Krooninen sairaus

tiivistelmä

arkkitehtoninen transkriptiotekijä HMGA2 runsaana ilmaistaan ​​alkionkehityksen aikana. Useissa pahanlaatuinen neoplasioihin kuten eturauhassyöpä, korkea uudelleen ilmentäminen

HMGA2

korreloi pahanlaatuisen ja huonoon ennusteeseen.

let-7

miRNA perhe kuvataan säännellä

HMGA2

negatiivisesti. Tasapaino

let-7

ja

HMGA2

käsitellään olevan tärkeä rooli kasvainten etiologiassa. Analysoida tarkemmin roolin HMGA2 eturauhassyövässä vakaa ja hyvin toistettavissa

in vitro

mallijärjestelmä edellytys. Tässä loimme koira CT1258-EGFP-HMGA2 eturauhassyöpäsolulinja vakaasti yli-ilmentävät HMGA2 liittyy EGFP ja lisäksi viittaus solulinja CT1258-EGFP ilmentävät ainoastaan ​​EGFP jättää EGFP vaikutusten kumoamiseen. Molemmat yhdistelmä-solulinjat ominaista fluoresenssimikroskopialla, virtaussytometrialla ja immunosolukemiallinen. Proliferatiivinen vaikutus ektooppisesti yli-ilmentynyt HMGA2 määritettiin kautta BrdU määrityksissä. Vertaileva karyotyping johdetun ja alkuperäisen CT1258 solulinjojen suoritettiin analysoida kromosomi johdonmukaisuutta. Vaikutus kohdunulkoisen

HMGA2

ilme valvojalleen

let-7a

analysoitiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR. Fluoresenssimikroskopia ja immunosytokemiassa havaittu onnistunut ilmaus EGFP-HMGA2 fuusioproteiini yksinomaan kertyminen tumaan. Geenien ilmentyminen analyysit vahvistivat

HMGA2

yli-ilmentymisen CT1258-EGFP-HMGA2 verrattuna CT1258-EGFP ja natiivi soluja. Huomattavasti suurempi

let-7a

ekspressiotasoja löydettiin CT1258-EGFP-HMGA2 ja CT1258-EGFP. BrdU määritys havainnut lisääntynyt leviämisen CT1258-HMGA2-EGFP solujen verrattuna CT1258-EGFP ja natiivi CT1258. Sytogeneettinen analyysit CT1258-EGFP ja CT1258-EGFP-HMGA2 johti verrattavissa hyperdiploid karyotyyppi kuvatulla natiivi CT1258 soluja. Tutkimiseksi edelleen vaikutuksen yhdistelmä-ilmentynyt HMGA2 on CT1258 soluihin, muut valitut kohteet kuvattu taustalla HMGA2 sääntelyn seulottiin lisäksi. Uusi fluoresoiva CT1258-EGFP-HMGA2 solulinja on stabiili väline, jonka avulla

in vitro

ja

in vivo

analyysit HMGA2 välittämän vaikutuksia soluihin ja kehittämiseen ja eturauhassyövän.

Citation: Willenbrock S, Wagner S, Reimann-Berg N, Moulay M, Hewicker-Trautwein M, Nolte I, et al. (2014) Generation ja karakterisointi koiran EGFP-HMGA2 Eturauhassyöpä

In vitro

Model. PLoS ONE 9 (6): e98788. doi: 10,1371 /journal.pone.0098788

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 17 helmikuu 2014; Hyväksytty: 7. 2014; Julkaistu: 10 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Willenbrock et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Ei kolmas osapuolen varat tukenut tätä tutkimusta. Tutkimus rahoitettiin sisäiseen talousarvioon Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine, Hannover. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Ohessa kirjoittajat vahvistavat, että Jörn Bullerdiek, mukana kirjoittamassa sisällä entinen yhteistyönä julkaisut, on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan.

Johdanto

mukaan viimeaikainen maailmanlaajuinen syövän tilastoja, eturauhasen syöpä on toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä ja kuudenneksi yleisin kuolinsyy uroksia taloudellisesti kehittyneissä maissa [1]. Lisäksi mies, koira on ainoa tunnettu kotieläimenä nisäkäslajeista kehittää spontaani eturauhassyövän huomattavaa kiinnostusta [2].

Toisin kuin miehillä, ilmaantuvuuden koiran eturauhasen karsinoomien on alhainen kirjanpito 0,2 0,6% koiran neoplasioihin [3]. Kuitenkin tauti on paikallisesti invasiivisia molemmilla lajeilla kanssa vertailukelpoinen etenemisen, metastaattisen kuvio ja histopatologia [2], [4].

keskimääräinen ikä diagnoosin koirilla on kymmenen vuotta ja siten, pääasiassa vaikuttaa vanhempi yksilöiden se on myös raportoitu miehillä [5] – [7]. Ottaen huomioon fysiologinen ikä eturauhassyövän diagnoosia, kunkin elinkaari on samankaltainen näiden kahden lajin välillä osoittaa lisääntymistä iän myötä [6].

Ihmisillä eturauhasen syöpä on yleensä melko hitaasti etenee syöpä taas koirien eturauhasen syöpä kasvaa nopeasti, erittäin aggressiivinen ja vähemmän eriytetty esittää huono ennuste [3], [8]. Syöpä koiran eturauhanen on vastetta androgeenireseptorin peruuttamista hoidon muistuttavat lähinnä ihmisen huonosti eriytetty, androgeeni tulenkestävä eturauhassyöpä [4], [9]. Koska yhtäläisyyksiä esittämiseen liittyviä ihmisen ja koiran eturauhassyöpä, koira on viime aikoina keskittynyt niin hyödyllinen luonnollinen täydentävä eläinmalli arvioimiseksi uudet eturauhassyövän hoitomuotoja [10].

varhainen havaitseminen eturauhassyövän miehillä on parhaillaan tehdään käyttämällä vakiintuneita biokemiallisia molekyylipainon markkereita, kuten eturauhasen spesifisen antigeenin (PSA) ja eturauhasen kalvon (PSMA) ja huomattava menestys.

verrattuna tilanteeseen ihmisillä, koirilla eturauhassyöpä diagnosoidaan myöhäisessä taudin vaiheessa puuttumisen vuoksi luotettavien prostataspesifisen biokemiallinen prognostisia markkeri työkaluja ja hoito pysyy lievittävä koska vielä ei ole standardia terapeuttinen lähestymistapa hoitoon koirien eturauhasen syöpä on saatavilla [11], [12]. Vaikka useat tutkimukset raportoivat immunoreaktiivisuus ihmisen PSA koiran ei-neoplastisia eturauhasessa ja eturauhasen syöpä, tähän asti PSA ei löydy plasmassa eturauhassyövän varustettujen koirien [9], [12] – [16].

Tämän vuoksi tunnistaminen luotettavasti molekyylien biomarkkereiden kuten PSA ja PSMA miehillä, jolloin varhaisen havaitsemisen ja luotettava ennuste koiran eturauhassyövän olisi merkittävää hyötyä tulevaisuudessa kehittämistä ja arviointia hoitostrategioita sekä arviointiin hoitovasteen [2].

tässä yhteydessä korkean Mobility-ryhmän proteiini A2 (HMGA2) hiljattain havaittu toimivan mahdollisesti ennustetyövälineenä markkeri koirien eturauhasen neoplasioiden [17]. Tässä analyysissä osajoukon eri koiran eturauhasen kudosnäytteitä osoittivat selvästi, että ilmaus

HMGA2

lisääntyy huomattavasti korrelaatio malign arvosana kudosnäytteiden [17]. Lisäksi

HMGA2

havaittiin toimia mahdollisena differentiaatiomarkkeri koirien pahanlaatuisten T- ja B-solujen lymfooma [18] ja voimakkaasti yliaktiivista koiran suun okasolusyöpä (julkaisematon data).

ihmisillä uudelleen ilmaus

HMGA2

myös löytyy eri pahanlaatuisia kasvaimia, kuten leukemiaa [19], [20], lymfooma [18], rintarauhasen [21], haima [22] ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, [23], suun levyepiteelisyöpä [24], ja kilpirauhasen karsinooma [25] on indikaattori huonoon ennusteeseen. Tuoreessa tutkimuksessa HMGA2 proteiinin ilmentymistä osoitettiin olevan merkittävästi korkeampi kasvaimen kudoksissa verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa [26]. Lisäksi

HMGA2

osallistumista induktion epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) ihmisen eturauhassyövän solulinja PC-3 havaittiin [26].

Nämä havainnot viittaavat siihen, että HMGA2 on keskeinen rooli eri kasvaimen yksiköiden lukien eturauhassyöpä kuluessa molemmat lajit tukee voimakkaasti

HMGA2

uudelleen ilmentymisen ennustetyövälineenä tuumorimarkkeri.

yleensä hyvin säilyneitä HMGA2 proteiini on täysin ilmaisi alkionkehityksen aikana toimiva arkkitehtoninen transkriptiotekijä tumassa [27], [28]. Tässä roolissa, HMGA2 on laajalti raportoitu olevan mukana erilaisissa solun prosesseja, kuten geeni-ilmentymisen induktio neoplastisen transformaation, ja edistäminen etäpesäkkeiden [29], [30].

ilmentymisen

HMGA2

säädellään kautta mikro-RNA: t (miRNA) on

let-7

perheen sitoutumalla sekvenssit sijaitsevat 3’alue (UTR) transkriptin [31] – [35], jotka kaikki ovat konservoituneita jyrsijöillä, koira, ja kana [36] – [38]. Sitoutuminen

let-7

miRNA on komplementtijaksoja säätelee transkription jälkeen ilmaus

HMGA

2 negatiivisella tavalla [31], [35], [39], [40]. Äskettäin vapautetuilla

let-7

ilmentyminen liittyi keuhkojen [41], [42], rintojen [43] ja eturauhassyövän [44].

Koirien eturauhasen adenokarsinooman solulinjaa CT1258 [45] – [47] käytetään tässä tutkimuksessa analysoitiin myös

HMGA2

merkki ilmentymisen meille paljastamalla voimakas yliekspressio (julkaisematon data). Tämä tulos mahdollistaa oletuksia, että yli-tavoitteen geeni on todennäköisesti tärkeä rooli koiran eturauhassyöpä, edistää leviämisen syöpäsoluja.

Voit tarkistaa tämän hypoteesin, saatavuus vakaa työkalujen avulla arvioidaan kuvattu

HMGA2

–

let-7

akseli eturauhassyövässä

in vitro

ja

in vivo

on edellytys. Siksi loimme stabiilisti transfektoituja solulinjoja of CT1258 tarjoaa luotettavan

in vitro

järjestelmässä analysoida keskeisiä näkökohtia hypoteesia.

Analysoimme proliferatiiviset vaikutukset ilmentyy runsaana rekombinantin

HMGA2

on CT1258 soluissa. Näin ollen vakaa CT1258 solulinjaa, joka ekspressoi rekombinantti-EGFP-merkitty HMGA2 (CT1258-EGFP-HMGA2) tuotettiin käyttämällä ekspressiovektoria konstrukti, joka sisältää koodaavan sekvenssin (CDS) koiraeläin

HMGA2

geenin, josta puuttuu 5′-UTR ja 3’UTR ja näin ollen taustalla suoraa negatiivisen säätelyn mekanismeja

anna-7

[31].

arvioimiseksi toiminnallisuus rekombinantti HMGA2 ekspressiovektoriin ja seurata biologista aktiivisuutta rekombinantti ilmaistuna HMGA2, GFP-tag lisättiin

HMGA2

CDS muodostetaan HMGA2-GFP-fuusioproteiinin. Jos haluat jättää että GFP-proteiinia on vaikutusta soluproliferaatioon, vielä vakaa CT1258 solulinja (CT1258-EGFP) ilmentävien ainoastaan ​​GFP luotiin.

HMGA2

ja

let-7a

ilmentyminen määritettiin kautta kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR CT1258-EGFP-HMGA2 ja CT1258-EGFP verrattuna alkuperäiseen CT1258 soluihin.

Lisäksi ilmaus valitun suoran ja epäsuoran HMGA2-tavoitteita, kuten

HMGA1

[48],

SNAI1

[49],

SNAI2

ja

CDH1

[49], analysoitiin.

karakterisoimiseksi leviämisen kuvattujen kolmen solulinjat, BrdU määritykset suoritettiin. Vertaileva karyotype analyysit juuri muodostettujen ja alkuperäisen CT1258 solulinjat lisäksi suorittaa tunnistamiseksi sytogeneettisten muutoksiin mahdollisesti ilmaantuvat plasmidin integraatiota genomiin CT1258 aikana perustetaan vakaa yhdistelmä-solulinjoista.

Yhteenvetona uusi loisteputki canine CT1258-EGFP-HMGA2 solulinja tarjoaa arvokkaan työkalun lisätutkimuksia HMGA2 välittämän proliferatiivisia vaikutuksia ja HMGA2 sääntelymekanismit valaisemaan kehittämistä ja patogeneesi koira eturauhassyöpää. Koska koira on ainutlaatuinen luonnollinen malli ihmisen eturauhassyövän, oivalluksia, jotka koskevat osallistumista HMGA2 koiran eturauhassyövän antaa hyötyä molemmille, ihmisille ja koirille, jotka koskevat terapeuttisten strategioiden kehittämisen ja arvioinnin hoidon onnistumisen.

Methods

CT1258 Cell line

soluviljelmässä olosuhteissa, sekä ominaisuudet koiran eturauhasen karsinoomasolulinja CT1258 on kuvattu aikaisemmin meille [45], [46 ].

pEGFP-C1-

HMGA2

ekspressioplasmidin

proteiinia koodaava sekvenssi koiran

HMGA2

monistettiin PCR: llä käyttämällä alukeparia EcoRI_sA2_lo ( 5′-CGGAATTCCTAGTCCTCTTCGGCAGACT-3 ’), BamHI_sA2_Up (5′-CGGGATCCCACCATGAGCGCACGCGGT-3’). Saatu PCR-tuotteet erotettiin 1,5% agaroosigeelillä, talteen QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Saksa), liitettiin pEGFP-C1-vektoriin plasmidin (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, USA) ja sekvensoitiin varmistus. Transfektio pEGFP-C1-

HMGA2

rakentaa johtimet takaisin rekombinanttisen EGFP-HMGA2 fuusioproteiini, joka on tarkoitus tumassa.

Generation of loisteputki CT1258 Cell Lines

transfektio CT1258 soluja.

300000 natiivi CT1258-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen transfektiota ja viljeltiin vakio-olosuhteissa käyttäen väliaineessa 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Saksa), johon oli lisätty 10% FCS (PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Saksa), ja 2% penisilliini /streptomysiiniä (Biochrom AG, Berliini, Saksa).

transfektio suoritettiin valmistajan ohjeiden avulla 7,5 ui Mirus TransIT-2020 reagenssia (Mirusbio LLC, Madison, WI, USA) 250 ul: ssa seerumin vähennetty Opti-MEM I-alustassa (Life Technologies, Darmstadt, Saksa), joka sisälsi 2,5 ug pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, USA), tai rekombinantti pEGFPC1-HMGA2 plasmidi. Käsittelyn jälkeen soluja inkuboitiin 24 tuntia viljelyalustassa. Ottoa ja ilmentymistä DNA varmistettiin fluoresenssimikroskopialla käyttämällä Leica DMI 6000B fluoresenssimikroskooppia (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Saksa).

G418 valikoiva antibiootti tappaa käyrän määritystä.

Ennen sukupolven fluoresoiva CT1258 solulinjat, titraus oikea määrä valikoivaa antibioottia G418 (syn. Geneticin, Life Technologies, Darmstadt, Saksa), joita tarvitaan valinnan CT1258 solujen suoritettiin tappaa käyrän määritys. Eri G418-pitoisuudet sovellettu (0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ug /ml) on 100000 natiivin CT1258 soluja ympättiin kuoppiin 12-kuoppalevyllä. Valintaan positiivisten solujen transfektion jälkeen pitoisuus on käytetty, jossa ei ole solujen selvisi ylemmän olosuhteissa seitsemän päivän kuluttua.

valinta positiivisesti transfektoitujen CT1258 soluja.

fluoresoiva variantit solulinjan CT1258 oli perustettu ekspressoivat konstitutiivisesti tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP), jota koodaa tyhjä pEGFP-C1-plasmidi ja EGFP-HMGA2 fuusioproteiinin ilmentyminen yhdistelmä-pEGFP-C1-

HMGA2

plasmidi. Luoda vakaa CT1258 solulinjat, transfektoidut solut valittiin G418-antibioottia (Life Technologies, Darmstadt, Saksa).

Aluksi pitoisuutena 400 ug /ml G418: aa keskipitkällä käytettiin valittaessa vakaa solut. Yksi päivä transfektion jälkeen kasvatusliuoksesta 199 korvattiin väliaineen 199, joka sisältää G418: aa. Tämän jälkeen valinta väliaine vaihdettiin jokaisen 24-48 tunnin kahden ensimmäisen viikon aikana, joka johtaa solujen valinnan, jotka ovat stabiilisti sisällyttää GFP-plasmidin kanssa koodatun antibioottiresistenssigeenin neomysiinille valintaa varten nisäkässoluissa niiden genomisen DNA: n. Solut eivät ilmentävät konstrukti tappaa G418. Pitoisuus G418 alennettiin 300 ug /ml kolmen kuukauden johdonmukainen valinta ylläpidosta syntyy fluoresoivien solulinjoissa.

fluoresenssimikroskopia ja virtaussytometria (FCM) B

GFP ekspression loisteputki solulinjoja CT1258-EGFP ja CT258-EGFP-HMGA2 analysoitiin jälkeen G418-valinnan fluoresenssimikroskopialla ja määrällisesti FACSCalibur -virtaussytometriä (Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Saksa) ja FL-1 kanava määrittää prosenttiosuuden GFP-positiiviset solut. Solut trypsinoitiin 3-5 min, resuspendoitiin BD FACSFlow Tuppi Fluid (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA), joka sisältää 1 uM TO-PRO-3 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Saksa), ja sellaisena kokonaismäärä 1 x 10

4 tapahtumaa mitattiin kunkin näytteen virtaussytometrialla. TO-PRO-3 on pitkälle punasolujen läpäisemätön nukleiinihappo tahra mitattuna FL-4-kanavainen mahdollistaa ultraherkät havaitsemisen kaksijuosteisen DNA kuolleita soluja. Analyysi virtaussytometrialla data tehtiin käyttäen kanssa Cell Quest -ohjelmistoa (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA).

Immunosytokemia

upottaminen solulinjoista.

Solususpensioita viljeltyjen solulinjojen fiksoitiin 4% formaliiniin. Solusakat saatiin sentrifugoimalla upotettiin parafiiniin ja leikattiin 3-4 um viipaleita immunosytokemiallisessa värjäystä.

immunosytokemi- värjäystä.

antigeeni haku, mikroaltolämmityksen parafiinileikkeillä 0,01 M sitruunahapolla (pH 6,0 20 min) (Quartett, Berliini, Saksa) suoritettiin. Inhibitiota endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus saatiin aikaan upottamalla 0,5% H

2O

2 (v /v) metanolissa (20 min). Tyhjentämisen jälkeen esto seerumin leikkeitä inkuboitiin polyklonaalisella vuohen anti-ihmisen HMGA2-vasta-ainetta (R 0,001.

Kromosomipreparaatti

kromosomi valmistamiseksi CT1258-EGFP ja CT1258- EGFP-HMGA2 solujen Kolkisiinia (Biochrom AG, Berliini, Saksa) lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 0,1 ug /ml 90 minuutin ajan ennen sadonkorjuuta. Sen jälkeen soluja inkuboitiin 20 min hypotoninen väliaineessa (1: 6, medium 199: H

2O; (medium 199: Life Technologies GmbH, Darmstadt, Saksa)) ja lopuksi kiinnitetään metanoli /jääetikkahapossa (3 :1) seuraavat rutiinimenetelmien [51]. Suspensio tiputettiin jääkylmällä dioja ja kuivattiin 5 päivää 37 ° C, minkä jälkeen GTG-ryhmittelyä, joka suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [52]. Tulokset käsiteltiin ja tallennettiin BandView, 6.0, monilajikalastusta, Applied Spectral Imaging, Israel. Karyotype kuvaus seuraa ehdotetun nimikkeistön Reimannin et al. [53].

Tulokset

fluoresenssimikroskopia ja FCM

Fluoresenssimikroskopia.

CT258 transfektoitujen solujen ei-rekombinantti pEGFP-C1 ekspressiovektorin osoitti vihreä fluoresenssi ympäri sytoplasmaan johtuen EGFP ilmentymisen (Fig. 1 B), kun taas modifioimaton luontainen CT1258 solut eivät osoittaneet EGFP fluoresenssia (kuvio. 1A).

V: lähetty valo kuva ominainen kasvumalli natiivin CT1258 solujen . B: Yhdistetty kuva EGFP ilmentävien CT1258-EGFP soluissa; EGFP on lokalisoitu sytoplasmassa. C: Yhdistetty kuva CT1258-EGFP-HMGA2 solut, jotka ilmentävät ydin- lokalisoitu EGFP-HMGA2 fuusioproteiinin. D-F: Flow rianalyysit EGFP ilmaisun kolmessa CT1258 solulinjat kuvataan dot-tonttien osoittaa sivusirontavirtaussytometriaa (SSC) vs. EGFP fluoresenssi. GFP-fluoresenssi on havaittavissa natiivi CT1258 soluissa (D), 84,1% EGFP-positiiviset solut ovat läsnä CT1258-EGFP-solulinjan ja (F) 97,0% EGFP-positiivisten solujen CT1258-EGFP-HMGA2. Näytettä kohti 1 x 10

4 tapahtumaa analysoitiin.

transfektio CT1258 kanssa pEGFPC1-HMGA2 johti rekombinanttisen canine EGFP-HMGA2 fuusioproteiini, joka voi ainoastaan ​​havaita tumaan transfektoitujen solujen (Fig. 1 C).

FCM.

määrittämiseksi EGFP-positiivisten solujen FCM, sekä fluoresoivat solulinjoja verrattiin natiivin ei-transfektoituja CT1258 solut (Fig. 1 D ). Dead, TO-PRO-3-positiiviset solut poistettiin avaintamalla ennen EGFP positiivisuutta analyysi. Solut mitattiin CT1258 on 319th passage, sillä CT1258-EGFP in 27. passage, ja CT1258-EGFP-HMGA2 in 113. passage.

elinvoima solulinjojen vaihteli 85%: sta 93 % (tuloksia ei ole esitetty). Keskiarvonilmaisimella osuus 84,1% EGFP positiivisia soluja koko solupopulaation G418 valitun CT1258-EGFP-solulinjassa (kuvio. 1 E) ja 97,0% EGFP-positiivisia soluja varten CT1258-EGFP-HMGA2 solulinja (Fig. 1 F) määritettiin .

Immunosytokemia

Noin 50% CT1258-EGFP solulinjassa oli ydinvoiman merkinnät HMGA2 (Fig. 2B). Noin 70-80% CT1258-EGFP-HMGA2 solujen vahva merkinnät HMGA2 havaittiin, joka oli yksinomaan läsnä tumassa (Fig. 2C).

V: Native CT1258 solut, B: CT1258-EGFP solut, C: CT1258-EGFP-HMGA2 soluja. Noin 50% natiivin CT1258 solulinjan ja CT1258-EGFP solut osoittivat HMGA2-positiivinen ydinvoiman merkintöjä. Noin 70-80% CT1258-EGFP-HMGA2 soluja, vahva ja yksinomaan ydinvoiman merkinnät HMGA2 oli havaittavissa.

Suhteellinen

HMGA2

Reaaliaikainen PCR Expression analyysi

Kaikki reaaliaikaiset PCR tulokset analysoitiin perustuen ΔΔCT menetelmällä. Ilmaisu suhde

HMGA2

mRNA CT1258-EGFP-solujen havaittiin olevan 0,88 /0,92 suhteessa

HPRT1 /GUSB

ilmaisu verrattuna tasoon nähdään kotimainen CT1258 soluissa (Fig. 3 ). Sen sijaan,

HMGA2

ilmentymisen CT1258-EGFP-HMGA2 soluissa oli 7,0 /8,0 kertaisesti lisääntynyt (suhteessa

HPRT1 /GUSB

) verrattuna vastaavaan ilmentymisen natiivi CT1258-soluissa (kuvio . 3).

Suhteellinen

HMGA2 /HPRT1

ja

HMGA2 /GUSB

ilmaisun natiivi CT1258, CT1258-EGFP ja CT1258-HMGA2-EGFP soluissa. Virhe palkit ovat keskihajonnat. * P≤0.05 osoittaa tilastollinen merkittävä ilmaus vapautuminen

HMGA2

in CT1258-HMGA2-EGFP soluissa kuin natiivi CT1258.

Suhteellinen

Anna-7a

reaaliaikainen PCR Expression Analysis

let-7a

ekspressiotaso CT1258-EGFP ja CT1258-EGFP-HMGA2 soluissa oli 2,0 ja 3,1 kertaa korkeampi (suhteessa

RNU6B

) verrattuna havaittiin ekspression natiivi CT1258 soluissa (Fig. 4).

Suhteellinen

anna-7a

/RNU6B ilmentymisen natiivi CT1258, CT1258-EGFP ja CT1258-HMGA2-EGFP solut. Virhe palkit ovat keskihajonnat. Ei tilastollinen merkitsevyys ilmentymisen vapauttaminen

let-7a

in CT1258-EGFP ja CT1258-HMGA2-EGFP havaittiin, kun verrattiin natiivin CT1258 soluihin. Tilastollinen merkitsevä p arvo määriteltiin ≤0.05.

Suhteellinen

HMGA1

Reaaliaikainen PCR Expression Analysis

HMGA1

taso oli 1,5 ja 1,7-kertaisesti lisääntynyt (suhteessa

HPRT1

ja

GUSB

) in CT1258-EGFP-HMGA2. In CT1258-EGFP-solujen vastaavan lisääntynyt ilmentyminen ei voitu havaita (1,0 /1,0 suhteessa

HPRT1

ja

GUSB

) verrattuna natiiviin solut (Fig. 5).

Suhteellinen

HMGA1 /HPRT1

ja

HMGA1 /GUSB

ilmaisun natiivi CT1258, CT1258-EGFP ja CT1258-HMGA2-EGFP soluissa. Virhe palkit ovat keskihajonnat. * P≤0.05 osoittaa tilastollinen merkitsevyys voimistunutta ilmentymistä

HMGA1

in CT1258-HMGA2-EGFP-soluja verrattuna natiivin CT1258 ja CT1258-EGFP.

Suhteellinen

SNAI1, SNAI2

ja

CDH1

Reaaliaikainen PCR Expression Analysis

Suhteellinen

SNAI1

ilmentää taloudenhoito geenien

HPRT1 /GUSB

havaittiin olevan 0,8 /0,8 vastaavasti CT1258-EGFP ja 1 /1,2 vuonna CT1258-EGFP-HMGA2 verrattuna natiivi soluihin CT1258 (kuva S1).

suhteellinen

SNAI2

lauseke (suhteessa

HPRT1 /GUSB

) todettiin 1,5 /1,6 in CT1258-EGFP-soluissa ja 1,4 /1,6 in CT1258-EGFP-HMGA2 soluja verrattuna CT1258 (kuva S2).

CDH1

oli tuskin ilmaistu kaikissa solulinjoissa Ct-arvot suurempia kuin 36, mikä analyysin mukaan ΔΔCT menetelmällä ei ollut mahdollista.

Reaaliaikainen PCR tilastollinen analyysi

hypoteesitestin suhteellisen reaaliaikaisia ​​PCR-tuloksiin suoritettiin käyttäen REST työkalu 2009 versio 2.0.13 (Qiagen, Hilden, Saksa) [50]. Tilastolliset analyysit tehtiin erikseen CT1258-EGFP ja CT1258-EGFP-HMGA2 soluja verrattuna alkuperäiseen CT1258.