kertainen muutos ja P-arvo 1 × 10-5 T-testi 40 nM SAG ja PAC; 2,5 nM SAG ja 4 nM PAC 3-kertainen muutos ja P-arvo alle 5 x 10-3. Venn risteyksessä analyysit merkittävästi säänneltyjen geenien suoritettiin geenien tunnistamiseen säädellään yleisesti eri hoitoja käyttämällä Expressionist Analyst Pro 4.0-ohjelmisto. Pathway analyysit tehtiin kanssa GeneGo Metacore (St. Joseph, MI, USA) tietokanta ja ohjelmistotyökaluja. Kaikki Affymetrix cel-tiedoston tiedot ovat saatavilla kautta ArrayExpress hakunumerolla E-MTAB-377.

kloonaus shRNA rakentaa

BLOCK-IT RNAi Designer algoritmi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) käytettiin analysoimaan TP53 mRNA: ta (GenBank, NM_000546.4) ja erottaa kolme kohdesekvenssejä shRNA, eli shTP53_1 (sense) 5′-GCATCTTATCCGAGTGGAAGG-3 ’ja 5′-CCTTCCACTCGGATAAGATGC-3′; shTP53_2 (sense) 5’-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3 ’ja 5′-GTAGATTACCACTGGAGTC-3′; shTP53_3 (sense) 5’-GCGCACAGAGGAAGAGAATCT-3 ’ja 5′-AGATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’. Kohdesekvenssejä varten epäspesifinen kontrolli shRNA (ei-kohdistuksen shRNA) olivat shCtrl1 (sense) 5′-TAAGGCTATGAAGAGATAC-3 ’ja 5′-GTATCTCTTCATAGCCTTA-3′ ja shCtrl2 (sense) 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ’ja 5 ”-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3 ’.

Täydentävät synteettiset DNA-oligonukleotidit hybridisoitiin ja insertoitiin pENTR /U6-vektoriin (Invitrogen). shRNA kasetteja rekombinoitiin Gateway kloonaamisen modifioitu Plenti-6 kohde-vektoriin (pGT3, Invitrogen) tuottaa lentiviruksen shRNA ekspressiorakenteet shCtrl1, shCtrl2, shTP53_1, shTP53_2, ja shTP53_3. Kaikki rakenteet vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla klo Services in Molecular Biology (SMB), Berliini, Saksa.

Tuotanto lentiviruksen ja transduktio A549-solut

293FT solut transfektoitiin eri pGT3 ekspressiovektoreilla sisältäviä TP53 shRNAs tai kohtee- na oleville ohjaus shRNA. Lentivirukselle tuotanto toteutettiin lohkon mukaisessa-IT U6 RNAi Entry Vector Kit käyttöopas (Invitrogen). A549-soluja infektoitiin lentiviruksien rekombinantti varten shTP53_1, shTP53_2, shTP53_3, tai ei-kohde ohjaus shRNAs shCtrl1 ja shCtrl2 vastaavasti ja valitut hygromysiinillä (100 ug /ml). Yksittäisiä klooneja laajennettiin ja testattiin TP53- Knockdown tehokkuutta qRT-PCR (tuloksia ei ole esitetty) ja immunoblottauksella.

Tulokset

Sagopilone efficaciously estää leviämisen NSCLC solulinjojen nanomoolialueella

antiproliferatiivista aktiivisuutta SAG ja PAC tutkittiin 6 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat eri alatyyppejä (adenokarsinooma: A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522, okasolusyöpä: NCI -H226; suuret keuhkosyöpä: NCI-H460) käyttäen

in vitro

proliferaatiomäärityksessä (Fig. 1A). SAG esti keuhkojen kasvainsoluproliferaation kaikissa solulinjoissa, jossa IC50-arvot vaihtelevat 0,2-3,3 nM, ja oli tehokas subnanomolaarisissa pitoisuudet (≤1 nM) viidessä kuudesta solulinjoissa. Lisäksi SAG oli jatkuvasti tehokkaampi kuin PAC.

1A, SAG ja PAC inhiboivat keuhkosyöpään solulinjoissa. Kuusi eri keuhkosyövän solulinjoja käsiteltiin SAG tai PAC 72 tuntia. Kasvu mitattiin kristallivioletilla määrityksessä. Keskimääräinen IC 50-arvot mittana puoli-maksimaalisen kasvun esto ja keskihajonnat on esitetty. 1B, immunofluoresenssi α-tubuliinin (vihreä) ja DNA (punainen) A549 keuhkosyövän solut inkuboinnin jälkeen joko vehikkelillä (0,1% etanolia), 2,5 nM tai 40 nM SAG. Mittakaava = 20 um. Edustavia kuvia välivaiheen ja mitoosin solut näkyvät. 1C, FACS-analyysi A549 vehikkeliä, 2,5 ja 40 nM SAG tai 4 nM ja 40 nM PAC 18 tunnin paljasti G2 /M pidätys 40 nM SAG tai PAC ja lisääntynyt määrä solujen 2 N ja 2N DNA: n määrä ja rikastumisen G

0 /G

1 vaihe solusyklin 2,5 nM SAG tai 4 nM PAC. 1D, Apoptoosin induktio lisäämällä pitoisuuksia SAG A549-soluissa. A549-soluja inkuboitiin 72 tuntia ajoneuvon tai 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, 40 nM tai 100 nM SAG. Lisäksi solut värjättiin 3,3′-dihexyloxacarbocyanine jodidia (DiOC6 (3)) ja propidiumjodidia FACS-mittausta. Valkoiset palkit osoittavat keskimääräistä solujen prosenttiosuus ominaista lasku ΔΨm (ΔΨm matala) ja mustat palkit ilmaisevat solujen ΔΨm matala ja korkea propidiumjodidilla signaali (PI + ja ΔΨm matala) johtuen solukalvon repeämisen. Keskiarvo kolmen erillisen kokeen ja keskihajonta on annettu.

Sagopilone häiritsee solun tukirangan toimintojen ja indusoi apoptoosia A549- soluissa

Lisätutkimukset yleisestä toimintatavasta SAG tehtiin kanssa A549 mallina solulinja. Ajoneuvo-käsiteltyjen A549-solut osoittivat normaalia mikrotubulusten leviäminen interfaasivaiheessa soluissa ja tyypillinen kaksisuuntainen karaa congressed kromosomien at metafaasivaiheen levy mitoosi soluissa (Kuva. 1 B). Sen sijaan, kun A549-soluja inkuboitiin 40 nM SAG merkitty mikrotubulia niputtamista interfaasivaiheessa soluissa oli nähtävissä, joka johti epätavallisen kara organisaatio metafaasisoluihin, useita kara pylväät, useat levyt congressed kromosomeja, ja epäsäännöllinen kromosomaalisen linjaus. Nämä solu vaikutukset olivat annoksesta riippuvia ja myös nähnyt inkubaation jälkeen 2,5 nM SAG, mutta vähemmässä määrin.

Effects of SAG ja PAC solusyklin etenemisen mitattiin A549

in vitro

FACS-analyysi (Fig. 1 C ja täydennyskuvio. S1). Kaksi eri fenotyyppejä havaittiin: Pieniä pitoisuuksia SAG tai PAC (0,5-5 nM ja 2-7 nM) indusoi poikkeava solunjakautumisen johtaa muodostumista suuremman prosenttiosuuden aneuploidi solujen DNA sisältöä 2N tai 2N, mutta vain hieman enemmän prosenttiosuuden solut G2 /M vaiheessa. Eri fenotyyppi havaittiin korkeammilla pitoisuuksilla SAG ja PAC ( 10 nM): Tässä dramaattinen kasvu prosenttiosuus solujen G2 /M vaiheessa havaittiin (Fig. 1 C ja täydennyskuvio. S1). Kaikkien lisäanalyyseja kahden eri fenotyyppejä, kaksi konsentraatiota käytettiin mikä aiheuttaa joko aneuploidi fenotyyppi eli 2,5 nM SAG tai 4 nM PAC tai mitoosi pidätyksen fenotyyppi eli 40 nM SAG tai PAC.

Keskittymä -riippuvaista apoptoosin SAG havaittiin FACS-analyysillä sen jälkeen, kun 72 tunnin inkuboinnin jälkeen. Mielenkiintoista on, että hoidon pieninä pitoisuuksina SAG (2,5, 5, ja 10 nM) esti tehokkaasti solujen lisääntymistä, mutta indusoi vain vähän apoptoosia, kun taas korkea pitoisuus SAG hoitoja (40 nM ja 100 nM) johti voimakas apoptoosin induktiosta A549-soluja ( kuva 1 D).

Strong vaikutuksia korkea pitoisuus, mutta ei alhainen pitoisuus sagopilone-hoidon muutoksista genominlaajuisten geeniekspressiota A549

RNA eristettiin A549-soluja, hoitamaton , ajoneuvon ohjaus-käsitelty, sekä käsiteltiin kaksi konsentraatiota kunkin SAG (2,5 nM ja 40 nM) ja PAC (4 nM ja 40 nM) 18 tuntia, ja hybridisoitiin Affymetrix HGU133Plus2.0 taulukot. Laadukas geenin ilmentymisen tulokset saatiin. Periaate komponenttien analyysi (PCA), joka perustuu ilmaus kaikkien geenien paljasti kaksi pääryhmään: Yksi klusterin sisälsi käsittelemättömän, ajoneuvon saaneista ja alhainen pitoisuus SAG (2,5 nM) – tai PAC-käsitelty (4 nM) näytettä, kun taas näytteet käsiteltiin suuria pitoisuuksia (40 nM) ja SAG tai PAC muodostavat erillisen klusterin (Fig. 2A, 2B), mikä osoittaa, että hoito on alhainen lääkeaineen pitoisuus SAG tai PAC indusoi vain suhteellisen pieniä geenin ilmentymisen muutoksia verrattuna käsittelemättömiin näytteitä, kun taas korkea lääkepitoisuus SAG tai PAC aiheuttama vahvempi geenien ilmentymisen muutoksia.

2A ja 2B. Periaate Component Analysis (PCA) microarray tietojen A549-solut käsittelemättömiä (harmaa), ajoneuvo-käsiteltyjen (tummanharmaa), tai käsiteltiin 2,5 nM (sininen) tai 40 nM SAG (tummansininen) ja 4 nM (vihreä) tai 40 nM PAC (tummanvihreä) 18 tunnin ajan. Jokainen merkitty pallo edustaa ilmentymisprofiilin yksittäisen näytteen n = 5 itsenäistä biologista rinnakkaista sen projektio tiedot kolmen ensimmäisen pääkomponentit, osuus suurin osa vaihtelua data (merkitty akselit). Näkymät kahdesta eri näkökulmasta (Fig. 2A, 2B) esitetään visualisoida klusterointi.

Pariksi t-testit vertaamalla kussakin testiryhmässä ajoneuvon saaneissa ryhmissä tehtiin ja tulokset näytetään Volcano plot (täydennyskuvio. S2) kuvaa merkityksen funktiona kertaiseksi muutoksen. Neljä geeniä luettelot generoidaan kynnys parametrit P-arvon ja taita muutos korkean ja matalan pitoisuuden hoitoja sekä yhdisteitä, kuten on kuvattu taulukossa 1, yhdessä kokonaismäärä ja lukumäärä ylä- ja alas geenien. Geeni luettelot saadut tilastolliset testit verrattiin käyttämällä Venn kaavioita. Vuodesta yhteensä 503 geenien säätelee 40 nM PAC ja 593 40 nM SAG 391 geeniä molemmat säätelevät sekä hoitoja, mikä osoittaa paikallista geenit vaikuttavat suuren pitoisuuden kummankin TBAs. Geeni ontologia (GO) analyysi 391 geenien kanssa GeneGo Metacore ohjelmisto paljasti samanlaisen esiintyminen ja paremmuusjärjestykseen biologisten prosessien (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa hyvin samankaltainen vaikutusmekanismi molempien TBAs suurina pitoisuuksina. Sen sijaan, kun verrataan 593 geenejä säätelee 40 nM SAG kanssa 221 geenit vaikuttavat hoito 2,5 nM saman lääkkeen vain 41 geeniä yleisesti säätelevät sekä lääkeainepitoisuuksien ja niukka yhdeksän geenit yleisesti säätelee 40 nM ( [32]. [35]. [37]. [15].