Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

arkaluonteisia biomarkkereiden havaitsemiseksi munasarjasyöpä on korkea kliininen merkitys varhaiseen toteamiseen ja /tai seurantaan tauti uusiutuu. Olemme kehittäneet järjestelmällisesti monivaiheinen biomarkkereiden löytö ja todentaminen strategia tunnistaa ehdokas DNA metylaatio merkkiaineita veri perustuva tunnistus munasarjasyövän.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käytimme Illumina Infinium alustan analysoida DNA metylaatiostatuksen 27578 CpG sivustoja 41 munasarjojen kasvaimia. Käytimme markkeri valikoimastrategiassa joka korosti herkkyyttä vaatimalla johdonmukaisuus metylaation poikki kasvaimia, samalla saavutetaan spesifisyyttä ilman markkereita metylaatiospesifisiin hallita valkosolujen tai seerumin DNA. Meidän varmennusteknologia mukana kyvyn testauksen tunnistettujen merkkiaineiden seurata tautikuormituksesta sarjatuotannossa kerätään seeruminäytteistä munasarjasyöpä potilasta, joille oli tehty kirurginen kasvaimen resektiota verrattuna CA-125 tasoilla.

tunnistettu yksi merkki,

IFFO1

promoottorin metylaation (IFFO1-M), joka on usein metyloitunut munasarjojen kasvaimia ja että on harvoin havaitaan veressä normaalia valvontaa. Testattuna 127 sarjatuotantona kerätään seerumeista munasarjasyöpä potilaille, IFFO1-M osoitti jälkeinen resektio kinetiikka merkittävästi korreloi seerumin CA-125 mittausten kuusi 16 potilasta.

Johtopäätökset /merkitys

toteutimme tehokas markkeri seulontaan ja todentaminen strategia, joka johtaa tunnistamiseen IFFO1-M kuin veripohjaisten ehdokas merkkiaine herkkyydellä munasarjasyöpä. Seerumin IFFO1-M näytetään jälkeisiä resektio kinetiikka sopusoinnussa heijastus taudeista. Arvioimme, että IFFO1-M ja muut ehdokas markkereita nousemassa tämän merkin kehitys putki voi tarjota taudin havaitsemiseksi, jotka täydentävät nykyisiä biomarkkereita.

Citation: Campan M, Moffitt M, Houshdaran S, Shen H, Widschwendter M, Daxenbichler G, et ai. (2011) Genome-Scale Screen DNA Metylointi perustuva tunnistus tussit munasarjasyöpä. PLoS ONE 6 (12): e28141. doi: 10,1371 /journal.pone.0028141

Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: toukokuu 10, 2011; Hyväksytty: 02 marraskuu 2011; Julkaistu: 7. joulukuuta 2011

Copyright: © 2011 Campan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Munasarjojen Cancer Research Fund, myöntää PPD /USC.06, ja National Institutes of Health ja National Cancer Institute, myöntää R01-CA096958. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: PL on konsultti ja tieteellinen neuvottelukunta jäsenenä Epigenomics AG. Hänellä myönnetyt patentit koskevat MethyLightT teknologiaan, joka on lisensoitu Epigenomics AG. Tätä työtä ei tue Epigenomics AG. Epigenomics ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu tai analysointi päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Lisäksi PL ja MC on nimetty keksijät on vireillä patenttihakemus Digitaaliset MethyLightT tekniikkaa. Patentit ja suhdetta Epigenomics eivät muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Toinen Kirjoittajat ilmennyt mitään mahdollisia kilpailevia kiinnostusta.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava syy gynekologisten syöpäkuolemista ja viides johtava syy kaikkien syöpään liittyvien kuolemien naisilla. On arvioitu, että yksi nainen 72 kehittää munasarjasyövän elinaikanaan Yhdysvalloissa, ja että yksi nainen 96 kuolee tähän sairauteen [1]. Viiden vuoden eloonjäämisaste on voimakkaasti vaihe-riippuvainen [2], [3] kanssa oli 94%, vaiheen I sairauden ja 28% vaiheessa IV sairaus [1].

Koska alkuvaiheessa tauti on usein oireeton, ja ei ole tehokasta seulonta strategiaa, useimmat potilaat (62%) läsnä myöhäisvaiheen (III ja IV) sairaus, jossa syöpä on levinnyt koko vatsaonteloon tai muissa elimissä [1]. Yli 85%: lla, edenneen taudin uusiutumisen lopettamisen jälkeen ensisijainen hoito, vaikka aluksi hyvä vaste [4], [5]. On odotettavissa, että tehokkaita menetelmiä havaitsemiseksi oireeton munasarjasyöpä ennen invaasiota ja etäpesäkkeiden tapahtunut vähentäisi huomattavasti kuolleisuutta tähän tautiin. Herkkyydellä menetelmiä voitaisiin soveltaa myös seurantaan uusiutunut jälkeen kasvaimen resektiota kanssa tai ilman adjuvanttia kemoterapiaa.

Tällä hetkellä ei ole mitään hyvää biomarkkereiden tai kuvantamisen lähestymistapa riittävällä herkkyys ja spesifisyys havaitsemiseksi prekliinisen munasarjasyöpä [6 ]. Kaksi proteiini-pohjainen biomarkkerit, CA-125 ja HE4, on kliinisesti hyväksytty mittaamaan sairauksien esiintyvyys ja arvioida munasarjasyövän hoitoon [7], [8]. Näitä markkereita ei koholla kaikissa munasarjojen kasvaimia ja ei ole riittävästi positiivinen ennustearvo väestöpohjaisia ​​arviointiin, tai varhaiseen havaitsemiseen. Koska rajoitukset nykyisten lähestymistapojen on kiireellinen tarve kehittää tehokkaampia strategioita havaitsemiseksi prekliinisen munasarjasyövän riittävän ajoissa hoitoon onnistuisi. Koska munasarjasyöpiä ovat heterogeenisiä, jossa tuntematon solujen alkuperä ja huonosti synnyssä [9] merkitsin löytö prosessien tulisi luottaa suurikapasiteettisten teknologiaan perustuvia lähestymistapoja sijaan mekanistinen perustuva merkki löytö strategioita. Myös merkkiaineita munasarjasyöpä pitäisi pystyä havaitsemaan kasvaimia satoja kertoja pienempi kuin kliinisesti ilmeinen serous syövät tyypillisesti käytetty arvioitaessa biomarkkereiden suorituskyky [10].

Epigeneettiset biomarkkerit ovat viime aikoina nousseet vaihtoehtoina proteiinia biomarkkereita varten syövän varhainen havaitseminen [11] – [13], mukaan lukien munasarja- syöpiä [14] – [17]. Poikkeava DNA hypermetylaation havaitaan usein syöpäsoluissa [18]. Syöpäpotilaat ovat kohonneet vapaan DNA kiertävän verenkiertoon [19]. Syöpään liittyvä poikkeava DNA: n metylaatio, alkunsa ainakin osittain tuumorisoluissa, voidaan havaita seerumin tai plasman DNA syöpäpotilaiden [11], [12]. Metyloitua DNA on kemiallisesti ja biologisesti stabiili, helposti havaittavissa monenlaisia ​​kehon nesteiden ja sopii siksi erityisen hyvin veripohjaisten syövän havaitsemiseen [11] – [17]. Kuitenkin rajoitettu määrä DNA: n metylaatio markkereita tällä hetkellä saatavilla sovelletaan vain pieni murto-osa munasarjojen syöpien [14] ja ne ovat epäspesifisiä, kun taas tunnistus tekniikoita puuttuu herkkyys, ovat suurelta osin geeli-pohjainen, ja ne ovat ei-kvantitatiivinen [15] – [17]. Viimeaikaiset edistysaskeleet DNA metylaatiomääritystä avulla on mahdollista lisätä DNA metylaatio markkeri löytö läpikulkumäärän samanaikaisesti analyysin tuhansia genomisen loci [20], [21] ja jotta äärimmäisen herkkiä havaita hyvin pieniä määriä metyloitua DNA: ta kvantitatiivisesti [22], [23].

tässä tutkimuksessa, teimme suuren mittakaavan systemaattinen markkeri löytö DNA: n metylaatio markkereita munasarjasyövän, jotka eivät ole läsnä veressä naisten ilman munasarjasyövän. DNA: n metylaatio markkereita on todettu olevan kohtalaisia ​​kliinisiä herkkyyttä monissa aiemmissa raporteissa. Harkittaessa miten parantaa herkkyyttä DNA: n metylaatio markkereita, totesimme, että metylaatiostatuksen normaali munasarja ei ole merkitystä, kunhan normaali munasarja DNA ei normaalisti vuoda verenkiertoon ja markkereita ovat negatiivisia myös terveiden. Siksi olemme muuttaneet löytö strategiaa keskittyä verrata suoraan kasvaimen vs. verta, toisin kuin kasvain vs. normaalia kudosta. Meidän valintaprosessissa korostimme merkki herkkyyttä vaatimalla johdonmukaisuus kasvain metylaation, ja merkki spesifisyys jättämällä merkkiaineita metylaatiospesifisiin hallita valkosolujen tai seerumin DNA. Olemme tunnistaneet lupaava ehdokas DNA: n metylaatio markkeri, IFFO1-M, jota testattiin veripohjaisten biomerkkiaineen harvoissa tapaus ja kontrolliseerumeita. Todistamaan, että ehdokas IFFO1-M merkki toimenpiteitä tautikuormituksesta veressä, analysoimme ajallinen malleja IFFO1-M tasot sarja verinäytteitä laadittu ennen ja jälkeen resektio primaarikasvaimen, ja verrataan näitä validoitu merkkiaine tauti taakka, CA-125. Tämä sisäinen aihe vertailun avulla jokainen potilas toimimaan oman ohjaus, ilman vaihtelua geneettisen taustan välillä sarja- verinäytteet. Tässä tutkimuksessa raportoimme määrälliseen digitaalinen analyysi IFFO1-M sarja näytteitä yhdeksän potilasta, yhteensä 127 verinäytettä.

Methods

Ethics lausunto

tutkimus tehtiin noudattaen Helsingin ihmisillä opin ja hyväksyi Institutional Review Boards instituuttien mukana tutkimuksessa: Duke University Medical Center (Durham, USA), Keck School of Medicine, University of Southern California ( Los Angeles, USA), ja Innsbruckin yliopistollisessa sairaalassa (Innsbruck, Itävalta). Allekirjoitettu suostumus saatiin kaikilta TET keräämistä näytteistä ja niiden myöhempää analysointia varten.

Potilaille ja valvontaa näytteen keräämiseen ja käsittelyyn

41 munasarjakasvain näytteitä käytetään Infinium perustuva merkki tietojenkeruuvaiheessa tutkimuksen saatiin potilailta, jotka leikattiin kaksi instituutiot, Duke University Medical Center (30 näytettä) ja University of Southern California Medical Center (11 näytettä). Kaikki kasvain näytteet saatiin potilailta, jotka kirjallisia tietoista suostumusta, joka hyväksyttiin Institutional Review Boards vastaavien laitosten. Niistä kasvain kerätyistä näytteistä oli yksi sekoitettu (selkeä solu ja endomet-), kolme kirkas solu, neljä mucinous, neljä endomet-, ja 32 serous munasarjan epiteelin karsinoomanäytteistä (taulukko S1). Kasvaimen kudokset olivat flash-jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käsittelyyn asti. Perifeerisen veren valkosolujen (PBL) ja plasman käytettyjen näytteiden löytö ja todentaminen vaiheissa saatiin 10 tervettä postmenopausaalista naista, joiden bloods olivat kaupalliselta (HemaCare Corporation). Plasma eristettiin verestä kerätään putkiin, jotka sisältävät EDTA. Putkia sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 300

g

4 ° C: ssa. Irrottamatta plasman jälkeen koeputkesta ensimmäisestä sentrifugoinnista, me kehrätty putket vielä 10 minuutin ajan 1600

g

4 ° C: ssa. Erotettu plasma siirrettiin mikrosentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin uudelleen 16.000

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes valmis käytettäväksi. Ohut ääreisverivalkosolut kerros, joka sedimentoitiin edellä punasoluja otettiin talteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes valmis käytettäväksi DNA: n uuttaminen.

DNA uutettiin kudoksista käyttäen standardimenetelmiä. DNA uutettiin PBL-näytteen käyttäen QIAamp® DNA Veri (Qiagen), kun taas vapaa-DNA plasmasta ja seerumista eristettiin käyttäen QIAamp® UltraSens Virus Kit (Qiagen). Molemmissa kokeissa DNA uutettiin seuraten valmistajan ohjeita.

verinäytteestä käytetään pituussuunnassa analyysit kerättiin 16 potilasta hoidettiin munasarjasyöpä välillä 1992-2000 laitoksella Naistenklinikka, Innsbruckin yliopistollisessa sairaalassa (Innsbruck, Itävalta) noudattaen ja hyväksytty Innsbruckin yliopiston Institutional Review Board. Kliiniset ja patologiset ominaisuudet näistä potilaista on lueteltu taulukossa S3. Ensimmäiset verinäytteet piirretty, kutsutaan perustason näytteet otettiin ennen leikkausta yksitoista potilaista ja useita päiviä leikkauksen jälkeen viidellä potilaalla (katso täydelliset tiedot taulukossa S4). Muita verta kerättiin kaikilta potilailta kullakin seurantakäynti jaksoilla ajat vaihtelevat 37-246 viikkoa (taulukko S4). Seerumin eristäminen, veren annettiin hyytyä 1-4 tuntia huoneenlämmössä (RT) ja sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 2000

g

huoneenlämpötilassa. Seerumi eristettiin hyytymä, alikvootteihin mikrosentrifugiputkiin, ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Kontrolliseerumeita kahdeksasta tervettä naista otettiin kaupalliselta (Innovative Research). Vapaan, verenkierrossa kiertävän DNA eristettiin potilaiden ja verrokkien seerumeita käyttämällä QIAamp® UltraSens Virus Kit (Qiagen) seuraten valmistajan ohjeita. Tasot CA-125 määritettiin mikro-hiukkasten entsyymi-immunomääritys (MEIA) käyttäen IMX analysaattori (Abbott Laboratories).

DNA metylointianalyysi

Kaikki DNA näytteet altistettiin bisulfiittimodifikaatio käyttämällä EZ DNA metylointi Kit (Zymo Research) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jotta Infinium-analyysi, 1 ug genomista DNA: ta kustakin näytteestä oli bisulfiitti muunnetaan 96-kuoppalevyformaatissa käyttäen EZ96 DNA: n metylaation kit (Zymo Research). Laatu ja määrä bisulfiitti-muunnettu DNA, sekä täydellisyyttä bisulfiittikonversion, arvioitiin käyttäen paneelia laadunvalvonta reaktioita kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Seuraavat muuntaminen modifioitu DNA eluoitiin 18 ul: ssa eluutiopuskuria pakkauksen mukana, ja 5 ui kutakin näytettä käytettiin Illumina Infinium DNA: n metylaation määrityksessä valmistajan ohjeiden mukaisesti.

MethyLight analyysi, 1 ug genomista DNA: ta kustakin kasvain ja PBL näyte käsiteltiin bisulfiitin avulla Zymo EZ DNA metylaatio kit (Zymo Research). Samoin Zymo EZ DNA metylaatio kit käytettiin vetysulfiitilla muuntaa uutettu DNA plasma- tai seeruminäytteiden. Yleensä 1 ml plasmaa tai seerumia käsiteltiin yhdessä sarakkeessa Zymo kit. Puhdistuksen jälkeen kaikki bisulfiitti modifioitu DNA-näytteet eluoitiin 10 ui eluointipuskuria ja edelleen laimennettiin seuraavasti: PBL-DNA laimennettiin lopulliseen pitoisuuteen 0,5 ng /ul. Kasvain DNA laimennettiin perustuen syklin kynnys (Ct) on ALU-pohjainen MethyLightTM reaktion. Vain DNA: t, joilla on Ct on vähemmän kuin 21 tämän ALU-pohjainen reaktiossa käytettiin myöhempiä analyysejä [24]. Plasman DNA laimennettiin siten, että jokainen 1 ui muunnettua DNA: ta oli 10 ui alkuperäistä määrää plasman tai käytetyistä seerumeista. Kunkin MethyLight reaktio 10 ui laimennettua kasvain, PBL tai plasmasta vetysulfiitilla muunnetulle DNA: ta käytettiin. Digital MethyLight analyysi, koko määrä DNA: ta 1 ml seerumia oli bisulfiitin muunnetaan, ja näytteet laimennettiin siten, että jokainen 1 ui kutakin bisulfiitti-muunnettu DNA-näyte edusti 1 ui alkuperäistä seerumia käytetty määrä. Kunkin Digital MethyLight analyysi, 100 ui laimennettua DNA: ta käytettiin.

Infinium analyysi suoritettiin USC Epigenome keskelle käyttäen HumanMethylation27 BeadArray (Illumina). Protokollat ​​ja koetin ovat osoitteessa www.illumina.com. Tulokset Infinium määritys koottiin kunkin lokuksen Illumina BeadStudio ohjelmistoa (Illumina) ja raportoidaan beta (β) arvoihin, jotka ovat DNA: n metylaatio tulokset vaihtelevat 0-1, jotka vastaavat murto-DNA: n metylaation tason yhden CpG [ ,,,0],20]. Infinium analyysitulokset ovat ladattavissa Gene Expression Omnibus (GEO) tietovarastoon National Center for Biotechnology Information (NCBI) tulonumerolla GSE26989 (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ? acc = GSE26989).

MethyLight määritys ja tietojen analysointi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [22], [25]. Alukkeet ja koettimet nämä analyysit on lueteltu taulukossa S2. Digital MethyLight määritys ja tietojen analysointi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23] kanssa, sillä erolla, että PCR-reaktiot suoritettiin 10 ui sijaan 30 pl.

Marker valinta

Infinium koettimia, jotka eivät missään näytteistä jätettiin pois analyysistä. Koettimet liittyy yhden emäksen monimuotoisuus (SNP), tunnistettiin käyttäen NCBI dbSNP rakentaa 126 ja 128, tai toistuvia elementtejä tunnistaa RepeatMasker myös ulkopuolelle. Kaksi PBL-näytteen analyysissä käytetyt ajettiin kahtena annetun Infinium DNA: n metylaation alustan ja keskimäärin β arvot jokaisesta näytteestä käytettiin merkki suodatus. Olemme poisti koettimien kanssa β arvo on suurempi tai yhtä suuri kuin 0,2 tahansa kahden keskimäärin PBL-näytteen. Olemme tunnistaneet kasvaimen näytteen pienin DNA: n metylaation arvo (T

L) ja PBL näyte, jolla on korkein DNA: n metylaation arvo (PBL

H) kunkin anturin ja me lasketaan erotus ß-arvot näiden kahden näytteet (T

L- PBL

H). Koettimet paremmuusjärjestykseen perustuvat tämän eron, ja koettimet, jolle erotus oli vähemmän tai yhtä suuri kuin 0 eliminoitu.

tarkastaminen 15 kärkipään markkereita käyttäen Cancer Genome Atlas (TCGA) tiedot

SS arvot 15 kärkipään markkereita haettiin julkisesti saatavilla DNA metylaatio aineisto varten serous munasarjasyöpiä lähetetty TCGA Data Portal (htpp: //tcga-data.nci.nih.gov/tcga) . Vertasimme jakelu Infinium syntyvän β arvot näiden 15 merkkiaineiden kaikissa 41 munasarjasyöpä näytteitä tai vain 29 vakavasta munasarjasyöpiä Tämän tutkimuksen ne, jotka saatiin 284 serous munasarjasyövän näytteitä TCGA tutkimuksessa ja yhteensä 10 normaali PBL-näytteen avulla piste-kaavioita päässä GraphPad Prism Software (GraphPad Software Inc.).

tilastollinen

kyky IFFO1-M erottamaan tapauksen ja kontrollinäytteiden arvioitiin piirtämällä vastaanotin käyttöominaisuudet käyrä, joka liittää todellinen positiivisten määrä (herkkyys) ja väärien positiivisten määrä (1-spesifisyys) ja laskemalla ala käyrän alla (AUC). 95%: n luottamusväli (CI) AUC laskettiin vuoteen 2000 bootstrap näytteitä proc R paketti [26]. Pearsonin korrelaatiokerroin (Pearsonin r) laskettiin mittaamaan aste korrelaatio IFFO1-M DNA metylaatiotasoilla ja CA-125 tasot kunkin yhdeksän potilasta. Tilastollinen testi vastaan ​​hypoteesia, että r = 0 suoritettiin ja

p

arvo sulku 0,05 käytettiin julistaa merkitystä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen R 2.13 ohjelmisto.

Tulokset

DNA: n metylaatio perustuva merkki löytö putki

laatinut kattavan ja järjestelmällinen strategia tunnistaa ja arvioida veren- pohjainen DNA: n metylaatio merkkiaineita munasarjasyöpä, jotka ovat vain läsnä veressä yksilöistä kärsii taudista. Kuvio 1 havainnollistaa vaiheita me sitoutuneet saavuttamaan tämän tavoitteen. Kukin näistä vaiheista kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä.

Infinium alustaa käytettiin seulomaan 27578 koettimia edustavat 14489 yksittäisen geenin lokusta. Käytimme järjestelmällisesti vaiheittain poistamaan koettimia, jotka eivät missään näytteistä, koettimet, jotka sisälsivät SNP: tai toistosekvenssit, tai koettimia, joilla on beeta-arvo on suurempi kuin 0,2 missään PBL-näytteen. Jäljellä olevat koettimet paremmuusjärjestykseen, joka perustuu niiden välisen eron kasvaimia ja veren (katso materiaalit ja menetelmät), ja koettimia, joilla on korkeampi DNA: n metylaation PBL kuin missään kasvainnäytteet eliminoitu. Top 15 jäljellä 517 markkereita siirtynyt MethyLightT alustan muita tarkastuksia. Kaikki 15 markkereita läpäisseet riippumattoman tarkastuksen tehtävä koe julkisesti saatavilla TCGA munasarjasyöpä aineisto ja ylimääräisiä PBL-näytteen. Kolme markkereita epäonnistui yhteensopimattomuudesta liittyviä kysymyksiä MethyLightT alustalle, kun taas toiset kymmenen epäonnistui, koska he olivat metyloituja normaalissa PBL DNA (3 markkereita) tai normaalia plasmaa (7 markkereita). Vain yksi merkki,

IFFO1

, valittiin jatko- tarkastusta potilaiden näytteistä Digital MethyLightTM. (Tähti osoittaa koettimia, jotka eivät missään näytteistä, samoin kuin ne, jotka sisältyvät SNP: ja toista sekvenssit).

Seulonta ja valinta DNA: n metylaatio merkkiaineita munasarjasyöpä

ensin toteutettiin laajamittainen DNA metyloituvuutta 41 munasarjasyövän näytteet (taulukko S1) ja kaksi PBL näytettä taudista vapaan postmenopausaalisilla naisilla. Käytimme Infinium DNA: n metylaation BeadArray, että samanaikaisesti kyselee DNA metylaatiostatuksen 27578 koettimien ulottuu 14489 ainutlaatuinen geenipaikkojen. Aloitimme markkeri valintaprosessin suodattamalla pois kaikki antureista joka epäonnistui (havaitseminen p-arvo 0,05) missään näytteissä, sekä koettimet, jotka sisältävät yhden nukleotidin polymorfismien (SNP: t) [27], ja toista sekvenssit (Fig. 1 ja 2A). Me seuraavaksi poistaa kaikki koettimet, joilla on korkea DNA: n metylaation tasoilla PBL (β 0,2 Jonkin PBL näyte) (Fig. 1). Loput 13628 koettimet (8701 ainutlaatuinen geenit) on sijoittunut laskevassa järjestyksessä perustuu algoritmiin, joka laskee ero ainakin metyloitu munasarjakasvain näyte ja kaikkein metyloitu verinäyte kunkin koettimen (Fig. 1 ja 2B) (Materiaalit ja menetelmät ). 554 koettimet (517 ainutlaatuinen geenejä), joilla on korkeampi DNA: n metylaation missä tahansa munasarjojen kasvaimia verrattuna kaksi normaalia verinäytteet säilyttää tulevaa arviointia (Fig. 1 ja 2C). Me seuraavaksi suoritetaan vahvistavaa analyysiä kanssa top 15-paremmuusjärjestykseen markkereita (Fig. 1 ja 2D). Valinta testaus vain tämä rajallinen määrä markkereita motiivina oli kustannuksia ja potilaan näytteen saatavuuden rajoitteiden.

A 12194 markkereita jäljellä poistamisen jälkeen anturit joka epäonnistui missään näytteissä, ja koettimista jotka sisältävät SNP tai toistuvia elementtejä. Merkit sijoittui nousevassa järjestyksessä, joka perustuu keskimääräisen DNA metylaatio β arvo kaksi PBL-näytteen. B 8701 markkereita jäljellä eliminoinnin jälkeen koettimien DNA: n metylaation β values≥0.2 tahansa kahden PBL-näytteen. Koettimet rankattiin laskevassa järjestyksessä erotuksen perusteella DNA metylaatio välillä kasvain on pienin β arvo (T

L) ja PBL näyte, jolla on korkein β-arvo (PBL

H). C, 517 markkereita, joilla on korkeampi DNA: n metylaation arvoja tahansa kasvain kuin missään PBL-näytteen. Merkit ryhmitellään laskevassa järjestyksessä perustuvat ero kasvainten ja PBL DNA metylaatio arvoja. D, kärkipään 15 markkereita, jotka oli siirtynyt MethyLightT alustan muita tarkastuksia.

Riippumaton arviointi toistettavuus top 15-paremmuusjärjestykseen päättäjät

Koska määrä munasarjojen syöpä käytettyjen näytteiden seulonnassa askel oli suhteellisen pieni, me käytti julkisesti saatavilla TCGA DNA: n metylaatio tietoja vakavasta munasarjasyöpiä [28] vahvistaa suorituskykyä 15 kärkipään merkkiaineita itsenäisessä suurempi aineisto. Tämä analyysi helpotti se, että TCGA data luotiin käyttäen samaa tekniikkaa kuin tutkimuksessamme. Jakauma DNA: n metylaation beeta-arvot kaikille 15 markkereita kahdessa kasvaimen aineistot (tässä tutkimuksessa (PS) ja TCGA) verrattuna joukko kymmenen terveillä verrokeilla PBL-näytteen on esitetty kuvassa 3. Valikoima DNA: n metylaation arvojen kokeellinen sarja 41 vakavien, mucinous, kirkas-solu, ja endomet- munasarjojen syöpien oli samanlainen kuin 284 vakavien munasarjasyöpä näytteitä TCGA, jossa molemmat osoittavat paljon suurempi DNA metylaatiotasoilla kuin kymmenen terveillä verrokeilla PBL-näytteen. Tulokset eivät eronneet kun analyysi rajoitettiin 29 41 munasarjasyöpä potilailla, joilla on vakavien histologia (tuloksia ei ole esitetty).

Infinium johdettu β-arvot (Y-akseli) ylimmän 15- sijoittui merkkejä verrattiin tässä tutkimuksessa (PS) datajoukon (41 munasarjasyöpiä sekalaisen alatyyppejä), The TCGA datajoukon (284 serous munasarjasyöpiä) ja kymmenen normaalin PBL-näytteen. Vaakasuorat viivat edustavat mediaaniarvot kullekin ryhmälle.

MethyLightTM määrityksissä kehitystä ja todentamista kontrollinäytteiden varten 15 kärkipään markkereita

vieressä siirtynyt 15 markkereita on enemmän herkkä PCR-pohjainen DNA: n metylaatio detektiotasot, MethyLightTM ja digitaalinen MethyLightTM. Toisin Illumina Infinium DNA: n metylaatio-antureilla, jotka analyysillä DNA metylaatiostatuksen yhden sytosiini, MethyLightTM perustuvia alukkeita ja koetin kuulustella yhdenmukaisten DNA: n metylaatio useiden metyloitua sytosiinien samanaikaisesti lyhyellä genomin alueella. Niinpä MethyLight tulokset tietyn geneettisen lokuksen voivat poiketa rekisteröinyt Illumina Infinium anturi samassa paikassa, koska läsnä viereisten sytosiinien ja vaihtelua alukkeiden /koetin paikannus. Olimme onnistunut kehittämään MethyLightTM reaktiot 12 15 ehdokkaan markkereita (taulukko S2). DNA-sekvenssit vieressä Infinium suunnattu sytosiinit kolme 15 merkkiaineet olivat ei sovi MethyLight suunnittelu (Fig. 4). Ylimääräinen markkeri poistui putken koska se ei ole täydentää

in vitro

metyloituja (M.SssI-käsitelty) kontrolli-DNA (Fig. 4). Me altistetaan loput 11 markkereita on tinkimättömiä näytön vastaan ​​ylimäärin PBL DNA (50 ng) kahdesta taudista vapaan postmenopausaalisilla naisilla, jättää DNA metylaatio markkereita, jotka aiheuttaisi tausta ongelmia herkkyydellä munasarjojen DNA: n metylaation markkereita veressä . Tämä MethyLight-pohjainen näyttö saatiin kahdeksan markkereita hyvin alhainen DNA: n metylaation PBL (MethyLightTM sykli kynnysarvot (Ct) yli 35 molemmista näytteistä).

Tekninen hallintalaitteet MethyLightT (ML) alustan johti poistaminen neljä merkkiä (ristissä harmaat laatikot) vuoksi suunnitella yhteensopimattomuuden, ja epäonnistuminen vahvistamaan

in vitro

metyloituja DNA positiivisena kontrollina MethyLightTM reaktiot (M.SssI testi). Yksitoista markkereita testattiin normaali PBL-näytteen käyttämällä ylimäärää PBL DNA: ta (50 ng). Markkereita sykli kynnys (Ct) on suurempi kuin 35 (siniset laatikot) on kaksi normaalia PBL näytteet säilytetään ja merkit, joiden Ct alle 35 (keltainen laatikot) on eliminoitu. MethyLight määrityksissä kanssa Ct-arvojen 35 osoittavat selvästi havaittavia määriä metyloitua DNA näissä loci. Jatkotestauksia normaalissa ohjaus plasmanäytteistä (100 ui) johti niiden seitsemän kahdeksasta jäljellä markkereita. Yksi jäljellä merkki,

IFFO1

, testattiin 15 munasarjasyöpiä eri histologisia alatyyppejä. MethyLightT tulokset normaalin plasman ohjaus ja munasarjasyövän näytteet ilmaistaan ​​Prosenttia Metyloitua Reference (PMR). Siniset laatikot edustavat PMR-arvot olivat alle 10, keltainen laatikot osoittavat PMR-arvot välillä 10 ja 50, kun taas punaiset laatikot merkitsevät PMR suurempiin 50. tyyppisiä munasarjojen kasvaimia käytetään analyysissa ovat seuraavat: kirkas solukarsinoomat (CC), sekoitettu selkeä solujen ja endomet- (CC /E), endomet- (E), mucinous (M), ja vakavien (S).

Nämä kahdeksan markkereita myöhemmin arvioitiin keskittynyt plasmaa DNA-näytteet kymmenestä terve postmenopausaalisilla naisilla, jolloin saatiin vain yksi markkeri,

IFFO1

, lähes huomaamaton DNA: n metylaation kaikissa näissä ohjaus plasmanäytteistä (PMRS 5) (Fig. 4). Seuraavaksi testasimme

IFFO1

15 munasarjakasvaimia eri histologisia alatyyppejä, joista 14 on myös käytetty alkuperäisessä seulonnassa vaiheessa (taulukko S1), ja todettu merkittäviä määriä DNA: n metylaatio (PMR 20) kaikissa kasvaimet analysoitiin (Fig. 4). Tämä on yhteisymmärryksessä Infinium DNA metylointianalyysi samasta kasvain näytteissä (kuvio. 2). Tämä merkki valittiin sen vuoksi myöhemmin kliinisen tarkastusta joukko seeruminäytteitä kerätään pituussuunnassa erilliset munasarjasyöpä potilaille.

IFFO1 geenin promoottori DNA: n metylaatio (IFFO1-M) merkki suorituskykyä seeruminäytteessä

arvioitiin ensin suorituskykyä IFFO1-M markkeri seeruminäytteistä saatuja kahdeksan tervettä vanhemmat naiset valvontaa ja 16 munasarjasyöpä, joilla on pitkälle (vaihe III ja IV) tautia erittäin herkkä ja kvantitatiivinen digitaalinen MethyLightTM määritys [23]. Kliinis ominaisuudet munasarjasyöpä potilaat sisällytetty tähän analyysiin on koottu taulukkoon S3. Tuotos Digital MethyLightTM mitataan laskemalla yksilöllisesti metyloitu DNA-molekyylejä. Olemme havainneet IFFO1-M merkki kaikissa potilaiden näytteistä. Sen sijaan, IFFO1-M havaittiin hyvin pieniä määriä vain kaksi kahdeksasta kontrollinäytteitä (Fig. 5A). Kymmenen potilaiden seerumit oli enemmän IFFO1-M-DNA: n metylaation kuin jokin positiivisista kontrollinäytteistä. Vastaanottimen käyttöominaisuudet (ROC) analyysi joiden arvioitu AUC 0,95 [95% luottamusväli, +0,8359-1] osoitti hyvää syrjivä mahdollisuudet IFFO1-M merkki (Fig. 5B). Koska nämä tulokset on saattanut vaikuttaa eri tavoin valvonnan ja asia näytteet kerätään ja käsitellään jatkoimme testaamista IFFO1-M sarjoittain kerätään seeruminäytteistä munasarjasyöpä potilaille.

, IFFO1-M tasot (ilmaistuna määrä IFFO1-M metyloituja molekyylien havaittu 1 ml seerumia) on perustason näytteitä 16 potilaista ja kahdeksan normaalit kontrollit määritettiin Digital MethyLightTM. Määrä molekyylien potilaan # 1 on oletusarvo, sillä laskee yli 15 osumaa /96-kuoppalevylle /100 ui testattu voisi heijastaa useamman kuin yhden molekyylin /hyvin. Histologinen alatyyppi kasvainten on sulkeissa seuraavasti: vakavien (S), mucinous (M), ja endomet- (E). Tähdet osoittavat potilas, jolta näytteitä käytettiin seuraavassa pituussuunnassa analyysi. B, vastaanotin toimii ominaiskäyrä IFFO1-M. AUC = AUC.

tarkastaminen IFFO1-M merkki pituussuunnassa näyttö toistuvalle munasarjasyöpä

Testasimme onko IFFO1-M markkeri voisi mitata tautikuormituksesta sarjatuotannossa kerätyt seeruminäytteet munasarjasyöpä potilaiden ja verrattiin sen suorituskyky kuin CA-125. Tämä sisäinen aihe vertailun eliminoi tarpeen kontrollinäytteiden koska jokainen potilas toimii oman valvonnan. Seeruminäytteet kerättiin aikoihin leikkaus (perustason näytteet) ja myöhemmissä seurannan tutkimukset 16 munasarjasyöpä potilaille. Perustason näytteet kustakin näistä 16 potilaalta käytettiin edellisessä analyysissä (taulukko S3). Yksitoista perustason näytteet kerättiin ennen leikkausta (keskiarvo = 11 +/- 5 päivää), kun taas viisi heistä kerättiin leikkauksen jälkeen (keskiarvo = 13 +/- 10 päivää) (taulukko S4). Keskimäärin 15 seeruminäytteitä (vaihtelee 8-23) kerättiin seurantakäynnit kustakin potilaita, joiden keskimääräinen ajan ollessa 92 viikkoa (vaihteluväli 37-246 viikkoa).