Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lämpöä sokki proteiineja (HSP) on molekyyli saattajia jotka suojaavat proteiineja vahingoittaa. HSP27 ilmentyminen liittyy syöpään muutosta ja hyökkäystä.

Neidonhiuspuut

uute (EGb761), eniten myyty kasviperäisten täydentää, on angiogeneesin vastainen vaikutus ja indusoi kasvaimen apoptoosin. Tiedot koskevat vaikutusta EGb761 on HSP ilmentyminen rajoittuu, erityisesti syöpää. HSP27 ilmentyminen pariksi kasvaimissa ja normaaleissa keuhkoissa 64 potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) havaittiin reaaliaikaisella PCR, Western blotting ja immunohistokemia. NSCLC solulinjat (A549 /H441) käytettiin tutkimaan vaeltavien kyvyt

in vitro

. NSCLC kudos osoitti korkeampia HSP27 ilmaisun normaalia keuhkokudoksessa. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että NSCLC potilaat, joilla on alhainen HSP27 ilme suhde ( 1) oli merkitsevästi pidempi elinaika kuin ne, joilla on korkea ilme suhde ( 1) (p = 0,04). EGb761 esti HSP27 ilmaisun ja muuttavien kyky A549 /H441-soluissa, joka on sama kuin HSP27-siRNA transfektion vaikutuksen. Lisäksi EGb761 hoito aktivoitu AKT ja p38 ja ei vaikuttanut ilmaus PI3K, ERK, ja JNK polkuja. HSP27 on huono prognostinen indikaattori NSCLC. EGb761 voi vähentää muuttoliikettä kyky A549 /H441 estämällä HSP27 ilmaisu todennäköisimmin kautta AKT ja p38 MAPK polkuja aktivointia.

Citation: Tsai JR, Liu PL, Chen YH, Chou SH, Yang MC, Cheng YJ, et ai. (2014)

Neidonhiuspuut

Ote Vähennykset ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Cell Migration by downregulating Etäpesäke-Associated Factor Heat-Shock Protein 27. PLoS ONE 9 (3): e91331. doi: 10,1371 /journal.pone.0091331

Toimittaja: Prasad S. Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 lokakuu 2013; Hyväksytty: 09 helmikuu 2014; Julkaistu: 11 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Tsai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain apurahan KMU-Q098022 päässä Kaohsiung Medical University, ja myöntää NSC102-2314-B-037-067 National Science Council, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa. Vaikka parannukset sekä diagnostisia ja terapeuttisia menetelmiä, yleinen 5 vuoden pysyvyys on edelleen huono. Huonon ennusteen keuhkosyövän johtuu pääasiassa varhain uusiutumisen, etäpesäke, ja huono vaste hoitoja, kuten leikkaus, kemoterapia, ja sädehoidon [1] – [2]. Puute hyvä prognoosi- biomarkkereiden, joka voi ennustaa hoitovasteen ja ennusteen, vaikuttaa myös hoito-ohjelmat ja hoitotuloksia.

Lämpöä sokki proteiineja (HSP) suuri perhe proteiineja, jotka ovat välttämättömiä hemostatic tehtäviä soluissa fysiologisissa olosuhteissa. Mukaan molekyylipainoja, HSP: t ryhmitellään useisiin alaperheisiin: pieni (HSP 20-30 kDa), Hsp40, HSP60, HSP70, HSP90, ja HSP100. Päätehtävänä HSP on suojata soluja vahingoittumiselta stressaavissa olosuhteissa [3]. Lisäksi niiden cytoprotective vaikutuksia, HSP: t voivat edistää karsinogeneesiä estämällä apoptoosin [4] – [8] ja lisäämällä vastus hoitoon [9] – [10]. Kuitenkin rooli HSP: iden eri kasvaimissa on monimutkainen [4], [9].

HSP27 on sytoplasminen proteiini, joka ilmentyy konstitutiivisesti useissa normaaleissa kudoksissa ja pahanlaatuisia kasvaimia. Sen ilmentyminen on liitetty huonoon ennusteeseen munasarjojen [11], rintojen [9], [12], mahan [13] – [14], maksan [15], ja eturauhasen syövät [16] sekä osteoscarcomas [7] . Pään ja kaulan alueen syöpä [3] ja urogenitaalinen kasvain [17], HSP27 ilmaisu ei ole vaikutusta ennusteeseen. Kuitenkin ennustetekijöiden roolia HSP27 ilmentyminen keuhkosyöpä on alle keskustelu. Zimmermann et ai. [18] raportoitiin, että seerumin HSP27 taso korreloi positiivisesti kehittynyt keuhkosyöpä vaiheissa. HSP27 ilmentyminen voi lisätä chemoresistance ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja on huono indikaattori ennusteeseen [10], [19]. Sen sijaan, HSP27 yliekspressio liittyy parempi eloonjäämisen potilailla, joilla on NSCLC mukaan tutkimuksen mukaan Malusecka et al. [20]. Immunohistokemiallinen värjäys osoitti, että HSP27 ilmentymistä keuhkosyövässä kudosta ei korreloi T (primaarikasvaimen) N (imusolmukkeiden) M (etäpesäke) ja vaiheet [21].

Otteita lehdet

Neidonhiuspuut

on käytetty Kiinassa ja länsimaissa vuosisatoja johtuen niiden antioksidantin ominaisuuksia [22]. Standardi

G. biloba

uute, EGb761 (kaupallinen nimi), sisältää 22% -27% flavonoideja ja 5% -7% terpenoids, jotka ovat tärkeimmät tehoaineet [23]. EGb761 voi kaivella vapaita radikaaleja ja neutraloi lautta ion-induced peroxidants [24]. Näin ollen, EGb761 on hyödyllistä, että ehkäisyyn ja hoitoon degeneratiiviset prosessit, jotka liittyvät oksidatiiviseen stressiin [25] – [26].

Vaikka kemoterapia on edelleen ensisijainen hoito, jota käytetään keuhkosyövän, haitallisia sivuvaikutuksia, jotka liittyvät tähän kohtelu rajoittaa sen käyttöä. Täydentävä lääkkeitä, kuten kasviperäisten lääkkeiden ovat yleistyneet viime vuosikymmeninä. Lisäksi useat kokeet ovat raportoineet, että EGb761 on antituumorivaikutukset. Syövän vastainen ominaisuudet EGb761 ovat syynä antioksidantti, angiogeneesin vastainen, ja geeni-säätelyvaikutukset [24]. EGb761 voi estää kasvaimen proliferaatiota kautta apoptoosin paksusuolensyöpä [27] ja suuontelon syöpä [28]. Vaiheen II yhdistetty hoito, johon 5-fluorourasiilin (5-FU) ja EGb761 on testattu potilailla, joilla on haiman tai kolorektaalisyövän [29] – [30], ja se on saatu lupaavia tuloksia. Tässä tutkimuksessa selvitettiin HSP27 ilmentymistä potilailla, joilla on NSCLC ja analysoidaan suhdetta HSP27 ilmaisun ja kliinisiä tuloksia. Lisäksi vaikutukset EGb761 on HSP27 ilmaisun tutkittiin. Toivomme, että tämän tutkimuksen tulokset antavat lääkäreille uuden yhdistelmän huumeiden hoito ja toimia ennustaja parantamiseksi NSCLC ennustetta.

Tulokset

Demografiset tiedot ja HSP27 ilmentymistä potilailla, joilla on NSCLC

yhteensä 64 potilasta NSCLC oli mukana tässä tutkimuksessa. Näiden, 47 (73%) oli histologisesti todettu olevan adenokarsinooma ja 17 (27%) potilaalla havaittiin olevan okasolusyöpä. Keski-ikä potilailla oli 61,2 ± 9,5 vuotta (vaihteluväli 36-78 vuotta). TNM lavastus ja HSP27 ilmentymistilanne NSCLC potilaiden on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Keskimääräinen HSP27 ilmaus suhde oli 2,05 ± 1,95. Potilaat, joilla on NSCLC metastasiaa ja edennyt (aste IIIb-IV) syövät olivat korkeammat HSP27 ilmaisun suhteen kuin ne, joilla ei ole etäpesäkkeitä ja alkuvaiheen syöpien (p = 0,03 ja p = 0,009, tässä järjestyksessä). Kaplan-Meier selviytymisen käyrä osoitti NSCLC potilaat, joilla on alhainen HSP27 ilmaus suhde oli huomattavasti parempi elinaika kuin ne, joilla on korkea ilme suhde (p 0,05, Fig. 1). Monimuuttujakalibrointi-oikaistu riskisuhteita laskettiin käyttäen Coxin regressiota ylimääräisiä muuttujia sukupuolen (mies vastaan ​​nainen), ikä (vuotta), etäpesäke, kasvain, ja imusolmuke osallistuminen (taulukko 2). Tekemällä näin, olemme huomanneet, että potilailla, joilla on korkea HSP27 ilme oli 2,30-kertaa suurempi kuolleisuus riski (p = 0,04) kuin potilailla, joilla on alhainen HSP27 ilme.

HSP27 ilmaisun potilaille, joilla on NSCLC

HSP27 ilmentymistä potilailla, joilla on NSCLC analysoitiin (Fig. 2). Immunohistokemiallinen värjäys ja Western blot-analyysi keuhkosyövän kudoksen osoittivat korkeampia HSP27 ilmentymistä keuhkosyövässä kudoksessa kuin normaalissa keuhkokudoksessa (kuvio. 2A-B).

(A) Lung näytteet (keuhkosyöpä ja vastaavat normaali viereinen keuhkokudokset) analysoitiin vasta lämpöshokkiproteiini 27 (HSP27) in immunohistokemiallisella värjäyksellä (DAB värjäys ja hematoksyliinillä counterstaining). Negatiivisia kontrolleja varten, vasta-aine korvattiin kontrolli-lgG. HSP 27 yliekspressoitui NSCLC kudoksen normaalia keuhkokudoksessa. (B) Western blotting-analyysi HSP 27 ilmentymistä NSCLC kudoksessa ja normaalissa kudoksessa. Edustavat tiedot neljästä eri potilasta NSCLC näkyvät (T = kasvain; N = normaali). Ilmentyminen HSP27-proteiinin ilmentyminen oli lisääntynyt NSCLC kudoksessa verrattuna normaaliin keuhkokudoksessa (* p 0,05).

vaikutus EGb761 sytotoksisuuteen ja HSP27 ilmaisun BEAS-2B ja NSCLC solulinjoja (A549 ja H441) B

käsiteltiin 3-solulinjojen (BEAS-2B, A549, ja H441) eri pitoisuuksilla EGb761. MTT-määritystä osoitti, että EGb761 ei ollut sytotoksista vaikutusta näitä 3 solulinjoissa jopa suuremmilla pitoisuuksilla (Kuva. 3A). DNA hajanaisuus määritys osoitti myös, että EGb761 ei aiheuttanut apoptoosia BEAS-2B, A549, ja H441 solulinjoissa eri pitoisuuksilla (Kuva. 3B). HSP27 ilmentymistä A549- ja H441-solulinjoja merkittävästi vähentynyt annoksesta riippuvaisella tavalla kasvua EGb761 pitoisuus, määritettynä Western blot-analyysillä (kuvio. 3C). Kuitenkin HSP27 ilmentyminen normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa (BEAS-2B) ei muuttunut, kun EGb761 pitoisuudet olivat alle 500 ug /ml.

(A) EGb761 ei ollut ilmeisiä sytotoksinen vaikutus keuhkosyövän solulinjoja ( A549 ja H441) ja normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa (BEAS-2B). (B) DNA-fragmentti, testi osoitti EGb761 ei aiheuttanut BEAS-2B, A549 ja H441-solujen apoptoosia. (C) HSP27-mRNA: n /proteiinin ekspressiota BEAS-2B-solut eivät muutu merkittävästi, kun pitoisuudet EGb761 oli alle 500 [0-9] [A-z] ug /ml. Lisäksi HSP27-mRNA: n /proteiinin ekspressiota A549 /H441-solut voidaan pienenivät huomattavasti yhä EGb761 pitoisuus annoksesta riippuvaisella tavalla. Edustavia kuvia kolmen erillisen kokeen. *

P

0,05 vs. kontrolli. Reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena.

vaikutus EGb761 ja HSP27-siRNA transfektio on HSP27 ilmaisun

Transfektoimme A549 /H441-solujen kanssa HSP27-siRNA plasmidiin. HSP27-siRNA plasmiditransfektiolla merkittävästi vähentynyt HSP27 ilmaisun A549 /H441-soluissa, joka vahvistettiin käyttäen reaaliaikaista PCR ja western-blottauksella (Fig. 4A-B). EGb761 oli myös sama vaikutus kuin HSP27-siRNA-transfektiolla vähentää huomattavasti HSP27-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen A549 /H441 (Fig. 4A-B). Vaikka sekä HSP27-siRNA ja EGb761 hoito voi downregulate HSP27 ilmaisua, se ei tarkoita, että on olemassa efektori suhde toisiinsa. Muita tutkimuksia tarvitaan edelleen tutkia tätä suhdetta.

(EN) HSP27 mRNA ilmentyminen A549 /H441-soluissa pieneni EGb761 hoitoon tai HSP27-siRNA transfektio 24 tuntia myöhemmin verrattuna kontrolliryhmään. (B) toinen HSP27-proteiinin ilmentyminen A549 /H441-soluissa oli myös laski EGb761 hoitoon ja HSP27-siRNA transfektio 24 tuntia myöhemmin verrattuna kontrolliryhmään. *

P

0,05 vs. kontrolli. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena. NC-siRNA on negatiivinen kontrolli.

Vaikutukset EGb761 ja HSP27-siRNA transfektion muuttavaa kyky A549 /H441

A549 /H441-soluja käytettiin arvioimaan vaikutusta HSP27 on NSCLC solun leviämiskyky

in vitro

. Cellular muuttoliike analysoitiin haavan tyhjästä määritystä. Verrattuna leviämiskyky kontrolliryhmän, muuttavia aktiivisuus A549 /H441-solujen estyi merkitsevästi jälkeen HSP27-siRNA transfektiota tai EGb761 hoitoon. (P 0,05) (Kuva. 5A-B) B

(A) Cellular muuttoliikettä määritettiin yksikerroksisen paljaaksitulo määrityksen ja analysoitiin Wimasis WimScratch ohjelmisto. Vaeltavien kyky A549 /H441-solujen inhiboitui EGb761 (100 ug /ml) käsittely verrattuna kontrolliryhmään. Hiljentäminen HSP27 ilmentymisen HSP27-siRNA transfektion leviämiskyky pieneni myös A549 /H441. NC-siRNA on negatiivinen kontrolli. Edustavia kuvia kolmen erillisen kokeen. Tiedot ovat kolmen erillisen kokeen. *

P

0,05 vs. kontrolli. Reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena.

Sääntelyn vaikutus EGb761 on HSP27 ilmaisun AKT ja p38 MAPK-reitin

Solunsisäinen signalointi reittejä kuten MAPK ja PI3K /AKT ovat myös tärkeät syövän muuttoliike [31] – [33]. Kuitenkin solunsisäinen sääntely signalointireitteihin välillä EGb761 ja HSP27 ilme ovat vielä epäselviä. Analysoimme ilmentymisen eri reitin proteiinien käsittelyn jälkeen A549 /H441-solujen kanssa eri EGb761 pitoisuuksilla. Ekspression p-AKT ja p-P38 kasvoi merkittävästi, kun EGb761 hoidon verrattuna kontrolliryhmään, ja ilmaus PI3K, ERK, ja JNK ei muutu, kun EGb761 hoidon (Fig. 6A, D) Me käsitellään edelleen A549 /H441 solulinjan AKT-estäjällä (API-59, 3 mmol) ja p38 MAPK estäjä (SB203580, 10 mM). Inhiboivaa vaikutusta EGb761 on HSP27 ilmentyminen esti AKT tai p38 MAPK-estäjän (Fig. 6B, E). Lisäksi siirtyminen kyky A549 /H441-solut talteen myös sen jälkeen, kun AKT tai p38-estäjää, vaikka läsnä EGb761 (Fig. 6C, F). Nämä tulokset viittaavat siihen, EGb761 säännelty HSP27 ilme, todennäköisimmin kautta AKT ja p38 MAPK signalointireittejä.

(A, D) Ilmauksia AKT: /Pakt, P38 /pP38, PI3K /pPI3K, ERK /Perk, JNK /pJNK A549 /H441 analysoitiin western-blottauksella käsittelyn jälkeen EGb761 (100 ug /ml). Ilmaus Pakt ja p-p38 parannettiin EGb761 hoidon merkitsevästi (p 0,05) (B, E). A549 /H441-solujen linja käsiteltiin estäjien AKT (API-59) (3 mM), p38 MAPK (SB203580) (10 mM) 1 tunnin ajan ja EGb761 (100 ug /ml), käsiteltiin myöhemmin. Akt estäjän tai p38-inhibiittori voi estää estävä vaikutus EGb761 in HSP27-proteiinin ilmentymisen. (C, F) Cellular muuttoliikettä määritettiin yksikerroksisen paljaaksitulo määrityksen ja analysoitiin Wimasis WimScratch ohjelmisto. Jossa AKT-estäjällä tai p38-estäjän, solun muuttavia kykyä A549 /H441 ei vaimennettu EGb761. Edustavia kuvia kolmen erillisen kokeen. Tiedot ovat kolmen erillisen kokeen. *

P

0,05 vs. kontrolli. Reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena.

Keskustelu

HSP ovat läsnä molekyyli saattajia läsnä kaikissa elävissä soluissa. Ne suojaavat soluja ympäristön stressi vahinko [34]. Pieni HSP27 on rooli signaalitransduktion, kasvun säätelyssä, kehityksen, erilaistumisen, ja kasvaimen kehittymisen [35]. Lisääntyvää HSP27 on havaittu useita pahanlaatuisia kasvaimia, kuten rintasyöpää [36], paksusuolen syöpä [37], eturauhassyöpä [16], ja keuhkosyöpä [10], [21]. Tutkimuksessamme olemme seulotaan ekspressiota HSP: iden, mukaan lukien Hsp10, HSP27, HSP30, HSP60, HSP70 ja HSP90 NSCLC kudosnäytteistä (tuloksia ei ole esitetty). Vain HSP27 havaittiin yliekspressoituvan NSCLC kudoksessa. Koordinoida potilaan kliinisten parametrien, yliekspressio HSP27 näyttää lisäävän metastaattisen potentiaalin NSCLC ja on huono ennustetekijöiden ennustaja. Esto HSP27 ilmentymisen EGb761 laski muuttavia kykyä NSCLC solulinjoissa.

HSP27 on herättänyt paljon huomiota viime vuosikymmeninä johtuen sen rooli kasvaimen Karsinogeneesin prognoosi-, ennakoivaa, ja hoito vaikutukset [4]. Ruokatorven syöpä, HSP27 ilmaisu pienenee syövän synnyn ja adenokarsinooman mutta lisää aikana syövän synnyn ja levyepiteelikarsinooma karsinoomat [38]. HSP27 ilmentyminen korreloi erottelua ihon [39], kohdun limakalvon [40], ja kohdun syöpiä [41]. HSP27 yliekspressio indusoi myös chemoresistance eturauhassyövässä [42] ja ruokatorven syöpä [43], mutta tehostetun Hoitovasteet pään ja kaulan alueen syöpä [44]. Yhteenvetona rooli HSP27 on vaihteleva ja riippuu eri kasvaintyypeille.

Tutkimuksessamme HSP27 oli huono prognostinen indikaattori potilailla NSCLC säätämisen jälkeen muista tekijöistä. Korkeampi ilmaus suhde HSP27 havaittiin potilailla, joilla oli NSCLC kehittynyt syöpä, joka oli sama kuin raportoitu tutkimuksessa Zimmermann et al. [18]. Seerumin HSP27 taso on hyödyllinen biomerkkiaine erottamaan terveet tupakoitsijoita ja syöpäpotilaiden varhaisen ja pitkälle NSCLC [18]. Kuitenkin raportin Malusecka et al. osoittivat, että HSP27 ilmentyminen olla suotuisa ennustetekijä NSCLC [20]. Alaryhmä analyysi osoitti, että HSP27 säilytti ennustetekijöiden merkitys okasolusyöpä mutta ei adenokarsinooma. Kaksi kolmasosaa potilaista oli okasolusyöpä on Malusecka tutkimuksessa, mutta osuus okasolusyöpä oli vain 27% tutkimukseen. Meidän Alaryhmäanalyysi osoittanut mitään ennustetekijöiden eroa potilailla, joilla adenokarsinooma ja okasolusyöpä. Pieni näyte koot ja heterogeenisuus ovat meidän rajoituksia. Lisäksi muuttavien kyky A549 ja H441

in vitro

pieneni merkitsevästi jälkeen vaientaminen HSP27 ilmaisu, joka vastasi meidän kliininen havainto, että HSP27 ilmentyminen voi lisätä metastaattista potentiaalia. Vaikka HSP27 oli tunnistettu etäpesäke liittyvä proteiini NSCLC [45] – [46], tarkka yhdistyksen välillä HSP27 ja metastaattisen mekanismi vaatii lisätutkimuksia.

Kemoterapia huumeita yleensä vaikuttavat sekä patologisia kasvainsoluja ja normaaleja soluja ja aiheuttaa vakavia komplikaatioita ja toksisuutta. Sisplatiini, tehokas antineoplastinen aine, on tärkein tekijä keuhkosyöpää kemoterapiahoidon. Kuulovamma ja munuaistoksisuuden ovat merkittävät haittavaikutukset sisplatiinin, joka voi aiheuttaa liian suuria vapaiden radikaalien muodostumista [24]. Kautta puhdistusjärjestelmä ja estää vapaiden radikaalien muodostumista, EGb761 voi aiheuttaa suojaavia vaikutuksia sisplatiinin aiheuttamaa toksisuutta. Eräässä kokeessa rotilla, EGb761 vähennetty onnistuneesti sisplatiinin liittyvä myrkyllisyys ilman lieventäviä sen antituumorivaikutus [47]. Reagoimattomuus tai selviytyminen syövän kantasolujen hoidon jälkeen voi olla vastuussa toistumisen ja kestävyys keuhkosyöpään moderniin hoito [48]. HSP27 aktivointi on havaittu solunsalpaajaresistentti keuhkosyövän kantasolun kaltaisia ​​soluja [10]. Tutkimuksemme osoitti, että EGb761 esti HSP27 ilmentymistä NSCLC soluissa. Näin ollen, EGb761 voi olla suuri potentiaali keuhkosyövän hoidossa, koska sillä on estävä vaikutus HSP27 ilmentymisen.

Cellular lämpöisku- vaste kehittyy yleensä nopeasti, mikä liittyy aktivointi suuria signaloinnin transduktioreittejä johon mitogeeniaktivoidut proteiini (MAP) kinaasien, ekstrasellulaarinen signaali säädelty kinaasien (ERK: t), c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK), ja p38 [49]. Nämä signa- keskeisessä roolissa säätelyssä ja määrittämällä solujen kohtaloa kuten kasvuun, erilaistumiseen tai apoptoosiin lukuisissa fysiologisissa sekä stressi olosuhteissa [50]. AKT /PI3K-riippuvaisen signaalintransduktioreitteihin ovat solujen eloonjääntisignaaleja kannustanut kasvutekijöiden, sytokiinien ja onkoproteiineja. Yliaktiivinen AKT /PI3K koulutusjakso voidaan vähentää tuumorisolujen apoptoosin ja lisätä leviämisen [51]. Kuitenkin sääntely suhde HSP27, PI3K /AKT, ja MAP-kinaasin reitit on monimutkainen. Esimerkiksi p38MAPK-MAPKAPK2-HSP27 polku aktivoituu kemoterapiaa agentti ciplastin plus GEMSITABIINI keuhkosyövässä kantasolujen [10]. Sen sijaan, HSP27 indusoi sisplatiini vastus painamalla p38 aktivaation ja parantaa AKT aktivaatio keuhkosyövän soluihin [52]. Tämä ero voi johtua eri solutyyppejä ja tutkimuksen suunnittelu. Guo et ai. osoittivat, että varhainen, ohimenevä aktivoituminen JNK tai p38 MAPK (tai molemmat) on yleensä liittyy solujen eloonjäämistä tai erilaistumista, kun taas myöhässä, jatkuva aktivointi näiden kinaasien yleensä liittyy apoptoosin [53]. Vuonna peräsuolen syöpiä, HSP27 yliekspressio on KRAS mutaatio riippuvainen [54], mutta molemmat A549 ja H441 ovat KRAS-mutaatio solulinjat. Suhdetta KRAS-mutaation ja HSP27 ilmentymistä keuhkosyövässä vaatii lisätutkimuksia. Meidän raportissa EGb761 heikennettyjä HSP27 ilmaisun A549 /H441-solulinjoja aktivoimalla p38 MAPK ja AKT reittejä, mutta ei ERK tai JNK-reitin. Koska yhdistelmä AKT: n ja p38-estäjän hoito voi vähentää solujen elinkelpoisuus, synergiavaikutuksen yhdistelmähoidon ilmentymistä koskevat HSP27 ehkä tarkempaa analyysiä. Lisäksi koska aktivointi (fosforylaatio) tila on epävakaa ja defosforyloinnilla tapahtui nopeasti fysiologisissa olosuhteissa, on vaikea havaita todellista tulokset AKT ja p38 aktivaation

in vivo

matalan HSP27 ilmaisua potilasryhmässä.

Yhteenvetona HSP27 on huono ennustetekijä NSCLC, ja EGb761 on suuret mahdollisuudet käytetään täydentävänä terapian NSCLC johtuen sen estävä vaikutus HSP27 ilme.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvain näytekokoelmatodistuksen

NSCLC ja vastaavat normaaleissa kudoksissa kerättiin 64 potilasta, joille tehtiin kirurginen resektio divisioonassa Torakaaliikirurgia, Department of Surgery, Kaohsiung Medical University Hospital, 2004-2010 . kudosnäytteitä pantiin välittömästi nestetyppeen kuljetusta laboratorioon, ja sitten varastoidaan -80 ° C pakastin, kunnes RNA: n eristys ja proteiinin uuttamalla tehtiin. Täydellinen lavastus menettelyjä, kuten Rintakehän röntgenkuvaus, bronkoskopia, aivot ja rintakehä tietokonetomografia, sonography, ja luun skintigrafialla suoritettiin tarkasti määrittää ominaisuuksien TNM potilailla, joilla on NSCLC mukaan TNM kansainvälisen Välivarastointi System for Keuhkosyöpä [55]. Kaikki potilaat seurattiin vasta maaliskuussa 2011 ja tiedot niiden väestörakenteen ja Eloonjääntitulokset päivitettiin.

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksynyt eettinen Review Board for Research (KMUH-IRB- 990358) on Kaohsiung Medical University Hospital, Kaohsiung, Taiwan. Osallistujat antaa kirjallinen suostumus osallistua tähän tutkimukseen.

RNA ja reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) B

Yhteensä RNA eristettiin pakastetusta keuhkojen kasvain potilaiden kudosten kanssa NSCLC ja vastaavat normaali viereisen keuhkojen kudoksiin. RNA normaalista keuhkokudoksesta, keuhkojen kasvain kudos, ja keuhkosyövän solut analysoitiin käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit ja RNaasi-vapaata DNaasia Set (Qiagen, Valencia, CA, USA). Kokonais-RNA (2 ug) oli käänteistranskriptoitu käyttäen SuperScript ™ ja ensimmäisen-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). 1:05 laimennus saatua cDNA: ta käytettiin standardina, ja 01:10 malli laimentamisen tuloksena cDNA: ta käytettiin standardi määrittää suhteellinen pitoisuus mRNA käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I, Roche, Mannheim, Saksa). Seuraavat alukkeet reaaliaikainen PCR suunniteltiin käyttäen Primer Express -ohjelmiston (RealQuant, Roche, Mannheim, Saksa) käyttämällä julkaistu sekvenssit: ihmisen HSP27 (GenBank: hakunumero: AB020027.1) sense-aluke: 5′-GTC CCA CGA GAT CAC CAT-3 ’, ihmisen HSP27 antisense-aluke: 5′-GGT GGT TGC TTT GAA CTT TAT T-3′, ihmisen GAPDH sense-aluke: 5’-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3 ’, ja GAPDH antisensealuketta: 5’-GCC CAA TAC GAC CAA ATC C-3 ’. Fluoresenssi tiedot hankittiin lopussa laajennus. Sulata analyysi tehtiin kaikkien tuotteiden määrittämiseksi spesifisyyden vahvistusta. Lisäksi, PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesissa 1% agaroosigeeleillä vahvistaa, onko oikea juova koot olivat läsnä. Suhteellinen ilmentyminen laskettiin suhde ilmaisua kasvain verrattuna ilmentymisen normaalissa vieruskudos (korkea lauseke: kasvainleesion /normaali kudos 1, alhainen ilmaus: kasvainleesion /normaali kudos 1) [56] – [57].

immunohistokemiallinen värjäys

Kasvaimen näytteet leikeltiin ihmisen keuhkokudoksesta, kiinnitettiin 4%: n puskuroituun formaliiniliuokseen yön yli, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 um paksuisia. Parafiini kohdat poistettiin parafiini ksyleenillä ja värjättiin anti-ihmis-HSP27 (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) vasta-aine. Sen jälkeen, kun PBS Pesun leikkeitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sillä värireaktiot, diaminobentsidiinillä (DAB) käytettiin ja laskuri värjättiin hematoksyliinillä. Negatiivisia kontrolleja varten, vasta-aine korvattiin kontrolli-lgG.

Western blot-analyysi

Solut lyysattiin hajotuspuskuria [0,5 M NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,05% SDS: ää, 0,5% Triton X-100, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), pH 7,4], 30 min 4 ° C: ssa, ja solulysaatit sentrifugoitiin 4000

g

30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiini supernatanteissa mitattiin käyttäen BioRad-proteiinin määritys (BioRad, Hercules, CA, USA). Supernatantit altistettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (NEN) 1 h huoneen lämpötilassa. Membraanit käsiteltiin sitten PBS: llä, joka sisälsi 0,05% Tween 20 ja 2% rasvatonta maitoa, 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin erikseen hiiren anti-ihmis-HSP27, AKT /Pakt, P38 /pP38, PI3K /pPI3K, ERK /Perk, JNK /pJNK tai α-tubuliinin (Abcam, Cambridge, MA, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa sisäisenä kontrollina. Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla kanin antigoat tai hiiri-IgG huoneenlämpötilassa. Immunodetektio suoritettiin käyttäen kemiluminesenssi reagenssia plus NEN ja altistuminen Biomax MR Film (Kodak, Rochester, NY, USA).

Culture NSCLC-solujen

Lung A549 /H441-solut (ATCC CCL- 185 /ATCC HTB-174) viljeltiin pulloissa F12K kasvualustaan, jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2. BEAS-2B-soluja (ATCC CRL- 9609), jotka ovat normaaleja keuhkoputken epiteelisoluissa, käytettiin kontrollina.

HSP27 hiljentämisen A549 /H441-soluja

Sirna (siRNA), joka on kaksijuosteista 21-nukleotidin RNA-sekvenssi on homologinen kohdegeenin, käytettiin hiljentää HSP27 ilmentymisen. Ihmisen HSP27 siRNA sensealuke: 5′-GCG UGU CCC UGG elokuu UCA ATT-3 ’ja antisense-aluketta: 5′-UUG ACA UCC AGG GAC ACG CGC-3’. SiRNA varten HSP27 ja negatiivisen kontrollin (NC-siRNA) suunniteltiin ja syntetisoitiin tietokoneella ohjelmiston Ambion (Austin, TX, USA) ja äänenvaimennin ™ siRNA rakentaminen Kitin Ambion, mukaan valmistajan ohjeiden. Esto HSP27 mRNA ja proteiinin ilmentyminen arvioitiin käyttäen reaaliaikaista PCR ja immunoblot-analyysi transfektion jälkeen A549 /H441 kanssa HSP27-siRNA. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 6 kuoppiin ja transfektoitiin 20 nM siRNA: lla käyttäen 8 ui SIPORT Amine (Ambion, Austin, TX, USA) on Kokonaistransfektiotilavuus 0,5 ml: aan väliainetta. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 5 h, 1,5 ml normaalin kasvun alustaa lisättiin ja soluja inkuboitiin 48 tuntia.

MTT-määritys solun elinkelpoisuuden

3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT, Sigma, Louis, MO, USA) määritystä käytettiin mittaamaan solun elinkykyä [58]. Periaatteena määrityksessä on, että mitokondrioiden happodehydrogenaasipitoisuus elinkelpoisten solujen vähentää MTT sinistä formatsaania. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 96-kuoppalevyillä ja inkuboidaan eri pitoisuuksilla EGb761. Pesun jälkeen solut kahdesti PBS: llä, 100 ui alustaa, joka sisälsi MTT: tä (0,5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 4 tuntia. Sitten väliaine poistettiin varovasti, jotta ei häiritä formatsaanikiteet muodostuneet kiteet. Seuraava 100 ui DMSO: ta, joka liuottaa formatsaanikiteet, lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja absorbanssi liukoiseksi sininen formatsaani luettiin 540 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Multiskan Ex, ThermoLabsystems), DMSO kuin tyhjä. Vähennys Optisen tiheyden lääkkeitä käytettiin mittaamiseen solujen elinkelpoisuuden, normalisoitu soluja inkuboitiin ohjaus väliaineessa, joka pidettiin 100% elinkelpoisia.

kvantifiointi DNA: n fragmentoituminen

Cellular DNA pirstoutuminen ELISA-määritykset suoritettiin käyttäen mukainen pakkaus valmistajan protokollan (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Saksa). Soluja inkuboitiin 12 tunnin ajan 37 ° C: ssa ei-radioaktiivista tymidiiniä analoginen 5-bromi-2-deoksiuridiini (BrdU), jotka voidaan sisällyttää genomista DNA: ta. Sen jälkeen soluja inkuboitiin kanssa tai ilman EGb761 6 tuntia. Sitten solut hajotettiin, siirrettiin mikrotiitterilevylle, joka on päällystetty anti-DNA-vasta-aineen, ja inkuboitiin 90 min ajan huoneenlämpötilassa. Levy pestiin 3 kertaa ja kuumennettiin 5 min mikroaaltouunissa. Anti-BrdU-peroksidaasikonjugaattia lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyä inkuboitiin 90 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun levy pestiin 3 kertaa, substraattiliuosta lisättiin ja levyä inkuboitiin pimeässä ravistimessa kunnes värin kehittyminen on riittävä. Sitten reaktio pysäytettiin lisäämällä 25 ui 0,56 M H

2SO

4. Mikrolevylukijassa (BioRad, Hercules, CA, USA) käytettiin mittaamaan absorbanssi 450 ja 655 nm kullekin kuopalle.

In vitro

muuttoliike analysoi

vaeltavia kyky soluja määritettiin yksikerroksinen paljaaksitulo määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [59]. Konfluenttien Solut haavoittui raaputtamalla 100 ui pipetin kärki, joka denuded kaistale Yksikerrospaketin joka oli 300 um. Viljelmät pestiin kahdesti PBS: lla; sitten jota on täydennetty 5% FBS: ää lisättiin, ja haavan sulkemisen jälkeen havaittiin 24 h. Solut, jotka muuttivat paljaaksi alueella kuvattiin, ja alueet analysoitiin käyttämällä Wimasis WimScratch ohjelmisto. Wimasis WimScratch on uuden sukupolven web-pohjainen kuva työkalu solujen vaeltamiseen analyysiä. Reunan tunnistus tekniikat voivat helposti tunnistaa etureunan ja aukon alueen. Käyttäjät voivat ladata kuvia ja analysointi alkaa automaattisesti.

EGb761 ja koulutusjakson estäjät

AKT: n ja p38 MAPK-estäjät, API-59 (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) ja SB203580 ( Selleckchem, Radnor, PA, USA), vastaavasti, käytettiin tutkimuksessamme. EGb761 käytetty tutkimuksessamme jatkettiin Dr. Willmar Schwabe GmbH Co, Karlsruhe, (Saksa).

Tilastolliset analyysit

Statistical eroja HSP27 ilmaisun suhteen ja kliinisiä parametrejä testattiin opiskelijan

t

-testi tai yksisuuntaisen varianssianalyysillä (ANOVA). Survival käyrät piirrettiin käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmällä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM.